Анализ продуктов протеолиза бычьего фибриногена и коллагена типа I при помощи времяпролетной МАЛДИ масс-спектрометрии

Исследование реакций протеолиза, как правило, сопряжено с решением двух основных вопросов — установлением механизма расщепления белкового субстрата и выяснением специфичности действия протеиназы. Традиционным биохимическим подходом для решения этих вопросов является разделение продуктов реакции (с помощью, например, электрофореза или жидкостной хроматографии) с их последующим анализом (определение молекулярной массы, распределение той или иной метки, иммуноблоттинг, секвенирование и т. д.).

Появление методов мягкой ионизации (электроспрей (ЭС) и матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (МАЛДИ)) дало толчок бурному развитию масс-спектрометрии биомакромолекул. Эти методы ионизации сделали возможным переводить большие и чрезвычайно лабильные биомолекулы в газовую фазу и ионизировать их без деструкции. Преимуществом МАЛДИ относительно ЭС является формирование, в основном, однозарядных ионов — таким образом, спектр МАЛДИ белково-пептидных смесей дает возможность определить их качественный состав и массы входящих в них компонентов. Немаловажным фактором также является относительная толерантность метода МАЛДИ к присутствию в анализируемых образцах низкомолекулярных добавок (соли, детергенты, компоненты буферных растворов и т. п.), а так же высокая чувствительность и экспрессность метода.

Изучение возможностей МАЛДИ МС для анализа продуктов протеолиза сложных белковых субстратов, расширяющее использование самого метода, является актуальной задачей. Так, трипсинолиз белка с последующим получением спектра МАЛДИ триптических пептидов («фингерпринта» или «отпечатков пальцев»), которое также называется МАЛДИ-картированием, с его идентификацией по существующим базам данных является в настоящее время рутинной процедурой. С нашей точки зрения аналогичный подход весьма перспективен для изучения механизма протеолиза белков.

Предполагаемый алгоритм эксперимента в этом случае должен включать в себя проведение протеолиза белкового субстрата конкретной протеиназой, отбор проб через определенные промежутки времени, гель-электрофорез проб в денатурирующих условиях (ДДС-гель-электрофорез), трипсинолиз полученных полос, соотнесение полученных в масс-спектре пиков с теоретическими триптическими пептидами исходного белка и определение их положения в полипептидной цепи. Наложение идентифицированных пептидов, а так же массы вычисленной из гёль-электрофореграммы полосы на аминокислотную последовательность белка дает представление о том, какому участку исходной молекулы субстрата принадлежит данный высокомолекулярный продукт протеолиза. Подобный анализ всех полос электрофореграммы в динамике процесса покажет, какие участки белковой молекулы и каким образом подвергаются протеолизу с течением времени. Данный подход реализуем, если степень перекрывания масс триптических пептидов исходного субстрата в пределах определенной погрешности не очень велика. В настоящей работе в качестве модельного белкового субстрата был выбран бычий фибриноген.

Для расщепления белков, помимо трипсина, используют и другие агенты. При этом в зависимости от специфичности действия той или иной протеиназы образующиеся из одного и того же белкового субстрата МАЛДИ «фипгерпринты» сильно различаются между собой. В связи с этим возникает вопрос: возможно ли решение обратной задачи? Можно ли делать какие-либо выводы относительно специфичности действия протеиназ на основе «фингерпринта» продуктов протеолиза, если в качестве субстрата взять один и тот же белок?

Особенно остро этот вопрос стоит при скрининге коллагеназ. Коллагеназы имеют широкое применение в различных отраслях биотехнологии, медицины, промышленности. В зависимости от типа каждого конкретного применения используются различные коллагеназы.

Благодаря особенностям строения и наличию большого количества внутримолекулярных водородных связей и дополнительных межмолекулярных ковалентных поперечных сшивок, коллаген проявляет высокую устойчивость к действию протеолитических ферментов. Тем не менее коллагеназы способны разрушать нативный коллаген при физиологических условиях. Коллагеназы различаются строением активного центра и типом действием на коллаген. Можно ожидать, что набор продуктов гидролиза коллагена будет зависеть от специфичности действия конкретной коллагеназы.

Безусловно, для полной характеристики действия фермента на коллаген необходим анализ первичной структуры продуктов протеолиза, что требует проведения тандемного масс-спектрометрического эксперимента. Однако в случае коллагена масс-спектрометрическое секвенирование пептидов затруднено. Поэтому анализ действия коллагеназ различных классов на коллаген типа I в данной работе был проведен на основе сравнения МАЛДИ «фингерпринтов» продуктов реакций коллагенолиза без использования тандемной масс-спектрометрии.

Следует отметить, что условия проведения биохимических реакций в целом и протеолиза в частности накладывают серьезные ограничения на получение качественных и достоверных МАЛДИ масс-спектров белково-пептидных смесей. Наличие в образце низкомолекулярных добавок (соли, компоненты буферных растворов, детергенты и т. д.) обычно приводит к уменьшению интенсивности пиков молекулярных ионов исследуемых веществ. Тем не менее, при правильном и тщательном подборе условий пробоподготовки удается получить масс-спектры даже таких сложных систем, как биологические жидкости.

Таким образом, отработка условий пробоподготовки образцов для получения воспроизводимых и качественных МАЛДИ масс-спектров и увеличения выходов сигналов (выбор оптимальной матрицы, способа нанесения образца на мишень, процедур отмывки и рекристаллизации, варьирования мощности лазерного выстрела, а также самой подложки-мишени) является отдельной задачей в любом исследовании белково-пептидных смесей методом МАЛДИ масс-спектрометрии.

Целью настоящей работы явилось изучение новых возможностей метода МАЛДИ для определения механизма реакций протеолиза высокомолекулярных белковых субстратов на примере бычьего фибриногена, а также первичного скрининга коллагеназ (выяснение специфичности действия коллагенолитических ферментов разных классов на коллаген).

В работе решались следующие задачи:

1. Выбор модельного белка для изучения механизма его протеолиза методом МАЛДИ-картирования высокомолекулярных продуктов реакции. Изучение возможности применения МАЛДИ-картирования высокомолекулярных продуктов протеолиза для установления механизма расщепления бычьего фибриногена изоформой сериновой коллагенолитической протеиназы камчатского краба.

2. Отработка процедуры пробоподготовки реакционных смесей в ходе протеолиза белковых субстратов с целью получения воспроизводимых и качественных спектров МАЛДИ и увеличения выхода сигналов.

3. Проведение сравнительного анализа спектров МАЛДИ гидролизатов коллагена, полученных под действием коллагеназ разных классов. Изучение возможности первичного скрининга коллагеназ по МАЛДИ «фингерпринтам» продуктов гидролиза коллагена.

выводы.

1. Подобран модельный белковый субстрат (бычий фибриноген) для изучения механизма его протеолиза методом триптического МАЛДИ-картирования высокомолекулярных продуктов реакции. Проведен трипсинолиз и МАЛДИ-ВП МС анализ триптических пептидов высокомолекулярных продуктов протеолиза бычьего фибриногена изоформой сериновой коллагенолитической протеиназы камчатского краба в динамике процесса. Впервые показано, что подобный подход позволяет выявлять механизм протеолиза сложно организованных белков.

2. Отработана процедура пробоподготовки реакционных смесей в ходе протеолиза белковых субстратов с целью получения воспроизводимых и качественных спектров МАЛДИ и увеличения выхода сигналов.

3. На основании сравнительного анализа масс-спектров гидролизатов коллагена, полученных под действием коллагеназ разных классов, выявлено наличие характеристических пиков, относящихся только к действию конкретного ферментного препарата. Обнаружены общие пики в масс-спектрах гидролизатов, полученных под действием коллагеназ одного класса (цистеиновых коллагеназ). Показана потенциальная возможность применения МАЛДИ МС для первичного скрининга коллагеназ по «фингерпринтам» продуктов гидролиза коллагена.