SDS-МЕТОД (метод выделения ДНК с использованием додецилсульфат натрия) [12]

Растворы для выделения:

• * Экстракционный буфер: 0.1 M Tris (pH 8.0), 0.05 M EDTA (pH 8.0), 0.5 M NaCl, и 0.01 M B-меркаптоэтанол;
• * 5 M ацетат калия;
• * Изопропанол;
• * 20% додецилсульфат натрия (SDS);
• * Поливинилполипирролидона (PVP) (Sigma, P6755);
• * 70% этанол;
• * TE-буфер: 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0) и 1 мМ EDTA (pH 8,0). Раствор проавтоклавировать.

Протокол выделения.

• 1) К размолотому в жидком азоте растительному материалу добавить 1000 мл экстракционного буфера и 100 мкл 20% SDS.
• 2) Инкубировать при 65° C от 30 мин.
• 3) Добавить 500 мкл раствора 5 M ацетат калия и перемешивать в течение 5 мин.
• 4) Инкубировать при 4° C от 30 мин.
• 5) Отцентрифугировать при 12 000 оборотах 3 мин. при 4° C и комнатной температуре.
• 6) Перенести верхнюю фазу в новую пробирку.
• 7) Добавить 1000 мкл холодного изопропанола.
• 8) Собрать выпавший белый осадок крюком и перенести в новую пробирку.
• 9) Промыть осадок 700 мкл холодным 70% спиртом.
• 10) Отцентрифугировать при 12 000 оборотах в течение 10 сек.
• 11) Удалить супернатант аккуратно.
• 12) Высушить в течение 37° C 3 мин. и перевернуть пробирки для легкого высушивания.
• 13) Растворить белый осадок в 50 мкл TE.
• 14) Инкубировать 37° C в течение 15 мин.
• 15) Отцентрифугировать при максимальных оборотах в течение 1 мин. и перенести супернатант в новую пробирку.
• 16) Определить качество ДНК на спектрофотометре при длине волны A260.
• 17) Положить при -70° C на длительный период хранения и -20° C на короткий период хранения.