Проведение современных гистологических секционных исследований на примере деятельности КУ НАО «Бюро судебно-медицинской экспертизы

Они основаны на специфическом связывании красителей с определенными химическими соединениями (например, РНК и ДНК) или образовании окрашенных продуктов из неокрашенных в участке расположения искомого вещества (например, фермента) в результате гистохимической реакции его выявления. Материал, предназначенный для изучения гистохимическими методами, следует фиксировать способом, максимально сохраняющим выявляемое вещество; предпочтительно в этих целях использовать замороженный нефиксированный материал. Методами гистохимии изучают распределение и оценивают содержание в клетках и неклеточных компонентах тканей веществ, относящихся к различным группам — ДНК и РНК, белков, аминокислот, липидов, углеводов, минеральных веществ, оценивают активность ферментов.

ШИКили (PAS)-реакция — пример одною из наиболее широко используемых гистохимических методов. Название метода происходит от сокращения термина Шиффа (реактив) — Йодная Кислота (по англ. Periodic Acid Setoff). Метод используется для выявления соединений, богатых углеводными группами — гликогена, гликопротеинов, мукопротеинов, протеогликанов и др. Он основан на окислении йодной кислотой гидроксильных групп сахаров до альдегидных, с которыми связывается бесцветный реактив Шиффа (содержащий фуксин), превращаясь в стабильное соединение красного цвета [9].

4.

5. Иммуногистохимические методы исследования Иммуногистохимические методы обеспечивают наиболее специфическое выявление веществ в клетках и тканях. Они основаны на обработке мазков или срезов маркированными специфическими антителами к выявляемому веществу, которое служит антигеном [5].

При использовании прямого метода происходит реакция специфическою связывания маркированных антител непосредственно с искомым веществом. При непрямом (более чувствительном) методе немаркированные первичные антитела взаимодействуют с искомым антигеном, а далее их выявляют с помощью вторичных меченых антител (для которых первичные служат антигенами). Маркировка антител производится путем их конъюгации с флюоресцентными красителями (родамином, флюоресценном), ферментами (пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой, которые далее выявляются цитохимически) или электронно-плотными частицами (ферритином) [2].

Очевидно, что фиксация и проводка материала должны обеспечить сохранность искомого вещества. С помощью описанных методов произ-водится идентификация клеток различных типов по их маркерным признакам, выявляются гормоны и их рецепторы.

Таким образом, гистологический метод исследования является одним из наиболее доступных, рациональных методов, позволяющих более точно и достоверно решать многие вопросы при проведении исследований и экспертиз трупов.

Глава 5. Практическая часть

5.

1. Анализ деятельности КУ НАО «Бюро судебно-медицинской экспертизы»

В структуре КУ НАО «Бюро судебно-медицинской экспертизы» имеется отдел судебно-медицинской экспертизы трупов, в том числе одно судебно-гистологическое отделение. Так же есть отдел судебно-медицинской экспертизы потерпевших, обвиняемых и других лиц и отдел судебномедицинской экспертизы вещественных доказательств, состоящий из следующих отделений: судебно-химическое, судебно-биологическое и медицинской криминалистики.

Проведём анализ деятельности судебно-гистологического отделения.

В отделении работают три врача и 4 лаборанта. Проводимые судебно-гистологические исследования помогают решать вопросы, используя данные микроморфологической картины представленного биологического материала. В отделении используется биологический материал (кусочки внутренних органов и тканей), направленный из морга.

В отделении проводятся исследования, помогающие судебно-медицинским экспертам конкретизировать причины смерти, установить характер и стадии патологического процесса, определить прижизненность и давность образования повреждений, установить мертво или живорождённость, зрелость новорождённых.

По итогам работы за 2013 год нами отмечено превалирование случаев ненасильственной смерти по сравнению с насильственной — 1174 против 1302 соответственно. В целом, распределение категорий смерти в 2013 году выглядит следующим образом (рис. 9):

Рис. 9. Распределение категорий смерти в 2013 году по данным КУ НАО «Бюро судебно-медицинской экспертизы»

При этом тенденция к неуклонному росту случаев ненасильственной смерти отмечается на протяжении уже нескольких лет, о чём мы можем судить по данным КУ НАО «Бюро судебно-медицинской экспертизы» в период с 2011 по 2013гг (рис. 10).

Рис. 10. Динамика встречаемости случаев насильственной и ненасильственной смерти за период 2011;2013гг. по данным КУ НАО «Бюро судебно-медицинской экспертизы»

Среднее количество объектов (кусочков органов и тканей), направленных от одной аутопсии на судебно-гистологическое исследование по сравнению с предыдущим годом несколько увеличилось и составило в истекшем году 15,5 объекта. (2012 г. — 15,3; 2011 г. — 15,1).

Важными показателями деятельности судебно-гистологических отделений являются сроки проведения исследований. В КУ НАО «Бюро судебно-медицинской экспертизы» в течение 14 дней проводится наибольшее количество исследований — 96%. При этом средний срок проведения судебно-гистологических исследований составляет около 4−7 суток.

Рассматривая показатели работы КУ НАО «Бюро судебно-медицинской экспертизы» в 2011;2013 гг., касающиеся сроков исследования, мы наблюдаем значительную положительную динамику (рис. 11):

Рис. 11. Динамика сроков работы КУ НАО «Бюро судебно-медицинской экспертизы» в 2011;2013 гг.

В 2013 году уровень гистологической верификации судебно-медицинских исследований достиг 92% от общего количества случаев смерти.

Объективизация судебно-гистологических заключений в значительной мере способствует применение специальных видов окрасок и дополнительных методов исследования. В КУ НАО «Бюро судебно-медицинской экспертизы» используются 10 видов окрасок.

Применение комплекса дополнительных исследований и специальных окрасок значительно расширяет круг вопросов, решаемых экспертами.

Таким образом, анализ деятельности судебно-гистологического отдела КУ НАО «Бюро судебно-медицинской экспертизы» показал, что в динамике его работы отмечается улучшение показателей, что выражается в увеличении среднего количества объектов, уменьшении сроков исследования.

5.

2. Исследование сердца от момента взятия материала для исследования до изготовления гистологического препарата.

Особенности взятия материала для изготовления гистологического препарата зависят от метода исследования.

Для микроскопического исследования необходимо тщательно и аккуратно вырезать кусочки сердца острым ножом или бритвой (не ножницами), не разминая и не сдавливая их руками или пинцетом. Размер кусочков должен быть величиной 1*2*3 см.

Вырезание кусочков для фиксации является одним из ответственных этапов в приготовлении качественных микропрепаратов. При взятии материала нужно помнить, что для исследования лучше взять лишнее, чем что-либо упустить.

Зачастую образцы для гистологического исследования получают из различных типографических областей сердца, ориентируясь на микроскопические изменения. В случаях минимально выраженных патологических проявлений в миокарде информативность результатов может быть достигнута за счёт унифицированного набора материала [1].

В частности, примером такого подхода является изъятие 10 проб сердца из конкретных участков левого и правого желудочков, а так же из межжелудочковой перегородки. На его основе проведено сравнение и разработана дифференциальная диагностика ишемической болезни сердца и его ушибов. Однако, несмотря на высокую информативность этого метода, его применение на практике трудоёмко.

Мы рекомендуем ограничиться набором материала из 5 топографических областей левого желудочка и межжелудочковой перегородки по унифицированной методике. Для гистологического исследования следует вырезать кусочки миокарда из межжелудочковой перегородки, передней, боковой и задней стенок на уровне середины расстояния между верхушкой и митральным клапаном, а так же из верхушки. Из правого желудочка следует дополнительно изъять 3 кусочка из передней, боковой и задней стенок на середине расстояния между верхушкой и трёхстворчатым клапаном.

Данная методика в практическом применении имеет ряд преимуществ: учитывает различные типы кровоснабжения сердца, позволяет исследовать все отделы левого желудочка.

После того, как мы изъяли образцы тканей, не обмывая водой, их следует в фиксирующую жидкость, которую нужно брать в избытке — объем ее должен раз в 20 превышать объем исследуемых кусочков, кроме того, фиксатор должен иметь доступ к фиксируемому материалу со всех сторон. Следует помнить, что продолжительность фиксации зависит от свойств фиксатора, прежде всего от скорости проникновения фиксатора в ткань и различные фиксаторы сохраняют различные структурные и химические компоненты клетки. Именно поэтому, для фиксации тканей сердца можно использовать раствор 10% нейтрального формалина в течение 24ч. После удаления препарата из формалина его следует промыть в проточной воде 15−20 мин для удаления избытка фиксатора.

Для обезвоживания тканей сердца используются спиртовые растворы. Учитывая, что в лабораториях объемы этанола жестко нормированы, а при большом потоке материала требуются большое количество спирта для обеспечения хорошего обезвоживания и дальнейшей пропитки парафином, в качестве заменителя этанола рекомендуется использовать изопропанол.

Согласно Хаузеру, ткани можно переносить в парафин непосредственно из изопропилового спирта или из подогретой (50°С) смеси парафина с изопропиловым спиртом. Следовательно, при использовании проводки на основе изопропанола прекращается использование ксилола, хлороформа и других промежуточных сред, что значительно упрощает и удешевляет процесс. Для избежания появления артефактов после такой проводки (слабое расслоение коллагеновой ткани и небольшие изменения жировой ткани) по сравнению с классической проводкой через этиловые спирты с использованием промежуточных сред, в изопропиловый спирт рекомендуют добавлять небольшое количество неионогенных поверхностно активных веществ (например, Тритон Х15 (октилфеноксиполиэтоксиэтанол)).

Схема изопропанольной проводки

1. 50%-ный водный раствор изопропилового спирта — 1 час

2. Абсолютированный изопропанол — 30 мин

3. Абсолютированный изопропанол — 30 мин

4. Абсолютированный изопропанол — 30 мин

5. Абсолютированный изопропанол — 1 час

6. Абсолютированный изопропанол — 1 час

7. Абсолютированный изопропанол — 2 час

8. Абсолютированный изопропанол — 3 час

9. Абсолютированный изопропанол — 3 час.

10. Парафин — 1 час

11. Парафин — 3 час

12. Парафин — 4 час Для того чтобы их получить, кусочки тканей надо пропитать и залить такой средой, которая превратила бы их в хорошо режущуюся массу.

Следует помнить, что процесс пропитывания и заливки исследуемого материала требует большой тщательности. Незнание основных принципов и несоблюдение необходимых условий может привести к тому, что объект окажется непригодным для резки или полученные срезы будут некачественными.

Наиболее употребительными для этих целей материалами являются парафин.

Этот метод широко распространен в исследовательских гистологических лабораториях благодаря относительной быстроте заливки (в течение 1—2 дней после обезвоживания), возможности приготовления серийных срезов, а также тонких срезов для цитологических исследований (толщина 2—3 мкм), удобству хранения блоков и неокрашенных срезов (практически неограниченное время). К недостаткам метода следует отнести значительное сжатие исследуемого материала (до 20%), вызываемое воздействием высокой температуры в процессе пропитывания парафином. Известное неудобство представляет необходимость удаления парафина из срезов перед их окраской.

В большинстве случаев для заливки применяют парафин с точкой плавления 54−56°С. Если резка предполагается при низкой температуре окружающей среды, то лучше применять парафин с более низкой точкой плавления (48—50°С). Нужная степень твердости парафина достигается смешиванием в различных комбинациях мягких и твердых сортов.

Если точка плавления парафина неизвестна, ее можно определить. Для этого расплавленный парафин насасывают в тонкий стеклянный капилляр и дают ему застыть. Затем очищают капилляр снаружи от приставшего парафина и вместе с градусником опускают в химический стаканчик с водой, которую начинают постепенно нагревать, перемешивая стеклянной палочкой. Как только парафин в капилляре начнет расплавляться, отмечают температуру, которая и укажет точку его плавления.

Следует помнить, что обычный продажный парафин часто содержит газообразные примеси, которые при заливке образуют пузырьки, придающие парафину повышенную ломкость и значительно ухудшающие качество резки материала. Для избавления от этих примесей свежий парафин следует на длительное время оставить в расплавленном виде в плоских чашках (чтобы увеличить площадь для выделения газов) при температуре 70 °C (для этого можно приспособить сушильный шкаф). Можно также подвергать парафин частому расплавлению и нагреванию (до появления дыма) с последующим быстрым охлаждением.

Если парафин, несмотря на соответствующую подготовку, сохраняет жесткость, к нему следует добавить чистый пчелиный воск в количестве 2—5%, что придаст парафину большую эластичность.

Заливка в парафин требует тщательного соблюдения двух основных условий:

1) препарат должен быть полностью обезвожен,

2) не должен содержать спирт.

Первое условие, как мы уже знаем, обеспечивается в процессе обезвоживания и уплотнения в батарее спиртов повышающейся концентрации.

После заливки тканей в парафин приступают к изготовлению срезов, для чего используются микротомы. Для очистки полученных срезов от парафина следует использовать любой его растворитель — бензол, толуол, ксилол, бензин.

После депарафинирования препараты следует промыть в дистиллированной воде и подсушить на воздухе, затем можно приступать к окрашиванию.

Основной метод окрашивания срезов тканей сердца — проводится с использованием гематоксилина и эозина.

Порядок окрашивания срезов гематоксилин — эозином следующий:

1) срезы переносят в дистиллированную воду;

2) окрашивают гематоксилином Эрлиха 2−5 мин;

3) промывают в дистиллированной воде;

4) затем промывают в водопроводной воде 3−5 мин;

5) осуществляют контроль под микроскопом;

6) дифференцируют 1% раствором хлористоводородной кислоты в 70° спирте 1−2 с;

7) быстро переносят срезы в водопроводную воду на 30 мин при частой смене; в водопроводной воде вишневая окраска ядер сменяется синей;

8) осуществляют контроль под микроскопом; если хроматин и ядрышко видны недостаточно четко, то дифференцировку следует повторить (срезы можно смотреть под большим увеличением, накрыв их покровным стеклом);

9) промывают в дистиллированной воде;

10) 1% водный раствор эозина 0,5−1 мин;

11) промывают в дистиллированной воде (и дифференцируют, так как вода смывает эозин); время промывки контролируют по цвету среза;

12) Время окрашивания в гематоксилине нужно установить на первых 2 -3 срезах и затем все срезы данного блока окрашивать одинаково.

При обезвоживании окрашенных препаратов перед просветлением так же возможно использование изопропилового спирта.

Предложена следующая схема обезвоживания препаратов после окрашивания:

1. 100°этиловый спирт

2. Изопропиловый спирт

3. Смесь 1:1 изопропилового спирта и ксилола

4. Ксилол или заменитель I

5. Ксилол или заменитель II

Препарат готов к заключению в специальную пластмассу — полистирол или бальзам. После затвердевания препарат готов.

Рис. 12. На данном препарате мы видим срез миокарда, который представлен поперечным сечением мышечных волокон, на этом фоне преобладает умеренная-выраженная гипертрофия кардиомиоцитов, в цитоплазме кардиомиоцитов имеются мелкие и средней величины жировые капли (мелко/среднекапельная жировая дистрофия кардиомиоцитов).

Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250

Рис. 13−14. Пылевидное, мелко-, среднеи крупнокапельное ожирение кардиомиоцитов (жировые капли в виде округлых и округло-овальных оранжево-жёлтых включений в цитоплазме кардиомиоцитов). Миокард женщины, 24 лет, страдавшей при жизни наркоманией, хроническим алкоголизмом, ВИЧ — инфицированная.

Окраска: судан-3. Увеличение х250.

Рис. 15. Липофусциноз цитоплазмы кардиомиоцитов. В цитоплазме кардиомиоцитов в перинуклеарной зоне расположены скопления рыже-золотистого и золотисто-жёлтого пигмента липофусцина (пигмент старения).

Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250,

Рис. 16−17. Выраженная фрагментация мышечных волокон миокарда на фоне их умеренной гипертрофии (как признак возможного нарушения ритма сердца). Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х100 и х250.

Заключение

Правильное взятие материала для гистологического исследования и удовлетворительное качество гистологических и гистохимических препаратов во многих случаях позволяет установить прижизненное или посмертное происхождения повреждений, сроки причинения прижизненных повреждений и решить ряд других важных вопросов.

Часть из того, что выявляется при гистологическом исследовании судебно-медицинского материала, выходит за рамки экспертных задач и приобретает общебиологическое значение. Поскольку от травм часто погибают здоровые люди, изменения в организме можно рассматривать как закономерное проявление его реакции в условиях «эксперимента жизни».

Судебному медику крайне важно не только знать изменения при тех или иных видах смерти, но и уметь правильно их оценить при исследовании препаратов, исключив ошибочные трактовки, которые могут возникать за счет некачественной гистологической обработки материала и неправильной фиксации. Это обязывает эксперта знать основные правила и приемы гистологической техники.

В данной работе нами были подробно исследованы методы изготовления секционных препаратов тканей миокарда.

Были получены следующие выводы:

Анализ особенностей организации гистологических исследований показал, что для получения качественных гистологических препаратов важно строго придерживаться всех правил изготовления секционных препаратов, касающихся их изъятия, фиксации, проводки, заливки и окраски Организация и способы забора в первую очередь определяются видом исследования.

Расширить диагностические возможности гистологического исследования позволяет внедрение методов иммуногистохимии, которые постепенно внедряются в практику как за рубежом, так и в России.

Анализ деятельности судебно-гистологического отделения КУ НАО Бюро СМЭ продемонстрировал в трёхлетней динамике улучшение показателей работы.

Исследование сердца от момента взятия материала для исследования до изготовления гистологического препарата в лаборатории КУ НАО Бюро СМЭ позволило сделать вывод о наиболее подходящих видах обработки секционного материала для тканей миокарда.

Практическая значимость исследования заключается в том, что его. результаты оптимизируют имеющиеся данные о проведении судебно-медицинской экспертизы.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Иванов И. Н., Резник А. Г. Подходы к выбору контрольной группы при патоморфологическом исследовании сердца/ И. Н. Иванов, А.Г. Резник// Суд-мед эксперт.-2010.-№ 4.-С. 3−7.

Иммуногистохимические методы: Руководство / George L. Kumar, Lars Rudbeck: Пер. с англ. Г. А. Франк, П. Г. Мальков, Н. В. Данилова, Л. В. Москвина, Л. Э. Завалишина, Н. М. Гафуллин, and Ю. Ю. Андреева. М.: Dako, 2011.

Общественное здоровье и здравоохранение: рук. к практ. занятиям: учеб. пособие / В. А.

Медик, В. И. Лисицин, М. С. Токмачев. — М. :

ГЭОТАР-Медиа, 2013. — 400 с.

Судебная медицина: учебник / под ред. Ю. И. Пиголкина. — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. — 496с.

Сухорукова Е.Г., Коржевский Д. Э. Иммуногистохимическое выявление астроцитов головного мозга при черепно-мозговой травме/ Е. Г. Сухорукова, Д.Э. Коржевский//Суд-мед эксперт.-2010.-№ 1.-С. 14−16.

Сухорукова Е.Г., Бекоева С. А., Коржевская В. Ф. Диагностические возможности методов иммуногистохимии при гистологическом исследовании сердца/ Е. Г. Сухорукова, С. А. Бекоева, В.Ф.Коржевская// Суд-мед эксперт.-2013.-№ 4.-С. 38−41.

Пиголкин Ю. И. Должанский О.В. Судебно-медицинская оценка острой кровопотери по функциональным изменениям внутренних органов/ Ю. И. Пиголкин, О.В. Должанский// Суд-мед эксперт.-2010.-№ 5.-С. 4−7.

Улумбеков Э.Г., Челышев Ю. А Гистология, цитология и эмбриология -М: Медицинское информационное агентство, 2010.

Гистология [Электронный ресурс] ;

http://www.morphology.dp.ua/_mp3/intro.php

Московский исследовательский медицинский институт гистологии [Электронный ресурс] ;

http://mercenariosx.com/

Описание и техническая документация по оборудованию биологических и гистологических лабораторий [Электронный ресурс] ;

http://www.laboratorium.dp.ua/

Приказ Минздравсоцразвития РФ от 12.

05.2010 № 345н «Об утверждении порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно-экспертных учреждениях Российской Федерации» [Электронный ресурс] ;

http://www.zakonprost.ru/content/base/161 113