Получение рекомбинантного сосудистого эндотелиального фактора роста

http://

http://

Курсовая работа Получение рекомбинантного сосудистого эндотелиального фактора роста

Список сокращений

васкулярный эндотелиальный фактор

VEGF — сосудистый эндотелиальный фактор роста (Vascular endothelial growth factor)

VEGFR-1 — мембранный рецептор 1 сосудистого эндотелиального фактора роста (Vascular endothelial growth factor receptor)

VEGFR-2 — мембранный рецептор 2 сосудистого эндотелиального фактора роста (Vascular endothelial growth factor receptor)

FGF-1, -2 — фактор роста фибробластов (fibroblast growth factor)

FGFR — рецептор фактора роста фибробластов

PDGF — тромбоцитарный фактор роста (platelet derived growth factor)

PDGFR — рецептор тробмоцитарного фактора роста

HIF-1 — фактор, индуцируемый при гипоксии (hypoxic inducible factor)

Ang-1,-2 — ангиопоэтины

PAS — семейство доменов (PER-ARNT-SIM)

Per — белок кодируемый геном Drosophila melanogaster, отвечающий за биоритмы организма (period circadian protein)

Arnt — аryl hidrocarbon receptor nuclear translocator protein

SIM — single minded protein

bHLH — семейство факторов транскрипции («спираль-петля-спираль») (basic Helix-Loop-Helix)

pVHL — опухолевый супрессор (von Hippel Lindau)

Tie-2 — мембранный киназный рецептор (Tunica interna endothelial kinase-2)

MAPK — митоген-активированная киназа (mitogen-activated protein kinase)

PI3Kфосфатидилинозитол 3-киназа (phosphatidylinositol 3-kinase)

Grb2 — белок сателлит фактора роста (Growth factor receptor-bound protein 2)

FRS-2 — субстрат рецептора фактора роста фибробластов (Fibroblast growth factor receptor substrate 2)

Ras — сигнальный белок, принадлежащий семейству малых гуанозинтрифосфатаз

Raf — сигнальный белок, серин/треонин-специфичная протеин-киназа

ERK — внутриклеточная сигнальная киназа (extracellular-regulated kinase)

MEK — митоген-активированная киназа киназа (Mitogen-activated protein kinase kinase)

Src — семейство протоонкогенных тирозин киназ

C-Kit — поверхностный цитокиновый рецептор

ECM — межклеточный матрикс (extracellular matrix)

ATP — аденозин-5`-трифосфат ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота ИПТГ — изопропилтио—D-галактозид ПААГ — полиакриламидный гель ПЦР — полимеразная цепная реакция Трис — трис (гидроксиметил)метиламин ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота

DTT — 1,4-дитиотреитол

dNTP — дезоксирибонуклеозид-5`-трифосфаты

SDS — додецилсульфат натрия

TEMED — N, N, N, N-тетраметилэтилендиамин

Amp — ампициллин

Современные достижения биотехнологии в области работы с рекомбинантными ДНК открывают большие возможности для получения разнообразных белковых молекул, с нужной биологической активностью. Одной из важнейших проблем нового века является рост числа онкологических заболеваний. В связи с этим, важной задачей представляется разработка новых эффективных целевых препаратов. За последние 30 лет антиангиогенная терапия стала важной методикой в борьбе со злокачественными новообразованиями. Клинические данные продемонстрировали, что гуманизированные моноклональные антитела — препарат бевацизумаб — прицельно действующий на ключевой фактор ангиогенеза, а именно — сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), могут увеличить продолжительность жизни больных метастатическим колоректальным раком при назначении в качестве терапии первой линии в комбинации с химиопрепаратами. В данной работе мы обсудим функции и значение VEGF, чтобы показать, что VEGF является обоснованной точкой приложения действия противоопухолевой терапии. Цель данной курсовой работы состояла в разработке методики получения рекомбинантного сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGF). Для решения поставленной цели были определенны следующие задачи:

1. Осуществить химико-ферментативный синтез гена белка VEGF₁₆₅, и клонировать в экспрессирующий вектор pET23d (+).

2. Получить высокоэффективный штамм-продуцент E.coli (ER2566)/pERVEGF₁₆₅, продуцирующий рекомбинантный сосудистый эндотелиальный фактор роста.

1. Литературный обзор

васкулярный эндотелиальный фактор

Факторы роста

Общие сведения

Факторы роста — это белковые субстанции, способные стимулировать рост, пролиферацию и/или дифференцировку живых клеток.

Факторы роста обычно представляют собой небольшие полипептиды, которые стимулируют или ингибируют пролиферацию определенных типов клеток. Как правило, они секретируются одними клетками и действуют на другие клетки, хотя иногда бывает так, что они действуют на те же клетки, которые их секретируют. Эти факторы важны для процессов развития эмбриона и также для поддержания клеточного баланса у взрослого организма. Например, для уравновешенного обновления клеток кожи, кишечника и кроветворной системы. Они действуют на свои клетки-мишени, которые отличаются от других клеток рецепторами, экспонированными на поверхности клеточных мембран и характерными именно для данного типа клеток. Так, некоторые белки этой группы в зависимости от типа клеток-респондентов могут индуцировать дифференцировку и подавлять пролиферацию. Кроме того, к ним относят регуляторные полипептиды, модулирующие подвижность клеток, но не обязательно влияющие на деление клеток.

В конечном счете, клетка выходит из фазы отдыха G0 и начинает делиться. Интегральная картина взаимодействий множества факторов с множеством клеток сложна, тем более, что часто даже отдельно взятый ростовой фактор обладает несколькими функциями.

Факторы роста не только промотируют клеточное деление, а так же ингибируют их пролиферацию. Роль ингибитора, в частности, выполняют члены большого семейства ростовых факторов — TGF-бета.

Несмотря на огромное разнообразие охарактеризованных факторов роста и колоссальную разницу клеточных ответов [8], можно сформулировать общие правила регуляции:

1. Для поддержания жизни нормальных клеток высших организмов абсолютно необходимо их взаимодействие с уникальной комбинацией специфических ростовых факторов.

2. Одна и та же клетка может взаимодействовать с несколькими факторами роста; один и тот же фактор роста может оказывать влияние на разные типы клеток.

3. Уровень экспрессии данного ростового фактора, а также восприимчивость и характер ответа являются специфичными для каждого данного типа клеток.

В основе раковых заболеваний лежат нарушения контроля пролиферации, а также взаимодействий клеток друг с другом. Часто неопластическая трансформация затрагивает имеющуюся в клетке собственную программу регуляции — реакции на ростовые факторы. С этим, так или иначе, связаны функции большинства онкогенов.

Классификация факторов роста

Факторы роста классифицируют по их биологической активности. Индивидуальные ростовые факторы представлены большими семействами структурно и эволюционно родственных белков. Основные семейства ростовых факторов представлены ниже [10−21].

· Косные морфогенетические белки (BMPs)

· Эпидермальный фактор роста (EGF)

· Эритропоэтин (EPO)

· Фактор роста фибробластов (FGF)

· Колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF)

· Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF)

· Фактор роста гепатоцитов (HGF)

· Инсулин-подобный фактор роста (IGF)

· Миостатин (GDF-8)

· Фактор роста нервов (NGF) и другие нейротрофины

· Тромбоцитарный фактор роста (PDGF)

· Тромбопоэтин (TPO)

· Трансформирующий ростовой фактор альфа (TGF-б)

· Трансформирующий ростовой фактор beta (TGF-в)

· Фактор некроза опухоли альфа (TNF-б)

· Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF)

· Плацентарный фактор роста (PlGF)

· IL-1- Кофактор для IL-3 и IL- 6. Активатор Т клеток.

· IL-2- Фактор роста Тклеток. Стимулятор синтеза IL-1. Активатор B и NK — клеток.

· IL-3- Стимулирует пролиферацию всех не лимфоидных клеток.

· IL-4- Ростовой фактор активированных B клеток, а также тучных клеток.

· IL-5- Индуцирует дифференцировку активированных B клеток и эозинофилов.

В данной курсовой работе было рассмотрено одно из представленных семейств ростовых факторов, а именно васкулярный эндотелиальный фактор роста. Описаны основные белки семейства, их биологическая роль с учётом молекулярной структуры и представлены принципы их направленной модификации с целью изменения спектра биологического действия.

2. Васкулярно-эндотелиальный фактор роста VEGF

Общие сведения

VEGF — один из членов семейства структурно близких между собой белков, которые являются лигандами для семейства рецепторов VEGF. VEGF влияет на развитие новых кровеносных сосудов (ангиогенез) и выживание незрелых кровеносных сосудов (сосудистая поддержка), связываясь с двумя близкими по строению мембранными тирозинкиназными рецепторами (рецептором-1 VEGF и рецептором-2 VEGF) и активируя их. Эти рецепторы экспрессируются клетками эндотелия стенки кровеносных сосудов. Связывание VEGF с этими рецепторами запускает сигнальный каскад, который в конечном итоге стимулирует рост эндотелиальных клеток сосуда, их выживание и пролиферацию, подробнее о механизме внутриклеточной передачи сигнала будет сказано в разделе «VEGF рецепторы».

Классификация и разновидности VEGF

Существует два подхода к классификации членов семейства VEGF. Историческая классификация и на основе альтернативного сплайсинга пре мРНК. Согласно исторической классификации в семейство VEGF белков выделяют VEGF A, VEGF B, VEGF C, VEGF D и плацентарный фактор роста. Наиболее важным из них является VEGF A, другие были обнаружены позднее VEGF-A, и до их открытия, VEGF, А назывался просто VEGF. Так же к этому семейству белков причисляют кодируемый вирусами VEGF подобный белок, получивший название VEGF E и васкулярный эндотелиальный фактор роста из змеиного яда VEGF F. Помимо вышеописанной классификации, семейство VEGF белков делят на два больших подсемейства в соответствии с положением сайта сплайсинга восьмого экзона пре-мРНК. Проксимальный сайт сплайсинга обозначают VEGFxxx, а дистальный сайт сплайсинга VEGFxxxb. Данный домен имеет важное функциональное значение, определяя проангиогенные (проксимальный сайт сплайсинга) или анти ангиогеные (дистальный сайт сплайсинга) свойства белка. Кроме того, альтернативный сплайсинг экзона 6 и 7 изменяет их сродство к гепарину и нейрофилину, например: VEGF121, VEGF_121b, VEGF₁₄₅, VEGF₁₆₅, VEGF_165b, VEGF₁₈₉, VEGF₂₀₆, где число показывает количество аминокислотный остатков. Тогда как экзоны 2−5 являются общими для всех и определяют сродство к VEGF рецепторам 1 и 2 (Рис.1).

Рис. 1 Схема вариантов альтернативного сплайсинга пре-мРНК VEGF с указанием количество остатков аминокислот полипептидной цепи и функций доменов, кодируемые указанными экзонами.

Васкулярно-эндотелиальный фактор роста (VEGF 165)

VEGF165 представляет собой гомодимер с молекулярной массой 19 165 Да, и изоэлектрической точкой 7,429, каждый мономер которого образован семью в-складчатыми листами, и двумя б-спиралями, соединенных тремя дисульфидными мостиками (Рис.2).

Рис. 2 Структура димера VEGF 165.

Стабилизация димера происходит при реверсивном расположении мономеров, и образовании двойной дисульфидной связи.

Васкулярно-эндотелиальный фактор роста (b) VEGF 165b

Впервые VEGF 165b был выделен из эпителиальных клеток почек. Эта разновидность васкулянного эндотелиального фактора роста распространена в нормальных клетка, но абсолютно отсутствует в клетка опухоли. VEGF 165b имеет такое же сродство к VEGFR-2 как и VEGF 165, но не связывается с нейрофилином, и обладает слабой аффиностью к гепарину.

Аминокислотная последовательность VEGF 165b идентична аминокислотной последовательности VEGF 165 за исключением 6 аминокислотных остатков на С — конце, так как их кодирует не 8 экзон, а экзон 9 (Рис 3).

Рис 3. На схеме представлены различия мРНК VEGF 165 и VEGF 165b.

Рис 4. Структура С-конца VEGF 165. Стрелка показывает дисульфидную связь образованную 160 и 146 аминокислотными остатками цистеина.

Экзон 8 кодирует последовательность Cys-Asp-Lys-Pro-Arg-Arg, тогда как экзон 9 кодирует последовательность Ser-Leu-Thr-Arg-Lys-Asp. Это приводит к формированию различных третичных структур. 160 аминокислотный остаток (Cys) в молекуле VEGF 165 формирует дисульфидную связь с 146 цистеином (Рис 4).

Значимое отличие первичной структуры VEGF 165 b от VEGF 165 заключается в том, что вместо цистеина в 160 положении (VEGF 165) расположен серин (VEGF 165 b), тем самым отсутствует возможность образования S-S связи (Рис 5).

Рис 5. С-концевая аминокислотная последовательность VEGF 165 и VEGF 165b.

В результате снижается сродство к гепарину и нейрофилину-1. Тем самым 160 цистеин играет важную роль в связывании с гепарином и нейрофилином-1[27].

Участие VEGF в ангиогенезе.

Ангиогенез — процесс образования новых кровеносных сосудов в органе или ткани. В норме в организме процессы ангиогенеза протекают с умеренной интенсивностью и активизируются только при регенерации повреждённых тканей, канализации тромбов, ликвидации очагов воспаления, образовании рубца и тому подобных процессах восстановления, а также при росте и развитии организма.

При ангиогенезе эндотелиальные клетки выходят из свойственного им состояния покоя (скорость удвоения их популяции возрастает почти в 100 раз), начинают делиться и образуют эндотелиальную почку, которая прорывает базальную мембрану и внедряется в соединительную ткань. Активацию эндотелиальных клеток обеспечивают факторы роста, которые образуются в опухоли и в самих эндотелиальных клетках, а также компоненты внеклеточного матрикса. Прекращение действия этих факторов возвращает эндотелиальные клетки в состояние покоя. Начальным этапом VEGF опосредованного ангиогенеза является взаимодействие ростовых факторов с соответствующими поверхностными рецепторами мембраны эндотелиальных клеток.

VEGF рецепторы

Существует несколько типов VEGF рецепторов VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3 и ко-рецепторы гепарин и нейрофилин-1(рис 6).

Рис 6. Схема VEGF рецепторов с соответствующими лигандами.

VEGF-А связывается с VEGFR-1, VEGFR-2. Так же многие белковые формы альтернативного сплайсинга гена VEGF-А, обладают сродством к нейрофилину-1 и внеклеточному матриксу, особенно гепарину. VEGF-B обладает сродством только с VEGFR-1, тогда как VEGF-С и VEGF-D являются лигандами для VEGFR-2 и VEGFR-3. Вирусный VEGF-E и VEGF-F яда змеи активируют только VEGFR-2. VEGFR являются мембранными тирозинкиназными рецепторами. VEGFR-1 активирует формирование только кровеносных, а VEGFR-3 лимфатических сосудов. Тогда как VEGFR-2 участвует в формирование, как кровеносных сосудов, так и лимфатических.

Рис. 7 Сайты фосфорилирования и передачи сигнала от VEGF рецепторов.

При активации рецепторов VEGF участвуют также «вспомогательные» белки. FRS2, как и в случае FGFR рецептора, фосфорилированные по тиозиновым, сериновым и треониновым остаткам, связывают адапторные белки Grb2 и Shp2 (тирозинфосфатазу) и запускают внутриклеточный сигнальный каскад PKCг, PI3K, Src и Crk (Рис 7).

Наиболее яркими примерами патологий, связанных с ангиогенезом, являются атеросклероз [34], язвенная болезнь и некоторые аутоиммунные заболевания. Существуют косвенные указания на нарушения нормальных процессов ангиогенеза при ряде патологий развития и при опухолеобразовании.

Из выше приведённого литературного обзора видно, какую важную роль играет VEGF в процессе ангиогенеза, а понимание механизмов взаимодействия данного ростового фактора с соответствующими рецепторами открывает перспективы, направленной модификацией белка, с целью создания новых лекарственных субстанций.

Материалы

· Реактивы

В работе использованы трис, акриламид, N, N'-метиленбисакриламид, персульфат аммония, ТЕМЕД, уксусная кислота, этанол, SDS, бромфеноловый синий, 2-меркаптоэтанол, агар (Difco), дрожжевой экстракт (Sigma), ИПТГ (Sigma), бакто-триптон (Difco).

· Олигонуклеотиды

PR-1: tataccatggcgccgatgg

PR-2: ggtgctcgagttagcgacg

V-1: tataccatggcgccgatggcggaaggcggtggcca

V-2: gaaccatcacgaagttgtgaaatttatggatgtttaccagcgttc

V-3: ttactgccatccgattgaaaccctggttgatattttt

V-4: caggaatacccggatgaaattgaatacatttttaaaccg

V-5: Tcttgcgttccgctgatgcgttgcggcggt

V-6: tgctgtaacgatgaaggcctggaatgcgttccgaccga

V-7: agaatctaacattaccatgcagattatgcgtatt

V-8: aaaccgcatcagggccagcatattggcgaaatgtct

V-9: tttctgcagcataacaaatgcgaatgccgtccgaaaa

V-10: aagatcgtgcgcgtcaggaaaacccgtgcgg

V-11: cccgtgctctgaacgtcgcaaacatctgtttgttc

V-12: aggacccgcagacctgcaaatgctcttgtaaaaacaccg

V-13: attctcgttgcaaagcgcgtcagctggaactgaacgaac

V-14: gtacctgccgttgtgataaaccgcgt

V-15: ctcgagttagcgacgcggtttatca

V-16: caacggcaggtacgttcgttcagttccagc

V-17: tgacgcgctttgcaacgagaatcggtgtttttacaagagc

V-18: atttgcaggtctgcgggtcctgaacaaacagatgtttg

V-19: cgacgttcagagcacgggccgcacggg

V-20: ttttcctgacgcgcacgatcttttttcggacggcatt

V-21: cgcatttgttatgctgcagaaaagacatttcg

V-22: ccaatatgctggccctgatgcggtttaatacgcat

V-23: aatctgcatggtaatgttagattcttcggtcggaacgcat

V-24: tccaggccttcatcgttacagcaaccgccgcaacg

V-25: catcagcggaacgcaagacggtttaaaaatgtattc

V-26: aatttcatccgggtattcctgaaaaatatcaaccagggtttc

V-27: aatcggatggcagtaagaacgctggtaaacatccataaatttca

V-28: caacttcgtgatggttctggccaccgccttccgccatcggcg

Олигонуклеотиды были синтезированы на заказ фирмой Евроген.

Т4-ДНК-лигаза (Fermentas, #EL0014), Т4-полинуклеотидкиназа (Fermentas, #EK0031), Taq ДНК-полимераза (Fermentas), эндонуклеазы рестрикции NcoI, XhoI.

· Плазмидный вектор

pET23d (+) (Novagen)

· Бактериальные штаммы

E.coli ER2566 ([F^- lamda^- fhuA2 [lon] ompT lacZ: T7 gene1 gal sulA11 D (mcrCmrr)114:IS10 R (mcr-73:miniTn10— TetS)2 R (zgb-210:Tn10) (TetS) endA1 [dcm])

Лабораторное оборудование

В работе использовали напольные центрифуги с охлаждением К-24 (MLW, Германия), G-21 и J-21 (Beckman); Настольная центрифуга Denville 260D (Denville Scientific, США), (Heraeus); амплификатор (Gene-Cycler) (Bio-Rad); сухой термостат DVE (Heraeus); качалку с термостатируемой камерой Certomat (ETH); источники постоянного тока: 2197 Power Supply (LKB), 2002 Power Supply (LKB), 2301 Macrodrive-l (LKB), 2301 Macrodrive-5 (LKB), Electrophoresis Power Supply EPS500/400 (Pharmacia); ультразвуковой дезинтегратор (Branson) MSE, pH-метр PB-11 (Sartorius); Спектрофотометр SmartSpec Plus (Bio-Rad, США); ламинарный шкаф Gelaire (Flow Lab.); УФ-трансиллюминатор (Desaga); весы аналитические (Mettler PM460); автоматические микропипетки (Gilson, Eppendorf).

· Буферы и растворы

50ТАЕ (50-кратный буфер для электрофореза ДНК в агарозе):

2 М трис-ацетат, рН 8,0, 1 М Na-ацетат, 0,9 М NaCl, 50 мМ ЭДТА.

40% акриламид/1,3% N, N'-метилен-бисакриламид в воде.

YT-бульон: 0,8% бакто-триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl.

Буферные системы для денатурирующего белкового электрофореза:

Буфер для приготовления образцов — 125 мМ трис-HCl, рН 6,8, 3% SDS, 20% глицерин, 3% 2-меркаптоэтанол, 0,05% бромфеноловый синий;

LTB (буфер для разделяющего геля) 375 мМ трис-HCl, рН 8,8, 0,1%SDS;

UTB (буфер для концентрирующего геля) 125 мМ трис-HCl, рН 6,8, 0,1% SDS.

10ЧБуфер для Taq-полимеразы: 67 мМ трис-HCl, 16,6 мМ (NH₄)₂SO₄, 0,01% TWEEN-20, 1,5 мМ MgCl₂.

10Ч Буфер для ДНК-лигазы фага Т4: 25 мМ трис-HCl, рН 7,8, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ ДТТ, 0,4 мМ рАТР.

10 ЧБуфер для полинуклеотидкиназы фага Т4: 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ ДТТ.

Буфер для эндонуклеаз рестрикции (NcoI, XhoI): 10X Buffer Tango™ (Fermentas): 33 мМ трис-ацетат (pH 7,9 при 37°C), 10 мМ ацетат магния, 66 мМ ацетат калия, 0,1 мг/мл БСА.

Методы

· Химико-ферментативный синтез гена VEGF₁₆₅.

— Синтез гена VEGF₁₆₅ проводился химико-ферментативным способом из синтетических олигонуклеотидов (V-1 — V-28). Олигонуклеотиды (V-2 — V12, V-16 — V-28) были смешаны в эквимолярном соотношении по 200 пмоль, и фосфорилированы в реакционной смеси объемом 80 мкл, содержащей 2 мкл 5 мМ АТФ, 10 единиц полинуклеотидкиназы фага Т4 (Fermentas), 2 мкл 10х буфера для Т4-полинуклеотидкиназы, 75 мкл воды. Реакцию проводили в течение 1,5 часа при 37⁰С. По окончании ферментативной реакции все реакционные смеси были прогреты 10 минут при 75⁰С для инактивации Т4-полинуклеотидкиназы. Далее фосфорилированные нуклеотиды были смешаны c растворами, содержащими по 200 пмоль нефосфолирированных олигонуклеотидов (V-1, V-15). Далее проводилась денатурация олигонуклеотидов при температуре 95 °C в течении 5 минут и отжиг при медленном охлаждении до комнатной температуры.

Лигирование олигонуклеотидов проводилось при 4 °C в течении 24 часов в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 2 мкл 5 мМ ATФ, 2 мкл 10х буфера для Т4-ДНК-лигазы и 5 ед. Т4-ДНК-лигазы (Fermentas, #EL0014).

· Амплификация

Амплификацию синтезированного гена проводили с помощью полимеразной цепной реакции в 50 мкл инкубационной смеси, содержащей в качестве матрицы 10 нг лигазной смеси, 0,2 мкмоль каждого праймера (PR-1, PR-2), 5 мкл 10 буфер для Taq-ДНК-полимеразы, dNTP (каждый в концентрации 0,4 мМ), 2 ед. Taq-ДНК-полимеразы. Инкубацию проводили в ДНК-амплификаторе в следующем режиме: 1) денатурация 40 сек. при 93 °C, отжиг 40 сек. при 58 °C, элонгация 30 сек. при 72 °C (5 циклов), 2) денатурация 30 сек. при 93 °C, отжиг 30 сек. при 60 °C, элонгация 30 сек. при 72 °C (24 цикла). Продукт ПЦР очищали при помощи набора для очистки ПЦР-продуктов MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN, #27 106).

· Молекулярное клонирование

— Ферментативный гидролиз эндонуклеазами рестрикции проводили в 20 мкл инкубационной смеси содержащей: 2 мкл буфера 10X Buffer Tango™ (Fermentas), по 10 ед. каждой рестриктазы (NcoI и XhoI), 1 мкг плазмидного вектора pET23d (+), 15 мкл воды. Реакцию проводили в течении 1,5 часов при 37 °C.

— Лигирование проводили в 20 мкл инкубационной смеси содержащей: 2 мкл буфера для ДНК-лигазы фага Т4, 2 мкл 5 мМ ATФ, 10 ед. ДНК-лигазы фага Т4 и 10 мг вектора pET23d (+) обработанного соответствующими рестриктазами, 5 мг очищенного ПЦР продукта. Реакционную массу оставляли на ночь при +4°С.

· Выделение и очистка плазмидной ДНК

Очистка плазмидной ДНК проводилась с использованием набора DNA Purification System (Promega), по протоколу фирмы изготовителя. Далее очищенная плазмидная ДНК pER-VEGF₁₆₅ использовалась для трансформации компетентных клеток.

· Приготовление компетентных клеток и их трансформация.

Получение компетентных клеток: Порцию YT-бульона (50 мл) засевали 0,25 мл ночной культуры штамма ER2566 и выращивали при 37 °C с аэрацией до величины A₅₅₀ 0,5 — 0,7. Полученную суспензию охлаждали во льду 10 мин (все последующие операции проводили при температуре около 0°С) и центрифугировали в стерильных стаканах 15 мин при 4000g при 4 °C. Осадок суспендировали в 25 мл 0,1 М хлорида кальция, инкубировали 0,5 ч, центрифугировали и затем суспендировали в 5 мл 0,1 М хлорида кальция, содержащего 20% глицерина. Суспензию компетентных клеток расфасовывали по 0,2 мл и хранили при -70°С.

Трансформация клеток: Суспензию компетентных клеток E.coli штамма ER2566 (200 мкл) размораживали во льду и добавляли 0,002 г плазмиды pER-VEGF₁₆₅. Инкубировали во льду 1 ч, затем выдерживали 2 мин при 42 °C (тепловой шок), далее помещали в лед на 10 мин, добавляли 5 мл YT-бульона и инкубировали 1 ч при 37 °C со встряхиванием. Суспензию рассевали на селективные чашки (Аmр 100 мкг/мл) с YT-агаром, и помещали на инкубацию при 37⁰С на 12 часов.

· Приготовление лизатов клеток для белкового электрофореза:

Выросшие колонии клеток ER2566 с рекомбинантной плазмидой pER VEGF₁₆₅ переносили в 3 мл среды LB, содержащей Аmр (50 мкг/мл) и выращивали при 37 °C до величины А₆₀₀ 0,5, добавляли ИПТГ до конечной концентрации 0,5 мМ, инкубировали 4 ч при 37 °C. Клетки отделяли центрифугированием (1 мин, 10000g), ресуспендировали в буфере для приготовления образцов и подвергали ультразвуковой обработке (22 кГц, 3−5 с). Аликвоты (4 мкл) наносили на электрофорез, предварительно прогрев на кипящей водяной бане в течение 10 мин, для электрофоретического разделения в денатурирующих условиях.

· Белковый электрофорез клеточных лизатов

Электрофорез клеточных лизатов клонов в денатурирующих условиях проводили в системе LKB (Швеция). Использовали двуступенчатый гель: верхний (концентрирующий) — 3.5% ПААГ в буфере UTB, нижний (разделяющий) — 15% ПААГ в буфере LTВ. В качестве маркеров молекулярных масс использовали набор «PageRuler Protein Prestained Ladder» (Fermentas) c молекулярными массами: 130, 95, 72, 55, 43, 34, 26, 17, 11 кДа.

Размеры гелей составляли 9120,05 см. Денатурирующий белковый электрофорез проводили в 1 трис-глициновом буфере с SDS при постоянной силе тока 22 мА. Электрофорез вели до тех пор, пока бромфеноловый синий не достигал конца геля. После электрофореза гель помещали на 5−10 мин в фиксирующий раствор (20% уксусная кислота, 50% этанол), затем в течение 10−20 мин прокрашивали водным раствором, содержащим 0.2% кумасси R-250, 10% уксусной кислоты, 10% изопропанола при 60 °C. Гель отмывали 5% раствором уксусной кислоты.

Результаты и обсуждение

Синтез искусственного гена VEGF₁₆₅

Аминокислотная последовательность был взята из статьи Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 2003 Jun;9(6):669−76. Последовательность представлена на рис. 8.

Оптимизация кодонов последовательности гена VEGF 165 для эффективной прокариотическиой экспрессии была проведена в соответствии с данными, представленными в базе данных «Codon-Usage Database» для Escherichia coli [http://www.kazusa.or.jp/codon/]

Рис. 8 Аминокислотная и нуклеотидная последовательность VEGF₁₆₅. полужирным шрифтом выделены триплеты нуклеотидов, под ними трёхбуквенные обозначения аминокислот.

Синтез искусственного гена VEGF₁₆₅ осуществляли химико-ферментативным способом из перекрывающихся олигонуклеотидов, составляющих структуру цепей полинуклеотидного дуплекса. Ниже приведена схема расположения и нумерация олигонуклеотидов (Рис.9).

Рис. 9 Схема синтеза искусственного гена VEGF₁₆₅

Предварительно нами было проведено ферментативное фосфорилирование полинуклеотидкиназой фага Т4 олигонуклеотидов за исключением концевых V-1 и V-15. Последующим отжигом и лигированием ДНК-лигазой фага Т4 олигонуклеотидов (V-1 — V-28), получили искусственный ген VEGF₁₆₅.

Амплификацию лигазной смеси проводили при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами PR-1 и PR-2, содержащими сайты рестриктаз NcoI и XhoI соответственно. Очистка ПЦР-продукта осуществлялась с помощью набора MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN, #27 106) (Рис 10).

Рис. 10. Электрофореграмма продуктов ПЦР.

Дорожка № 1 t отжига праймеров 60^оC

Дорожка № 2 t отжига праймеров 58^оC

В качестве экспрессионного вектора был выбран плазмидный вектор pET-23d (+). Данный вектор содержит в полилинкерной последовательности сайты рестрикции NcoI (ccatgg) и XhoI (ctcgag), по которым и была произведена вставка амплифицированного гена VEGF₁₆₅ с учетом корректной рамки считывания (Рис.11)

Рис. 11 а) Схема получения плазмиды pER VEGF₁₆₅

б) Полилинкерная последовательность плазмиды pET23d (+)

После расщепления эндонуклеазами рестрикции NcoI и XhoI вектор лигировали с очищенным продуктом ПЦР, обработанным теми же рестриктазами. В результате чего была получена рекомбинантная плазмида pER VEGF₁₆₅.

Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е.coli ER2566. Суспензию трансформированных клеток рассевали на чашки с селективной средой. Клоны, полученные при высевании трансформированных клеток на агаризованную среду с добавлением ампициллина, пересевали в жидкую среду с добавлением ампициллина для выращивания и отбора рекомбинантов.

Отбор рекомбинантов осуществляли по результатам электрофореза клеточных лизатов клонов в ПААГ представленного на рис. 12.

Рис. 12 Электрофореграмма суммарных клеточных лизатов различных клонов.

Номер дорожки на геле соответствует номеру клона. № 1- маркер масс.

Для последующей работы были отобраны клоны № 2, № 3, № 4. Выделение плазмиды для последующей трансформации компетентных клеток E.сoli ER2566 осуществлялось из отобранных клонов с помощью набора Promega (по протоколу производителя). Для подтверждения строения вставки гена рекомбинантного белка, полученные плазмиды были просеквенированы по методу Сенгера (в компании Евроген). Анализ нуклеотидной последовательности плазмиды pER VEGF₁₆₅ подтвердил правильность вставки гена VEGF₁₆₅.

Полученные клетки штамма-продуцента высевались на питательную среду для определения оптимального времени продуцирования целевого продукта.

Результаты данного эксперимента после индуцирования штамма-продуцента представлены на электрофореграмме (15% SDS-ПААГ) на рис. 13.

На основе полученной электрофореграммы сделали вывод об оптимальности четырёх часовой инкубации клеточной культуры после индуцирования ИПТГ.

Выводы

1. Осуществлен химико-ферментативный синтез гена белка VEGF₁₆₅, и клонирование в экспрессирующий вектор pET23d (+).

2. Получен высокоэффективный штамм-продуцент E.coli (ER2566)/pERVEGF₁₆₅, продуцирующий рекомбинантный сосудистый эндотелиальный фактор роста.

1. Los M, Roodhart JM, Voest EE (April 2007). «Target practice: lessons from phase III trials with bevacizumab and vatalanib in the treatment of advanced colorectal cancer». The Oncologist 12 (4): 443−50. doi: 10.1634/theoncologist. 12−4-443. PMID 17 470 687.

2. Growth factor at Dorland’s Medical Dictionary.

3. Goustin A.S. Leof E.B. Shipley G.D., Moses H.L. Growth factors and cancer. Cancer Res. 1986 Mar;46(3):1015−29.

4. Марри Р. и др. Биохимия человека. М., 2010.

5. Stoker M, Gherardi E. Regulation of cell movement: the motogenic cytokines. Biochim. Biophys. Acta 1072 (1991), 81

6. Deuel T.F. Polypeptide growth factors: roles in normal and abnormal cell growth. Annu Rev Cell Biol. 2007;3:443−92.

7. Datto, M.B., Hu, P.P., Kowalik, T.F., Yingling, J., and Wang, X.F. (1997) Mol. Cell. Biol., 17, 2030;2037.

8. Cross M, Dexter T.M. Growth factors in development, transformation, and tumorigenesis. Cell. 1991 Jan 25;64(2):271−80.

9. Коган А. Х. Патофизиология опухолей М., 1991

10. Reddi AH, Reddi A (2009). «Bone morphogenetic proteins (BMPs): from morphogens to metabologens». Cytokine & growth factor reviews 20 (5−6): 341−2. doi:10.1016/j. cytogfr.2009.10.015. PMID 19 900 831

11. Carpenter G, Cohen S (May 1990). «Epidermal growth factor». The Journal of Biological Chemistry 265 (14): 7709−12. PMID 2 186 024.

12. Siren AL et al. (2001). «Erythropoietin prevents neuronal apoptosis after cerebral ischemia and metabolic stress». Proc Natl Acad Sci USA 98 (7): 4044−4049. doi:10.1073/pnas. 51 606 598. PMC 31 176. PMID 11 259 643.

13. Finklestein S.P., Plomaritoglou A. (2001). «Growth factors». In Miller L.P., Hayes R.L., eds. Co-edited by Newcomb J.K. Head Trauma: Basic, Preclinical, and Clinical Directions. New York: Wiley. pp. 165−187. ISBN 471 360 155.

14. Sallerfors B, Olofsson T (1993). «Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) secretion by adherent monocytes measured by quantitative immunoassays». Eur. J. Haematol. 49 (4): 199−207.

15. Nakamura T (1992). «Structure and function of hepatocyte growth factor.» .Prog. Growth Factor Res. 3 (1): 67−85.doi:10.1016/0955−2235(91)90014-U.PMID 1 838 014.

16. Cohen P, Peehl DM, Lamson G, Rosenfeld RG (2013). «Insulin-like growth factors (IGFs), IGF receptors, and IGF-binding proteins in primary cultures of prostate epithelial cells». Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 73 (2): 401−7. doi:10.1210/jcem-73−2-401. PMID 1 713 219.

17. Hannink M, Donoghue DJ (1989). «Structure and function of platelet-derived growth factor (PDGF) and related proteins» .Biochim. Biophys. Acta 989 (1): 1−10. PMID 2 546 599.

18. Luetteke NC, Lee DC (1991). «Transforming growth factor alpha: expression, regulation and biological action of its integral membrane precursor». Semin. Cancer Biol. 1 (4): 265−75. PMID 2 103 501.

19. Khalil N (1999). «TGF-beta: from latent to active». Microbes Infect1 (15): 1255−63. doi:10.1016/S1286−4579(99)00259−2.PMID 10 611 753.

20. Dowlati Y, Herrmann N, Swardfager W, Liu H, Sham L, Reim EK, Lanctфt KL (2010). «A meta-analysis of cytokines in major depression». Biol Psychiatry 67 (5): 446−457.

21. Ferrara N, Davis-Smyth T. The biology of vascular endothelial growth factor. Endocr Rev. 1997 Feb;18(1):4−25. PMID:9 034 784

22. Ferrara N. Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress. Endocr Rev. 2004 Aug;25(4):581−611. PMID:15 294 883 doi:10.1210/er. 2003;0027.

23. Robinson CJ, Stringer SE. The splice variants of vascular endothelial growth factor (VEGF) and their receptors. J Cell Sci. 2001 Mar;114(Pt 5):853−65. PMID:11 181 169.

24. Muller YA, Christinger HW, Keyt BA, de Vos AM. The crystal structure of vascular endothelial growth factor (VEGF) refined to 1.93 A resolution: multiple copy flexibility and receptor binding. Structure. 1997 Oct 15;5(10):1325−38

25. Muller YA, Li B, Christinger HW, Wells JA, Cunningham BC, de Vos AM. Vascular endothelial growth factor: crystal structure and functional mapping of the kinase domain receptor binding site. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Jul 8;94(14):7192−7. PMID:9 207 067.

26. Bates DO, Cui TG, Doughty JM, Winkler M, Sugiono M, Shields JD, Peat D, Gillatt D, Harper SJ. VEGF165b, an inhibitory splice variant of vascular endothelial growth factor, is down-regulated in renal cell carcinoma. Cancer Res. 2002 Jul 15;62(14):4123−31.

27. B. A. Keyt, L. T. Berleau, H. V. Nguyen, H. Chen, H. Heinsohn, R. Vandlen, N. Ferrara. The Carboxy-terminal Domain (111−165) of Vascular Endothelial Growth Factor is Critical for its Mitogenic Potency. J. Biol. Chem., 2010. 271, 7788−7795.

28. John S. Penn (11 March 2008). Retinal and Choroidal Angiogenesis. Springer. pp. 119-. ISBN 9 781 402 067 792. Retrieved 26 June 2010.

29. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK10107/

30. Burri, PH; Hlushchuk, R; Djonov, V (2004). «Intussusceptive angiogenesis: its emergence, its characteristics, and its significance». Dev Dyn. 231 (3): 474−88. doi:10.1002/dvdy.20 184. PMID 15 376 313.

31. Keyt BA, Nguyen HV, Berleau LT, Duarte CM, Park J, Chen H, Ferrara N. Identification of vascular endothelial growth factor determinants for binding KDR and FLT-1 receptors. Generation of receptor-selective VEGF variants by site-directed mutagenesis. J Biol Chem. 1996 Mar 8;271(10):5638−46. PMID:8 621 427.

32. Pieren M, Prota AE, Ruch C, Kostrewa D, Wagner A, Biedermann K, Winkler FK, Ballmer-Hofer K. Crystal structure of the Orf virus NZ2 variant of vascular endothelial growth factor-E. Implications for receptor specificity. J Biol Chem. 2006 Jul 14;281(28):19 578−87. Epub 2006 May 3. PMID:16 672 228 doi:10.1074/jbc.M601842200

33. W. J. Fairbrother, M. A. Champe, H. W. Christinger, B.A. Keyt, M. A Starovasnik, Solution structure of the heparin-binding domain of vascular endothelial growth factor. Structure 1998, 15; 6(5), 637−48.

34. Reviews: VEGF receptor signalling — in control of vascular function (Anna-Karin Olsson, Anna Dimberg, Johan Kreuger and Lena Claesson-Welsh).

35. Koch A.E., Harlow L.A., Haines G.K., Amento E.P., Unemori E.N., Wong W.L., Pope R.M. and Ferrara N. Vascular endothelial growth factor. A cytokine, modulating angiogenesis in rheumatoid arthritis. J. Immunol. 2014. 152, 4149−4156.

36. Folkman J. and Klagsbrun M. Angiogenic factors (review). Science. 2009. 235, 442−447.

37. Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 2003 Jun;9(6):669−76.