Биохимические свойства транспортных белков потекс-и гордеивирусов, кодируемых первым из трех генов транспортного модуля

Транспорт вирусной инфекции в зараженном растении является в настоящее время одной из наиболее изучаемых проблем в молекулярной вирусологии растений. Исследование молекулярных механизмов этого процесса, являющегося, по-видимому, частным примером общей физиологической функции транспорта макромолекул в растениях, имеет не только важное теоретическое значение, но и существенно для разработки эффективных способов защиты растений от вирусной инфекции.

Ключевую роль в процессе вирусного транспорта выполняют кодируемые вирусом транспортные белки (ТБ), обеспечивающие перенос вирусного генома внутри клетки к плазмодесмам (ПД) — цитоплазматическим каналам, соединяющим соседние клетки растения, далее через ПД в здоровые клетки эпидермиса и мезофилла (межклеточный или ближний транспорт) и по сосудам флоэмы (дальний транспорт) (Carrington et al., 1996).

Реализация функции транспорта обеспечивается множественными функциональными активностями ТБ в процессе их взаимодействия с вирусными нуклеиновыми кислотами и различными вирусными и клеточными белками, участвующими в переносе вирусного генома. ТБ, кодируемые единственным геном у многих филогенетически далеких групп вирусов, несмотря на значительные отличия в первичной структуре, имеют сходные биохимические свойства. Например, для ТБ вируса табачной мозаики (ВТМ), вируса некротической мозаики красного клевера (ВНМКК) и вируса огуречной мозаики (ВОМ) было показано, что они эффективно взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами, связывают ГТФсодержат сигнал локализации в ПД, увеличивают пропускную способность ПД и способны переносить вирусную нуклеиновую кислоту к/через ПД (Carrington et al., 1996; Ghoshroy et al., 1997). Известно, что за эти активности ответственны функциональные субдомены ТБ, которые могут физически перекрываться.

Объектом настоящей работы являются ТБ, кодируемые первым геном тройного блока генов (ТБГ) представителей двух различных групп вирусовпотексвируса — Х-вируса картофеля (ХВК) и гордеивируса — полулатентного вируса мятлика (ПЛВМ). ТБГ представляет собой особый транспортный модуль, перекрывающиеся гены которого кодируют три ТБ, обозначаемых как ТБГр1, ТБГр2, ТБГрЗ (Morozov et al., 1989; Solovyev et al., 1996). Предполагается, что активности ТБ, кодируемых единственным геном, разнесены между тремя ТБ вирусов, имеющих в своем геноме ТБГ (Morozov et al., 1991). ТБГр2 и ТБГрЗ являются высоко гидрофобными белками и ассоциированы с мембранами (Morozov et al., 1990, 1991; Donald et al., 1993) и клеточными стенками (Hefferon et al., 1997). ТБГр1 белок содержит семь консервативных аминокислотных мотивов, характерных для суперсемейства I РНК НТФаз/хеликаз (Gorbalenya and Koonin et al., 1993). Поскольку транспорт вирусного генома требует значительных затрат энергии практически на всех этапах этого процесса, наличие собственной АТФазной активности у ТБ, видимо, является эволюционным приобретением вирусов с ТБГ с целью повышения эффективности распространения вирусной инфекции в зараженных растениях. Детальное изучение биохимических свойств ТБГр1 белков и локализация субдоменов этих белков, ответственных за различные активности, важны как для изучения молекулярных механизмов транспорта вирусов с ТБГ, так и для понимания общих принципов функционирования системы транспорта макромолекул (белков и нуклеиновых кислот) в растении.

Целью настоящей работы было исследование некоторых биохимических свойств ТБ, кодируемых первым геном ТБГ потексвируса ХВК и гордеивируса ПЛВМ, а также субклеточной локализации ТБГр1 белка.

ХВК в зараженных растениях. В ходе исследования решались следующие задачи:

— получение бактериальных штаммов-продуцентов рекомбинантных ТБ — 25 кДа белка ХВК и 63 кДа белка ГОШМ и серии их мутантных вариантов;

— изучение НТФазной и РНК-связывающей активностей 25 кДа белка ХВК и 63 кДа белка ПЛВМ и их мутантов;

— выявление функциональных суб доменов ТБГр1 белков, ответственных за эти активности;

— получение поливалентной антисыворотки к 25 кДа белку ХВК и изучение кинетики синтеза и субклеточной локализации этого белка в растениях табака ШсоНапа 1аЪасит, зараженных ХВК.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

При заражении растений вирусы проникают в ограниченное число первично инфицированных клеток. Для успешного развития инфекции необходимо, чтобы вирус из первично инфицированных клеток растения попал в близлежащие здоровые клетки. Для системного инфицирования растения вирус должен проникнуть в проводящую систему растения, а затем покинуть ее для дальнейшего межклеточного транспорта в незараженном листе. Данный обзор литературы посвящен проблеме межклеточного транспорта вирусов в растении.

Структура плазмодесм.

Наиболее очевидным и, видимо, единственным путем перемещения вируса из клетки в клетку является его переход через плазмодесмы. ПДтонкие цитоплазматические каналы, соединяющие соседние клетки растений — играют важную роль в коммуникации клетка-клетка и распределении воды и питательных веществ в растении (Deom et al., 1992). ПД, которые формируются в процессе цитокинеза (первичные ПД), первоначально возникают как тубулярные структуры, ограниченные цитоплазматической мембраной, диаметром около 25−30 нм (рис. 1). Внутри таких структур позже образуется аксиальный компонент, называемый десмотрубочкой, которая состоит из спрессованной мембраны эндоплазматического ретикулума двух соседних клеток (Overall and Blackman, 1996). С помощью высокоразрешающего электронного микроскопа были обнаружены белки, встроенные в плазматическую мембрану (Р2), и эндоплазматический ретикулум (PI). Эти белки соединяли «мостики» из белка, которые разделяют ПД на микроканалы (Overall and Blackman, 1996). В разрезе ПД делится на 10−20 дискретных цилиндрических каналов, каждый из которых имеет радиус 1,5−3,0 нм (Robards, 1975; Terry and Robards, 1987). При поперечном сечении ПД обнаруживается, что эти каналы образованы окружающими десмотрубочку глобулярными структурами, каждая из которых имеет диаметр около 5 нм (Robaras, 1975). мк.

L Р2.

Рис. 2 Схема устройства сложной развлетленной плазмодесмы (из Lucas and Gilbertson, 1994).

ДТ.

Рис. 1 Схема устройства плазмодесмы (из Lucas and Gilbertson, 1994). Сверху — продольное сечение, правеепоперечное сечение. КС — клеточная стенка, СПсрединная пластинка, ДТдесмотрубка, МК-микроканал, PI, Р2, L — белки плазмодесм ПМ-плазматическая мембрана.

Механизм, контролирующий местоположение и плотность первичных ПД неизвестен, но показано, что во всех клеточных стенках в пределах меристемы первичные ПД представлены с высокой частотой расположения (Lucas and Gilbertson, 1994). ПД, обазующиеся после цитокинеза (вторичные ПД), формируются в результате слияния плазматических мембран. Простые вторичные ПД могут образовываться на новом месте в результате инвагинации плазматической мембраны и эндоплазматического ретикулума в клеточную стенку одновременно с двух сторон. Чаще сложные вторичные ПД (рис. 2) образуются из первичных (Ding et al., 1992). Формирование вторичных ПД необходимо для нормального функционирования листа. Блокирование образования вторичных ПД в клетках мезофилла табака коррелирует с началом ускоренного старения (Ding et al., 1993).

Белковый состав ПД до конца не изучен, однако, известно, что белки с молекулярными массами 26 и 27 кДа (РАР26 и РАР27) являются компонентами ПД (Yahalom et al., 1991; Kotlizky et al., 1992). Эти белки иммунологически гомологичны белкам семейства коннексинов, выделенных из межклеточных соединений клеток животных. Клеточное фракционирование показало, что РАР27 содержится в мембранной фракции, а РАР26 ассоциирован с клеточными стенками. В центре десмотрубочки находятся белковые частицы, связанные нитчатыми структурами с белковыми глобулами на наружной поверхности эндоплазматического ретикулума, что помогает поддерживать структуру десмотубулы (Citovsky et al., 1993). Белковые глобулы на поверхности десмотубулы, вероятно, представлены актином, поддерживающим структуру ПД, так как актин был локализован в ПД и при обработке протеазами или цитохалазином, разрушающим актин, увеличивается диаметр ПД, особенно в районе «шеи» (участок ПД, плотно прилегающий к клетке) (Overall and Blackman, 1996). В области «шеи», а также в области центральной полости (у некоторых ПД есть в середине слегка увеличенная полость между плазматической мембраной и десмотрубочкой) обнаружены белковые спицы, соединяющие актиновые глобулы с белками плазмалеммы. Скорее всего, они состоят из миозина (Overall and Blackman, 1996; Citovsky et al., 1993).

В плазматической мембране в районе «шеи» есть якорные белки, взаимодействующие с сократительными белками и с предполагаемым внеклеточным сфинктером (возможно, эти внеклеточные структуры обеспечивают заякоривание компонентов ПД на клеточной стенке). Сократительные белки связывают плазматическую мембрану с эндоплазматическим ретикулумом в районе «шеи» и представлены, по.

2| видимому, центрином — С асвязывающим фосфопротеином, основным белком ряда нитчатых структур. Эти структуры быстро сокращаются при повышении внутриклеточной концентрации Са, а их удлинение АТФ-зависимо и сопряжено с фосфорилированием.

Результаты опытов по микроинъекции флуоресцентно-меченных молекул декстрана разного размера и данные электронной микроскопии показали, что предельная пропускная способность (ППС) ПД клеток мезофилла здоровых растений составляет 1 кДа, причем вычисленный радиус Стокса для молекул такой массы, равный 0,75 нм, соотносился с диаметром (1,5 нм) микроканалов (Wolf et al., 1989). Недавние эксперименты с использованием новых низкомолекулярных флуоресцентных красителей свидетельствуют о том, что ПД играют большую роль в процессе развития растений. Эмбрионы высших растений объединены в простой симпласт, где цитоплазма всех клеток соединяется между собой посредством ПД. В процессе развития растения отдельные группы клеток становятся изолированными, причем основную роль здесь играют именно ПД, которые по какой-то причине перестают функционировать. Такая изоляция приводит к тому, что отдельные компартменты растения функционируют независимо друг от друга, что позволяет рассматривать зрелое цветущее растение как мозаику симпластических доменов (McLean et al., 1997). При этом система является динамичной и в ответ на физиологические условия, условия внешней среды, ППС ПД может уменьшаться или полностью элиминироваться, предотвращая транспорт, либо увеличиваться, позволяя перемещаться через ПД большим молекулам (Ghoshroy et al., 1997).

Размер ПД значительно меньше размера вирусных частиц и произвольно свернутой нуклеиновой кислоты. Было обнаружено, что фосфоинозитиды, а также (З-глюкан (каллоза) способствуют уменьшению проницаемости ПД (Baron-Eppel et al., 1988; Wolf et al., 1989). Работы последних лет представили доказательства участия эндогенных макромолекул в изменении ППС ПД в растении. Например, показано, что транскрипционный фактор из кукурузы гомеодоменный белок KNOTTED 1 (KN1) передвигается из клетки в клетку. В процессе развития кукурузы мРНК, кодирующая KN1, выявляется во всех меристемных слоях, включая наружный. Эксперименты по микроинъекции показали, что белок увеличивает ППС ПД до 40 кДа и участвует в транспорте своей мРНК (Lucas et al., 1995).

В опытах по ко-инъекции комплекса KN1 белка с частицами золота (615 нм) и ТБ В ОМ в растения показано, что только при молярном соотношении 1:7000 ТБ ВОМ способен блокировать межклеточный транспорт комплекса KN1 с частицами золота. Подобные результаты были получены и при использовании этого комплекса и свободного KN1. В опытах с использованием ТБ ВТМ и комлекса ТБ ВТМ с частицами золота (15 нм) было показано, что комплекс блокирует транспорт свободного ТБ ВТМ. Кроме того, показано, что этот комплекс предотвращает транспорт KN1 белка (присутствующего в инфицированных клетках в соотношении 1:70). Эти результаты свидетельствуют в пользу того, что KN1 белок и ТБ ВОМ и ВТМ, вероятно, используют один и тот же рецептор в ПД растения для межклеточного транспорта (Kragler et al., 1998). По аналогии с другими транспортными процессами, в частности, транспорта макромолекул через комплекс ядерной поры, предполагают, что процесс транслокации включает три последовательных шага: KN1 связываясь с шапероном и/или рецептором в ПД, способствует увеличению ППС, белок транспортируется через микроканалы ПД при участии «транслокационной системы» и далее белок высвобождается в цитоплазме соседних клеток (Kragler et al., 1998).

Получены доказательства транспорта белков при изучении флоэмного сока. В нем были обнаружены белки с молекулярной массой 10−200 кДа. Предполагается, что эти белки транспортируются в ситовидные элементы через ПД, связывающие их с клетками-спутниками, так как зрелые ситовидные элементы лишены ядра и белок-синтезирующего аппарата. При этом транспорт является селективным, поскольку не все белки, найденные в клетках-спутниках, выявляются в ситовидных элементах (Seron and Haenni, 1996). Результаты опытов по микроинъекции ФИТЦ-декстранов подтверждают гипотезу о том, что большинство (или все) белки флоэмного сока взаимодействуют с рецепторами ПД клеток мезофилла и увеличивают ППС и транспортируются из клетки в клетку (Balachandran et al., 1997).

В последних сообщениях было показано, что СшРР16 белок, выделенный из Cucurbita maxima, обладает свойствами вирусных транспортных белков (Xoconoste-Cazares et al., 1999). Результаты опытов по микроинъекции показали, что CmPPlo белок транспортируется из клетки в клетку и выполняет роль «посредника» при транспорте для РНК.

Общая характеристика межклеточного транспорта вируса в растении.

В настоящее время точный молекулярный механизм межклеточного транспорта вирусов не ясен. В течение последних нескольких лет была экспериментально подтверждена предложенная гипотеза (Atabekov and Dorokhov et al., 1984) о том, что большинство вирусов растений кодируют белки, не участвующие прямо в репликации вирусного генома, но необходимые для передвижения вируса из места репликации в первично зараженной клетке в соседние здоровые клетки. Это так называемые транспортные белки.

Межклеточный транспорт рассматривают как процесс, состоящий из трех основных этапов: 1) перенос вирусного генома из места репликации для последующего внутриклеточного транспорта- 2) транспорт вирусного генома к ПД- 3) перенос вирусного генома через ПД.

Репликация большинства +РНК-содержащих вирусов проходит в цитоплазме в ассоциации с поверхностью мембран. Репликация некоторых других типов вирусов таких, как одноцепочечные ДНК геминивирусов и некоторыхРНК-содержащих вирусов проходит в ядре. Возможно, что инициация процесса внутриклеточного транспорта осуществляется в результате взаимодействия ТБ с белками, участвующими в репликации.

Кроме того, для некоторых вирусов показано, что белки, участвующие в репликации, действуют как модуляторы межклеточного и дальнего транспорта (Carrington et al., 1996). Интересные результаты были получены для потивирусов. Было показано, что С1 белок, необходимый для репликации геномной РНК, выполняет также функцию ТБ (Carrington et al., 1998).

Внутриклеточный транспорт комплекса ТБ-вирусный геном, возможно, происходит при участии компонентов, ассоциированных с цитоскелетом (Carrington et al., 1996).

Предполагается, что ТБ взаимодействует и связывается с некими хозяйскими рецепторами, локализованными в ПД, что способствует распространению вирусной инфекции через ПД. Как было предложено (Atabekov and Talyansky, 1990) узнавание между хозяйскими факторами и ТБ требует некоторого сродства между ними и уровень этого сродства может варьировать для различных комбинаций ТБ вируса-факторы растения хозяина. Согласно этому предположению, при полном отсутствии сродства (например, в нехозяйских растениях) между ТБ и хозяйским фактором вирус остается только в первично инфицированных клетках растения, что играет важную роль в определении круга хозяев вируса.

ТБ, кодируемые единственным геном у многих филогенетически далеких групп вирусов, несмотря на значительные отличия в первичной структуре, имеют сходные биохимические свойства.

Было показано, что вирусные ТБ модифицируют размеры ПД. Используя меченные соединения, обнаружили, что в трансгенных по гену 30 кДа ТБ ВТМ растениях размер ПД увеличивался — если в контрольных растениях ПД пропускают молекулы размером до 850 Да, то в трансгенных растениях размер ПД увеличивался так, что они были способны пропускать молекулы с молекулярной массой до 10 кДа. Возможно, что 30 кДа ТБ ВТМ способен входить во вторичные ПД и взаимодействовать с эндогенными белками ПД и таким образом увеличивать ППС (Lucas and Gilbertson, 1994; Wolf et al., 1991). В опытах по микроинъекции ТБ также показано, что имеет место увеличение ППС ПД (Waigmann et al., 1994; Carrington et al., 1996; Ghoshroy et al., 1997) и в комплексе с нуклеиновыми кислотами ТБ могут перемещаться через ПД (Fujiwara et al., 1993; Ding et al., 1995).

Перенос комплекса ТБ-вирусный геном через ПД, видимо, состоит из трех этапов — связывание с поверхностью ПД, перенос комплекса через пору и высвобождение генома в соседних клетках растения. Связывание комплекса ТБ-вирусный геном с ПД, вероятно, происходит с участием неких рецепторов или заякоривающих белков, расположенных на поверхности ПД. Транспорт комплекса в ПД, возможно, происходит без участия компонентов, ассоциированных с цитоскелетом, вовлеченных во внутриклеточный перенос. Скорее всего транспорт такого комплекса является активным процессом, в котором геном вируса и ТБ транспортируются через ПД в результате взаимодействия с транспортными механизмами ПД. Этот транспортный механизм обеспечивается функционированием сопутствующих белков, шаперонов и/или молекулярных моторов (Carrington et al., 1996). Механизм высвобождения комплекса в соседние клетки мало изучен.

Если провести аналогию с другими транспортными процессами, то, вероятно, процесс транспорта является энергозависимым (Carrington et al., 1996). Существует как минимум три этапа, где может использоваться энергия гидролиза НТФ: 1) внутриклеточный транспорт ТБ и/или вирусспецифического РНП к клеточной стенке (к ПД или компартмент, расположенный поблизости от ПД) — 2) увеличение Ш 1С ПД- 3) перенос белков или РНП через ПД (Ghoshroy et al., 1997; Heinlein et al., 1998; Boevink et al., 1998). Для многих ТБ показано, что они обладают способностью связывать и гидролизовать НТФ, что, вероятно, нужно для того, чтобы обеспечить этот процесс необходимой энергией.

Сравнение аминокислотных последовательностей ТБ разных групп вирусов растений позволило выявить четыре основных суперсемейства: 30К-суперсемейство (названо по молекулярной массе ТБ ВТМ), суперсемейство белков, закодированных тройным блоком транспортных генов, суперсемейство тимовирусных ТБ и суперсемейство геминивирусных ТБ (Koonin et al., 1991; Mushegian et al., 1993). До сих пор непонятно, используют ли разные вирусы растений для межклеточного транспорта одну и ту же хозяйскую систему транспортировки макромолекул, однако очевидно, что существует более одного механизма собственно вирусного транспорта. При этом механизм, используемый тем или иным вирусом, не определяется типом ТБ. Часто вирусы, кодирующие ТБ, относящиеся к разным суперсемействам, используют один и тот же механизм межклеточного транспорта, в то время как близкие по последовательности ТБ обеспечивают разные пути транспорта (McLean et al., 1997; Santa Cruz et al., 1998). Более того, известно, что один и тот же вирус может использовать разные стратегии межклеточного транспорта на разных стадиях развития инфекции или в разных типах ткани (Jansen et al., 1998; Waigmann et al., 1995).

Часто в процесс межклеточного транспорта могут вовлекаться дополнительные вирусспецифические белки, например репликаза (Petty et al., 1994). Однако, согласно последним представлениям, именно участие белка оболочки (БО) определяет механизм межклеточного транспорта вируса. На основе этого выделяют два механизма межклеточного транспорта вируса: 1) межклеточный транспорт не зависит от присутствия БО, такой механизм транспорта присущ ВТМ (Takamatsu et al., 1987) — 2) межклеточный транспорт требует присутствия БО, такой механизм межклеточного транспорта присущ, например, вирусу мозаики коровьего горошка (Wellink et al., 1989; Van Lent et al., 1990). В данном случае межклеточный транспорт идет с образованием так называемых тубулярных структур. Отдельную группу составляют вирусы, чей межклеточный транспорт требует участия БО, но образования тубулярных структур при этом не наблюдается. Сюда относятся, например ХВК и вирус мозаики костра.

Системы межклеточного транспорта вирусов растений.

Вирус табачной мозаики.

Тобамовирусы — группа палочковидных вирусов растений с +РНК-геномом. Типовой представитель тобамовирусов — вирус табачной мозаики (ВТМ) является модельным объектом современной молекулярной вирусологии.

126К ЗОК БО 1.

183К.

Рис. 3. Схема организации генома ВТМ. Прямоугольники — ОРТ, эллипс — кэп-структура на 5'-конце, тРНК-подобная структура на З'-конце.

Геномная РНК кодирует три неструктурных белка (126, 183 и 30 кДа) и белок оболочки (Beachy et al., 1976; Bruening et al., 1976) (рис. 3). 126 и 183 кДа белки, предполагаемые компоненты РНК-полимеразы) транслируются непосредственно с геномной РНК, причем 180 кДа белок синтезируется при супрессии слабого ашЬег-терминирующего ко дона гена 130 к Да белка (Pelham et al., 1978). БО и 30 кДа ТБ кодируются с различных 3'-котерминальных субгеномных РНК (Dawson and Lehto, 1990).

Первые доказательства транспортной роли 30 кДа белка ВТМ были получены при изучении дефектных по транспорту мутантов ВТМ. Транспорт таких мутантов был возможен при низкой (пермиссивной) температуре — 22°, но не при высокой — 32°. Определение аминокислотной последовательности показало, что в отличие от родительского штамма, у 30 кДа белка температуро-чувствительного мутанта Lsl присутствует единственная замена пролина на серин в положении 154 (Ohno et al., 1983).

Введение

аминокислотной замены, характерной для 30 кДа белка Lsl (пролин заменяли на серин), в инфекционную кДНК копию ВТМ приводило к Lsl фенотипу (Meshi et al., 1987). Было установлено, что 30 кДа белок штамма другого температуро-чувствительного мутанта № 2519 содержит замену аргинина на глицин в положении 144 (Zimmern and Hunter, 1983).

Atabekov and Dorokhov, 1984 предположили, что межклеточный транспорт вирусной инфекции может осуществляться в форме вирусспецифических рибонуклеопротеиновых комплексов (вРНП). Возможными компонентами таких комплексов являются вирусные РНК, ТБ и, возможно, клеточные факторы. Вирусспецифические РНП комплексы были впервые обнаружены в инфицированных ВТМ клетках табака по отличной от частиц зрелого вируса плавучей плотности в CsCI (Dorokhov et al., 1983, 1984). Saito et al., 1988 выявили домен в составе 30 кДа белка, богатый основными аминокислотами. Было сделано предположение о том, что этот домен отвечает за связывание с РНК. Позже Citovsky et al., 1990 продемонстрировали образование комплекса 30 кДа-РНК in vitro. Данные по электронной микроскопии показывают, что 30 кДа белок может разворачивать свернутые молекулы РНК, формируя длинные и тонкие вРНП диаметром около 2 нм (Citovsky et al., 1992). На основании этих данных была предложена модель, по которой глобулы ТБ «одевают» вирусную РНК по всей длине, наподобие SSB белков Е. coli. Диаметр РНП комплекса соответствовал размеру модифицированных плазмодесм, что свидетельствует в пользу гипотезы о том, что такие комплексы выполняют роль транспортных интермедиатов in vivo. Надо отметить, что мутации в 30 кДа белке, приводящие к неспособности ТБ связываться с РНК, приводят к полной потере транспортной функции ВТМ (Citovsky et al., 1992).

Представляется маловероятным, что протяженная молекула вРНП комплекса достигает ПД в результате пассивной диффузии. Было сделано предположение, что и межклеточный транспорт и внутриклеточное перемещение к ПД являются активными процессами (Zambryski, 1995). Связывание 30 кДа белка с цитоскелетом позволяет допустить, что транспортный комплекс перемещается внутри цитоплазмы по микротрубочкам, а затем направляется по актиновым филаментам через ПД (McLean et al., 1996). Reichel et al., 1998 предполагают, что внутриклеточный транспорт ТБ, также как и межклеточный транспорт ВТМ, происходит в результате через эндоплазматический ретикулум. Авторы преполагают, что в этом процессе участвуют микротрубочки. Ассоциация ТБ ВТМ с эндоплазматическим ретикулумом на ранней стадии развития инфекции и последующие морфологические изменения эндоплазматического ретикулума может подтверждать, что этот клеточный компартмент участвует во внутриклеточном транспорте (Reichel et al., 1998).

В последних обзорах рассматривается возможность участия актиновых филаментов также и в процессе обратимого открывания ПД (Overall and Blackman, 1996; McLean et al., 1997). Согласно одной из моделей транспорт через ПД может регулироваться изменением упаковки актиновых филаментов, которые входят в состав белков ПД в районе шейки. Альтернативная модель предполагает увеличение ППС ПД за счет регулирования сжатия десмотрубочки. В этом процессе могли бы также участвовать актиновые филаменты (Overall and Blackman, 1996; McLean et al, 1997).

Предполагалось, что третичная структура ТБ играет важную роль для РНК-связывающей активности, так как денатурация 30 кДа, ведущая к дестабилизации третичной структуры, и к увеличению числа положительно заряженных аминокислотных остатков, снижает РНК-связываюшую активность белка (Li et al, 1996). Также было показано, что 30 кДа белок связывает ГТФ, что предполагает существование каких-то взаимодействий комплекса с предполагаемой ГТФазой, которая ассоциирована с плазмодесмой (1л е1 а1., 1996).

На рис. 4 показаны функциональные домены 30 кДа ТБ ВТМ (Waigmann е1 а1., 1994). Делеционный анализ показал, что С-конец не требуется для индуцированного увеличения ППС плазмодесм и межклеточного транспорта (Вегпа е1 а1., 1991). 19 аминокислотных остатков (195−213), не являющимися высококонсервативными среди тобамовирусов, важны для увеличения ППС (Вегпа е1 а1., 1991). Домен (Е), захватывающий не менее 81 аминокислотных остатков, участвует в увеличении ППС ПД и быть важен для правильной укладки белка (Waigmann е1 а1., 1994).

Е (130−213) увеличение ППС D (240−268) взаимодействие с КС фосфорилирование.

I-1.

С (65−86) А (112−185) В (185−268) конформация РНК-связывание РНК-связывание.

Рис. 4. Расположение основных функциональных доменов 30 кДа ТБ ВТМ (по Waigmann et al., 1994).

Интересно, что делеция 110 аминокислотных остатков на N-конце 30 кДа ТБ не влияет на эффективность связывания с РНК и не приводит к потере способности увеличивать ППС, более того, это обеспечивает более эффективную диффузию 10 кДа молекул декстрана по сравнению с белком дикого типа (Waigmann et al., 1994). Эти данные не совсем согласуются с результатами, согласно которым N-концевые делеции 30 к Да белка либо исключают, либо замедляют транспорт ВТМ (Gafny et al., 1992). С-концевой участок 30 кДа белка содержит предполагаемый домен фосфорилирования белка (Atkins et al., 1991). Было показано, что клеточная протеинкиназа фосфорилирует 30 кДа белок по Ser258, Ser265 и Thr261. Активность протеинкиназы возрастает в зрелых листьях (Citovsky et al., 1993) и, повидимому, зависит от числа вторичных ПД, которые являются местом локализации ТБ (Ding et al., 1992). Предполагают, что фосфорилирование, изменяющее заряд молекулы, представляет механизм инактивации ТБ. Делеция 43 аминокислотных остатков с С-конца 30 кДа белка приводит к потере способности к фосфорилированию. Эти данные совпадают также с данными Watanabe et al., 1992. Интересно, что фосфорилирование Thr261, который находится в составе РНК-связывающего домена, не влияет на образование РНП комплекса (Citovsky et al., 1993).

Было показано, что 30 кДа ТБ аккумулируется в ПД растений (Tomenius et al., 1987). Позже Atkins et al., 1991 в опытах по иммуномечению золотом обнаружил, что ТБ локализуется внутри (или на поверхности) ПД, трансгенных по гену 30 кДа белка ВТМ растений. В опытах с использованием флуоресцентно меченого F-декстрана было показано, что в трансгенных растениях по гену 30 кДа белка, ППС ПД увеличивается до 5−6 нм, что соответствует молекуле декстрана с молекулярной массой 10−17 кДа (Wolf et al., 1989). Интересно, что в случае инъекции в клетки здорового растения очищенного 30 кДа белка, ППС ПД увеличивается до 6−9 нм, что соответствует молекулам декстрана с молекулярной массой 20 кДа (Citovsky et al., 1990). Интересные результаты были получены Waigmann and Zambryski, 1995. Было показано, что ППС ПД клеток трихомы (отличающихся от клеток мезофилла) не увеличивается в присутствии 30 кДа ТБ. ПД клеток трихомы способны пропускать молекулы большего размера (до 7 кДа), чем ПД клеток мезофилла. Видимо, ППС ПД клеток трихом не регулируется. В этих же опытах было обнаружено, что гибридный ТБ ВТМ, слитый с Р-глюкуронидазой (GUS), самостоятельно перемещается из клетки в клетку, в то время как при совместной микроинъекции ТБ и GUS, (3-глюкуронидаза оставалась в пределах первичной клетки. В связи с этим предполагают две модели, которые могут объяснить особенности транспорта в трихомах: 1) 30 кДа белок после взаимодействия с неким клеточным шапероном расправляется, что позволяет ему пройти через ПД, 2) ввиду большей толщины клеточной стенки в трихомах в сравнении с мезофиллом, длина ПД увеличена, если предположить, что ТБ несет сигнал для быстрого изменения 1111С, то возможно, что ПД между клетками трихомы открываются не сразу, а по мере прохождения ТБ, за которым могут не успеть декстраны, свободно диффундирующие в цитоплазме (Waigmann and Zambryski, 1995; McLean et al, 1997).

В 1992 г. Ding et al. показали, что в трансгенных растениях ТБ преимущественно накапливается во вторичных ПД несосудистых тканей и локализуется вместе с микротрубочками и в меньшей степени с актиновыми филаментами (McLean et al., 1995; Heinlein et al., 1995). Было показано, что протопласты, инфицированные ВТМ дикого типа или модифицированным ТБ ВТМ 30 кДа-GFP, содержали ТБ или ТБ-GFP, ассоциированные с кортикальными микротрубочками. Эти данные подтверждаются экспериментами in vitro по связыванию ТБ с актином и тубулином (McLean et al., 1995).

Таким образом, приведенные выше данные свидетельствуют о том, что все стадии межклеточного транспорта вируса являются активными процессами. Функция ТБ, по-видимому, сводится к увеличению ППС ПД и приданию вирусной РНК конформации, необходимой для прохождения через ПД. ТБ имеет сигнал локализации в ПД, он сам перемещается в район ПД и перемещает вирусный РНП. Показано, что вирусная РНК в составе РНП комплекса с ТБ выводится из процесса репликации и вовлекается в межклеточный транспорт (Karpova et al., 1997). В процессе перемещения через ПД нетранслируемый РНП комплекс дестабилизируется белками ПД и/или происходит его разборка, РНП комплекс переходит в транслируемую форму и во вновь зараженной клетке опять начинается репликация вируса. Возможно, определенную роль в этом процессе играет фосфорилирование ТБ (Karpova et al., 1999).

Вирус мозаики костра.

Бромовирус мозаики костра является икосаэдрическим вирусом. Геном представлен тремя +РНК (рис. 5), независимо инкапсидирующимися. РНК1 и РНК2, необходимые и достаточные для репликации ВМК в протопластах (Kroner et al., 1989, 1990), кодируют соответственно репликативные белки 1а и 2а, которые способны связываться друг с другом и с неидентифицированными хозяйскими факторами и клеточными мембранами клетки, формируя вирусный репликативный комплекс (Sun and Као, 1997; O’Reilly et al., 1997, 1998). РНКЗ кодирует ТБ За и БО 36, которые не участвуют в репликации вируса, но необходимы для межклеточного транспорта ВМК (Schmitz and Rao, 1996).

РНК1.

CL la.

PHK2 Г.

0.

2a.

РНКЗ лГ.

0.

За.

ЗЬ if.

Рис. 5. Схема организации генома ВМК, большие прямоугольники — ОРТ, эллипсы — кэп-структура на 5'-конце, тРНК-подобная структура на 3'-конце.

Скорее всего ВМК использует механизм транспорта, описанный для комовирусов (Wellink and Van Kammen, 1989; Van Lent et al., 1990; Kasteel et al., 1997), неповирусов (Wieczoreck and Sanfacon, 1993) и каулимовирусов (Perbai et al., 1993) (см. дальше).

Было показано, что За белок подобно 30 кДа ТБ неспецифически связывается с одноцепочечными нуклеиновыми кислотами (Jansen et al., 1998; Fujita et al., 1998). Fujita et al., 1998 продемонстрировал, что За ТБ выявляется (иммунологически) в районе ПД.

Для межклеточного транспорта вируса необходимо присутствие БО (Rao and Grahtham, 1996). Предположение о необходимости инкапсидации РНК ВМК для межклеточного транспорта было подтверждено работой Kasteel et al, 1996, в которой было показано, что у клеточной поверхности протопластов, зараженных ВМК, наблюдается образование тубулярных структур, состоящих из-За белка, которые содержали вирионы ВМК. В настоящее время существует две противоположные версии о роли БО в межклеточном транспорте ВМК. В опытах с использованием мутантов ВМК по БО было показано, что для системного распространения вируса в ячмене необходим БО. При заражении этими мутантами наблюдались локальные некрозы на Chenopodium hybridum, что свидетельствовало о том, что для ближнего транспорта БО не нужен (Flasinski et al, 1995). Однако эти данные противоречат результатам, полученным Rao and Grahtham, 1995, которые показали, что мутанты по БО не вызывают некротической и хлоротической реакции на листьях некоторых видов Chenopodium, включая Chenopodium hybridum. Мутанты, в которых вместо БО экспрессировался GUS, либо БО просто делетировался, не покидали первично инокулированные клетки эпидермиса листа Chenopodium quinoa. Было также показано, что мутант по За ТБ был не способен комплементировать транспорт в соседние клетки эпидермиса указанных мутантов по БО. Одно из объяснений этому заключается в том, что, возможно, имеет место конкуренция и один из вариантов подавлял другой. Второе объяснение заключается в том, что необходима инкапсидация вирусных РНК ВМК для межклеточного транспорта (Schmitz and Rao, 1996). Авторы предполагают, что, возможно, неидентифицированные сайты связывания с БО на РНКЗ находятся внутри делетированной последовательности у мутантов по БО, и тогда синтезированный БО с РНКЗ, мутантной по ТБ, оказывается не способным инкапсидировать РНКЗ с делецией по БО.

В опытах с использованием различных делеционных вариантов по БО было показано, что первые 19 аминокислотных остатков БО важны для инкапсидации и инфекционности. Было показано, что при выделении вируса из инокулированных листьев, с делецией первых 11 аминокислотных остатков в БО, количество его было на 50% ниже, чем в случае вируса дикого типа, и соответственно на 60% и 80% ниже в случае вируса с делецией 14 и 18 аминокислотных остатков. После соответствующего окрашивания препаратов было показано, что они содержат икосаэдрические вирионы, похожие на вирионы дикого типа (Rao and Grantham, 1996). Первые 25 положительно заряженных аминокислотных остатков БО важны для связывания с РНК, делеция этих аминокислотных остатков приводит к нарушению образования вирионов и потере инфекционности. Недавние эксперименты in vivo показали, что минимальный участок последовательности БО, необходимый для образования вирионов, составляет 19 аминокислотных остатков (Rao and Grantham, 1996).

Таким образом, За ТБ ВМК с одной стороны обладает способностью связываться с нуклеиновой кислотой, что указывает на возможность межклеточного транспорта вируса по механизму ВТМ, а с другой стороныЗа ТБ образует тубулярные структуры для межклеточного транспорта вирионов.

Вирус огуречной мозаики.

Геном кукумовируса огуречной мозаики представлен тремя одноцепочечными +РНК (Palukaitis et al., 1992). РНК1 и PHK2 кодируют компоненты РНК-зависимой РНК-полимеразы. РНКЗ кодирует 30 кДа (За) ТБиБО.

Свойства За ТБ подобны свойствам, описанным для ТБ ВНМКК и ВТМ (Fujiwara et al., 1993; Waigmann et al., 1994; Ding et al., 1995).

Возможно, что За ТБ функционирует как шаперон для транспорта РНК через плазмодесмы (Ding et al., 1995), как это предполагается для 30 кДа ТБ ВТМ.

В опытах с использованием электронной микроскопии показали, что в пределах ПД инфицированной В ОМ ткани растения, находятся вирионы. На основе этого сообщения было сделано предположение, что межклеточный транспорт ВОМ осуществляется в форме вириона через структурно модифицированные ПД. Однако в последующих исследованиях с использованием метода иммуномечения вирионы ВОМ не были обнаружены в инфицированных тканях растения (Ding et al., 1995). Эти данные подтверждаются результатами опытов Kaplan et al., 1998, в которых также было показано, что образования вирионов не требуется для межклеточного транспорта.

В опытах с использованием мутантов по БО ВОМ с делецией 19 N-концевых аминокислот или с делецией участка БО, содержащего кластер из шести аргининов в N-концевом домене, было показано, что вирус способен транспортироваться из клетки в клетку, хотя сборка вирионов нарушена (Schmitz and Rao, 1998).

Было показано, что За ТБ ВОМ обнаруживается во вторичных ПД мезофилла растения, инфицированного ВОМ (Ding et al., 1995), а также в клеточной стенке трансгенного по гену За ТБ N. tabacum (Vaquero et al., 1994). За ТБ увеличивает ППС ПД и участвует в переносе вирусной РНК, видимо, в составе РНП комплекса через ПД (Ding et al., 1995).

С. quinoa — пермиссивный хозяин для ВОМ и ВМК. Была получена химерная конструкция ВМК, содержащая ТБ ВОМ. Протопласты заражали химерной конструкцией дикого типа и конструкцией, содержащей мутантный ТБ ВОМ (Nagano et al., 1997). Данные этих экспериментов показали, что 33 аминокислотных остатка с С-конца ТБ ВОМ отвечают за специфичность транспорта вирусного генома. Известно, что для межклеточного транспорта ВОМ требуются ТБ, БО и другие вирусные компоненты (Canto et al., 1997). Результаты экспериментов показали, что в случае использования конструкции с интактным ТБ ВОМ, ТБ не способен успешно взаимодействовать с белками ВМК, однако, удаление 33 аминокислотных остатков с С-конца ТБ ВОМ приводит к успешному межклеточному транспорту вируса (Nagano et al., 1997). На основе этих данных было высказано предположение, что связывание между ТБ и РЕПС ВОМ in vivo специфическое, и за специфичность отвечает 33 аминокислотных остатка, расположенных с С-конца (Nagano et al., 1997). Однако удаление аминокислотных остатков с С-конца ТБ ВОМ приводит к снижению эффективности транспорта вируса. Возможно это связано с конформационными изменениями в белке (Nagano et al., 1997).

Генетический анализ ВОМ и ВМК показал, что для межклеточного транспорта этих вирусов требуется и ТБ и БО (Schmits and Rao, 1996; Canto et al., 1997; Rao, 1997). Однако механизм участия БО этих двух вирусов в межклеточном транспорте различен. Для ВМК было показано, что имеет место образования тубулярных структур в инфицированных ВМК протопластах, в которых выявляются вирусо-подобные частицы (Kasteel et al., 1997). Мутационный анализ также показал, что в случае нарушения сборки вирусной частицы, межклеточный транспорт ВМК невозможен (Schmits and Rao, 1996) тогда, как ВОМ может транспортироваться в невирионной форме (Schmitz and Rao, 1998). На основании этих данных предполагается, что межклеточный транспорт ВОМ осуществляется в форме РНП комплекса (Schmitz and Rao, 1998).

Межклеточный транспорт вирусов с образованием тубулярных структур

Комо-, каулимои неповирусы можно выделить в особую транспортную группу, поскольку их межклеточный транспорт осуществляется через тубулярные структуры (Wellink and Van Kammen,.

1989; Van Lent et al., 1990; Kasteel et al., 1997; Wieczoreck and Sanfacon, 1993; Perbal et al., 1993).

Геном каулимовируса мозаики цветной капусты представлен двуцепочечной кольцевой ковалентно несвязанной молекулой ДНК. Репликация осуществляется с участием ревертазы через образование РНК-транскриптов.

Возможно, механизмы межклеточного транспорта РНКи ДНК-вирусов сходны, нельзя исключить, что распространение каулимовирусной инфекции из клетки в клетку происходит с участием РНК-транскриптов.

Геном комовируса мозаики коровьего горошка представлен двумя РНК (Ви М-). В-РНК кодирует все необходимое для репликации вируса, М-РНК кодирует 58/48 кДа белки и два БО. Экспериментально было показано, что оба БО и ТБ необходимы для межклеточного транспорта вируса (Wellink et al., 1997).

Показано, что межклеточный транспорт этих вирусов осуществляется через тубулярные структуры, образованные с участием вирусных ТБ. Тубулярные структуры собираются на переферии возле мембраны. После полной сборки они «одеваются» плазмолеммой и выбрасываются наружу. В листе, видимо, происходит «врастание» трубки через плазмодесму в соседние клетки. Этот процесс включает и модификацию плазмодесм. В процессе принимают участие вирусные ТБ (Hull et al., 1989). В длину тубулярные структуры достигают 20 нм, имеют ширину стенки 3−4 нм и внутренний диаметр около 30 нм.

Мутационный анализ 48 кДа ТБ ВМКГ показал, что этот белок необходим для образования тубулярных структур. Видимо, 48 кДа белок взаимодействует с неким хозяйским фактором или факторами. Не исключено также, что 58 кДа белок участвует в образовании тубулярных структур (Kasteel et al., 1993). Было показано, что тубулярные структуры образуются не только в клетках, но и в протопластах, инокулированных ВМКГ (Van Lent et al., 1991). В этих протопластах тубулярные структуры образуются на поверхности клеток и высовываются в культуральную среду, более того, 48 кДа белок был обнаружен в среде, в которой инкубировали протопласты с ВМКГ (Wellink et al., 1987). Тубулярные структуры пронизывали.

U II ^ 11 поверхность клеток, придавая протопластам характерный волосатый фенотип (Van Lent et al., 1991). Тубулярные структуры формируются на ранней стадии развития вирусной инфекции. Сформировавшиеся тубулярные структуры содержат зрелые вирионы (Van Lent et al., 1990, 1991). Мутационный анализ 48 кДа белка показал, что N-концевой домен необходим для образования тубул, а С-концевой домен, видимо, отвечает за взаимодействие с вирусными частицами (видимо, связывается с их БО) (Lekkerkerker et al., 1996).

Для каулимовирусов были получены следующие результаты. Мутации в гене 1, кодирующем Р1 (38 кДа) белок ВМЦК препятствуют распространению вируса из клетки в клетку и развитию системной инфекции, но не влияют на способность реплицироваться в одиночных клетках (Thomas et al., 1993). Анализ тонких срезов листьев, инфицированных ВМЦК, меченных иммунозолотом, показал, что 38 кДа белок находился в ассоциации с ПД и все ПД между клетками мезофилла растения, инфицированного ВМЦК, имели увеличенный диаметр плазмодесменного канала и тубулярную структуру. 38 кДа белок был еще обнаружен в стенках паренхимальных клеток флоэмы, но здесь размер ПД не менялся (Linstead et al., 1988). Было показано, что по всей длине ПД располагались вирусные частицы (Linstead et al., 1988).

В опытах с использованием иммунофлуоресцентной микроскопии показано, что время накопления Р1 белка в инфицированных протопластах совпадает с временем накопления БО (Perbal et al., 1993).

В листьях, зараженных ВМЦК, обнаруживается несколько различающихся по молекулярной массе белков: 46 кДа, 42 к Да, 38 кДа. Эти белки являются продуктами гена 1, отвечающего за транспортную функцию. Распределение этих трех белков варьировало в зависимости от возраста листа. Самые молодые листья содержали преимущественно 46 кДа белок, старые, системно зараженные листья — 42 кДа и 38 кДа белки. Интересно, что инокулированные листья содержали равные количества всех трех форм ТБ (Maule et al., 1989). Предполагается, что эти белки выполняют несколько различные функции (Maule et al., 1989).

В опытах с использованием иммунофлуоресцентного мечения было показано, что ТБ ВМЦК входит в состав тубулярных структур, также было показано, что белок локализуется в виде больших агрегатов в цитоплазме инфицированных клеток (Kasteel et al., 1996).

Компьютерный анализ показал, что имеется сходство в распределении консервативных и вариабельных доменов аминокислотных последовательностей между ТБ каулимои комовирусов, это предполагает, что ТБ этих вирусов структурно родственны (Thomas et al., 1995).

Межклеточный транспорт вирусов с тройным блоком генов.

К вирусам с тройным блоком генов относятся — гордеивирусы (Gustafson and Amour, 1986; Jackson et al., 1989, 1991), фуровирусы (Bouzoubaa et al., 1986), потексвирусы (Morozov et al., 1989, 1991; Forster et al., 1988) и карлавирусы (Zavriev et al., 1991).

Впервые тройной блок генов был идентифицирован как единый элемент геномов вирусов растений различных групп при сравнительном анализе геномов Х-вируса картофеля (ХВК), гордеивируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) и фуровируса некротического пожелтения жилок свеклы (ВНПЖС) (Morozov et al., 1989). Позже тройной блок генов был обнаружен в геноме карлавирусов, а также у Х-вируса лука-шалота (Kanyuka et al., 1992) и фуровируса мозаики N. veluntina (Randies and Rohde, 1990).

Тройной блок генов составляют три частично перекрывающиеся открытые рамки трансляции (ОРТ). Причины перекрывания ОРТ не известны. Однако считают, что это перекрывание позволяет координировать трансляцию трех ОРТ (Morozov et al, 1991).

Взаимное положение генов тройного блока всегда одинаковое, в то время как в геномах вирусов, принадлежащих к различным группам, сам тройной блок может быть по-разному расположен относительно других генов. В геноме потекеи карлавирусов тройной блок располагается между геном репликазы (ОРТ1) и геном БО. В случае фурои гордеивирусов — на РНК2 за геном БО. Участие белков, кодируемых тройным блоком генов в межклеточном транспорте, было предложено для ХВК (Scryabin et al, 1988), экспериментально продемонстрировано для ВШМЯ (Petty et al, 1990; Petty and Jackson, 1990 a, b), фуровируса некротического пожелтения жилок свеклы, ВМБК, ХВК (Beck et al, 1991; Santa Cruz et al, 1998; Lough et al, 1998).

Показано, что первый продукт тройного блока генов — для потекеи карлавирусов — белок с молекулярной массой 25−26 кДа, для ВНПЖС — 42 кДа и 58 кДа — для ВШМЯ. Сравнительный анализ показал, что имеет место высокая гомология белков первого гена тройного блокав их составе была найдена общая консервативная последовательность, гомологичная хеликазному домену репликативного белка (Scryabin et al, 1988; Gorbalenya and Koonin, 1993) (см. далее). Продуктами, кодируемыми двумя другими ОРТ тройного блока, являются два относительно коротких гидрофобных белка.

Было показано, что вирусы с ТБ ВТМ-класса способны комплементировать дефектные вирусы, содержащие тройной блок, в смешанной инфекции (Malyshenko et al, 1989). Было продемонстрировано, что функция межклеточного транспорта мутанта ВТМ Lsl может быть комплементирована ХВК при смешанной инфекции (Taliansky et al, 1982), следовательно геном ХВК кодирует белок/белки, которые являются функциональным аналогом 30 кДа ТБ ВТМ.

X вирус картофеля и родственные потексвирусы.

Группа потексвирусов (название группы является производным от названия типового представителя — X вируса картофеля — potato virus X) объединяет вирусы растений, вирионы которых обладают спиральной симметрией. Вирионы потексвирусов представлены гибкими нитями длиной от 470 до 580 нм (Гиббс и Харрисон, 1978). Геном типового представителя потексвирусов ХВК представлен оц +РНК молекулой (рис. 6).

12К.

165К 25 К JX К БО.

Рис. 6. Схема организация генома ХВК, прямоугольники — ОРТ, эллипс — кэп-структура на 5'-конце, черный прямоугольник — полиА тракт на З'-конце.

На 5'-конце имеется кэп-структура и нетранслируемая последовательность а (3-лидер. Геномная РНК кодирует 5 белков: 5'-проксимальный ген кодирует 165 кДа белок, который является компонентом РНК-полимеразы. За терминирующим кодоном идет межцистронный район длиной 30 нуклеотидов и далее следует тройной блок генов, кодирующий белки с молекулярной массой 25 кДа, 12 кДа и 8 кДа. ОРТ2 перекрывает первые 20 аминокислотных остатков ОРТЗ, а ОРТЗ перекрывает на 68 аминокислотных остатков ОРТ4. Далее идет межцистронный участок и 3'-проксимальное положение занимает ген БО. Перед полиаденилированным трактом расположена нетранслируемая область длиной 75 нуклеотидов. Репликативный белок транслируется прямо с геномной РНК (Miroshnichenko et al., 1988), в то время как для синтеза БО, 25 кДа и 12 кДа, 8 кДа белков используется 3 субгеномные РНК, что было показано in vitro (Morozov et al., 1991) и in vivo (Vercon et al., 1998). Экспрессия БО, видимо, может идти по по механизму внутренней инициации трансляции, показанная Hefferon et al., 1997.

Известно, что для межклеточного транспорта потексвирусов необходим БО, мутации, ведущие к нарушению сборки вирионов ХВК, предотвращают накопление вируса в инокулированном листе (Beck et al., 1991; Chapman et al., 1992).

До сих пор полностью непонятно какую роль в межклеточном транспорте вируса играет каждый белок тройного блока. Особенно мало известно о функциях 12 кДа и 8 кДа белков. Сравнительный анализ обнаружил, что имеется сходство в аминокислотной последовательности между 12 кДа белком ХВК и соответствующими белками гордеи-, фурои карлавирусов. На Nи С-концах этих белков выявлены два блока гидрофобных аминокислотных остатков, между которыми располагается гидрофильный район (Morozov et al., 1987). Для 8 кДа белка ХВК не было показано гомологии с соответствующими белками гордеии фуровирусов (Morozov et al., 1989). В N-концевой части этого белка был найден гидрофобный район, за которым следует высоко консервативная среди потексвирусов последовательность, ограниченная с двух сторон остатками цистеина. Интересно, что предсказанная для N-концевой части 8 кДа белка вторичная структура имеет некоторые общие черты с N-концевыми участками клеточных секретируемых белков, имеющих отщепляемый или неотщепляемый сигнальный пептид. В последнем случае этот белок должен быть связан с мембранными структурами. Анализ последовательностей 8 кДа и 12 кДа белков ХВК указал на их вероятную ассоциацию с клеточными мембранами. Это было экспериментально подтверждено в опытах по экспрессии 12 кДа и 8 кДа белков in vitro — продукты находились в мембранной фракции (Morozov et al., 1990). Место локализации 8 кДа белка ХВК на тонких срезах растений табака, инфицированных ХВК, и трансгенных по 8 кДа белку растений картофеля, продукта ОРТЗ, было определено с использованием меченных золотом антител. Частицы золота наблюдали в пределах клеточных стенок ткани листа, инфицированного растения на 8 день после инокуляции. В трансгенных растениях золотые частицы наблюдали в районе плазматической мембраны и внутри клеточных стенок, кроме того, «золотые кластеры» обнаруживались в большой вакуоле, однако, частицы золота не были обнаружены в районе плазмодесм (Hefferon et al., 1997). Предполагается, что 8 кДа и 25 кДа белки вовлечены в межклеточный транспорт на ранних стадиях развития инфекции (Hefferon et al., 1997).

Было показано, что мутация в гене для 8 кДа белка, в результате которой инициирующий кодон AUG был делетирован, приводит к тому, что межклеточный транспорт блокируется, однако, вирус, в котором больше, чем половина 8 кДа белка была делетирована, был способен к межклеточному транспорту в растении (Boevink et al., 1998).

Значительно больше данных получено в отношении 25 кДа белка, кодируемого первым геном тройного блока. Наличие хеликазного мотива и участие 25 кДа белка в межклеточном транспорте позволило предположить, что по аналогии с 30 кДа ТБ ВТМ, 25 кДа участвует в транспорте вирусной РНК через ПД в составе вирусспецифического РНП комплекса. Для 26 кДа ТБГр1 белка потексвируса мозаики лисохвоста (BMJIx) показано, что он способен связываться с РНК (Rouleau et al., 1994). В 1996 г. Kalinina et al., продемонстрировали, что 25 кДа ТБ ХВК способен связываться с РНК. Недавно было показано, что 25 кДа ТБ участвует в модификации ППС ПД клеток трихомы N. clevelandii (Angeli et al., 1996). Были поставлены опыты с использованием генно-инженерной конструкции XBK. GUS по изучению роли 25 кДа белка. Было обнаружено, что 25 кДа белок увеличивает ППС ПД. Модифицированные ПД были способны пропускать молекулы F-декстрана размером 4,4 кДа и 10 кДа, но не 20 кДа. Мутанты ХВК с делецией в 25 кДа белке накапливались в инокулированных протопластах на том же уровне, что и ХВК дикого типа. Однако этот мутант не был способен к межклеточному транспорту из первоначально инфицированных клеток и не был способен модифицировать ПД для транспорта молекул F-декстрана размером 10 кДа, хотя молекулы F-декстрана размером 4,4 кДа были способны транспортироваться из клеток, инфицированных мутантным вирусом (Angeli et al., 1996). Данные этих экспериментов показывают, что «полная» модификация ПД требует наличия функционального 25 кДа белка. Увеличение ППС ПД может быть результатом изменения диаметра плазмодесменного канала или результатом изменения порядка расположения белков, формирующих эти микроканалы (Angeli et al., 1996).

В работе Morozov et al., 1997 была показана функциональная гомология 25 кДа ТБ ХВК и 30 кДа ТБ ВТМ. Было показано, что 30 кДа был способен комплементировать транспортную функцию мутантного 25 кДа белка при ко-бомбардменте листьев табака плазмидами, одна из которых содержала под контролем каулимовирусного 35Б-промотора полную копию мутантного по гену 25 кДа ТБ ХВК, а другая — ген 30 кДа ТБ ВТМ. Интересно, что 30 кДа ТБ комплементирует функцию 25 к Да белка ХВК, но обратного процесса не происходит — 25 кДа ТБ, экспрессирующийся в трансгенных растениях, либо в составе ХВК дикого типа, не комплементировал дефект по транспорту мутантного по 30 к Да ТБ ВТМ (Ares et al., 1998).

В трансгенных растениях по ТБГр1 потексвируса мозаики белого клевера было показано, что имеет место увеличение ППС ПД. В опытах по микроинъекции FITC-декстранов обнаружили, что 10-кДа и 20-кДа декстраны, но не 40-кДа декстраны могли транспортироваться из клетки в клетку в трангенных растениях по ТБГр1 ВМБК. Таким образом, ТБГр1 ВМБК, экспрессирующийся в растениях, обладает способностью взаимодействовать с плазмодесмами и индуцировать увеличение ППС для транспорта молекул размером не более 40 кДа. Интересно, что для модификации ППС ПД не требовались ТГБр2 и ТБГрЗ и БО (Lough et al., 1998). Показано, что имеет место ограниченый межклеточный транспорт ТБГр1 и 10-кДа F-декстрана при одновременной инъекции ТБГр1 и 10-кДа декстрана в клетки мезофилла контрольного растения. Такой же эффект наблюдался при совместной инъекции в растения, экспрессирующие ТБГр2 или ТБГрЗ. Однако при инъекции ТБГр1 и 10 кДа F-декстрана в растения, трансгенные по генам обоих белков — по ТБГр2 и ТБГрЗ, наблюдался эффективный межклеточный транспорт. Таким образом, для эффективного межклеточного транспорта ТБГр1 вируса мозаики белого клевера требуется присутствие ТБГр2 и ТБГрЗ (Lough et al., 1998).

Вопрос о форме, в которой потексвирусы транспортируются из клетки в клетку остается неясным. Результаты исследований, проведенных Santa Cruz и коллегами (Santa Cruz et al., 1998) свидетельствуют о том, что транспортной формой ХВК являются вирионы. Показано, что для увеличения ППС ПД растений, инфицированных ХВК, необходим один или более ТБ тройного блока и не требуется БО. Было показано, что в ПД инфицированных клеток имеется фибриллярный материал (Oparka et al., 1996). Использование очищенной антисыворотки к БО ХВК, специфично реагирующей с цельными капсидами ХВК, но не с отдельными субъединицами капсида, позволило показать, что фибриллярный материал, находящийся в ПД инфицированных листьев, является вирионами ХВК (Santa Cruz et al., 1998). Было обнаружено, что ПД инфицированных ХВК клеток листьев, имели необычный фенотип — в них отсутствовали десмотрубочки и наблюдались искривления. Предполагают, что такой эффект не является результатом цитологических изменений в растении на поздних стадиях развития вирусной инфекции (Santa Cruz et al., 1998). Вероятно, что БО требуется для инкапсидации вирусной РНК перед началом межклеточного транспорта и именно такие интактные вирионы транспортируются через ПД (Santa Cruz et al., 1998). Отсутствие индуцированных вирусом тубулярных структур в инфицированных ХВК растениях, предполагает, что механизм межклеточного транспорта отличается от механизма, описанного для непои комовирусов.

Показано, что в инфицированных ХВК, BMJIx растениях БО накапливается в районе ПД (Rouleau et al, 1995; Oparka et al, 1996). Было обнаружено, что при инъекции 10-кДа F-декстрана в растения, трансгенные по БО потексвируса мозаики белого клевера (ВМБК), транспорт из инфицированных клеток мезофилла не наблюдается, т. е. БО не способен увеличивать 1JUL1C ПД. Кроме того, показано, что БО не влияет на способность ТБГр1 транспортироваться через ПД в присутствии ТБГр2 и ТБГрЗ (Lough et al, 1998).

Полагают, что транспорт ХВК в виде вирионов может отвечать более серьезным требованиям к размеру свободного диаметра ПД по сравнению с транспортом в виде вРНП комплекса (Santa Cruz et al, 1998). Для межклеточного транспорта ХВК вирионов необходимо, чтобы диаметр ПД был не менее 13 нм, в то время как для транспорта комплекса РНК-ТБ ВТМ диаметр ПД должен быть 2 нм (Citovsky et al, 1992). Вероятно, в поре плазмодесмы инфицированного ХВК растения происходит удаление внутренних мембран и белков для последующего транспорта вирионов (Santa Cruz et al, 1998).

Lough et al, 1998 предложили гипотезу межклеточного транспорта для ВМБК, по которой транспорт через ПД осуществляется в виде комплекса ТБГр1-одноцепочечная РНК-БО.

Важную роль в обеспечении процесса транспорта играют ТБГр2 и ТБГрЗ белки. Были проведены эксперименты по изучению функций ТБГр2 и ТБГрЗ белков в транспорте РНК. ТБГр2 и ТБГрЗ различных вирусов, чей геном содержит тройной блок транспортных генов, рассматриваются как мембрано-ассоциированные белки (Morozov et al, 1990, Niesbach-Klosgen et al, 1990, Donald et al, 1993). Были проведены эксперименты по изучению механизма, по которому функционирует ТБГр2: были получены трансгенные растения, экспрессирующие мутантный ТБГр2 и ТБГрЗ дикого типа. Мутантный ТБГр2 белок (была проведена замена аминокислотных остатков в пределах консервативного гидрофильного района) задерживал распространение ВМБК дикого типа в пределах инокулированного листа. Таким образом, консервативный гидрофильный район ТБГр2 белка вовлечен в транспорт комплекса ТБГр1-одноцепочечная РНК-БО (Lough et al., 1998).

Показано, что ТБГр1 белок в присутствии одноцепочечной РНК не способен увеличивать ППС. Предполагается, что БО взаимодействует с ТБГр1 и/или с РНК и восстанавливает способность комплекса увеличивать ППС. Вероятно, что в процессе инфекции ВМБК транспортируется из клетки в клетку в ткани растения в виде комплекса ТБГр1- одноцепочечная РНК-БО. Такой комплекс может транспортироваться из клетки в клетку не реплицируясь. Представляется маловероятным, что БО в процессе транспорта требуется для инкапсидации. Это гипотеза подтверждается результатами опытов с использованием РНК-ТОТО фага MS2 (см. выше) (Lough et al., 1998), а также тем, что БО обнаруживается в пределах плазмодесм инфицированных клеток (Oparka et al., 1996). Хотя попытки прямой реконструкции этой системы путем микроинъекции одноцепочечной РНК-ТОТО в клетки, экспрессирующие и БО и ТБГр1 не удались, высказано предположение о том, что межклеточный транспорт ВМБК осуществляется двумя путями: один включает образование комплекса ТБГр1-одноцепочечная РНК-БО, а второй механизм осуществляется с участием вирусных частиц (Lough et al., 1998).

Вероятно, что во внутриклеточном транспорте РНК ВМБК участвуют компоненты растительного цитоскелета, как это предполагается и для 30 кДа белка ВТМ. Комплекс ТБГр1- одноцепочечная РНК-БО образуется в инфицированных клетках и доставляется к отверстию плазмодесмы с участием транспортных систем цитоскелета. Таким образом, предполагают, f4f что ТБГр2 и ТБГрЗ выполняют две функции: 1) участвуют в доставке РНП комплекса к предполагаемому заякориваещему белку или 2) функционируют как часть мембрано ассоциированного связывающего комплекса, доставляя ТБГр1-одноцепочечная РНК-БО к заякориваещему белку ПД при участии цитоскелета (Lough et al., 1998).

Вирус штриховатой мозаики ячменя.

Геном гордеивируса штриховатой мозаики ячменя представлен тремя молекулами +РНК. Геном ВШМЯ кодирует 8 полипептидов. РНКа кодирует компонент репликазы (Gustafson et al., 1989). В РНКР закодировано 5 белков. В системе трансляции in vitro из экстракта зародышей пшеницы РНКр служит как мРНК только для синтеза БО, а субгеномная PHKpi является матрицей для трансляции только 58 кДа белка. Однако субгеномная РНКР2 обеспечивает трансляцию трех белков с размерами 14, 17 и 23 кДа. 14 и 23 кДа белки узнавались антителами к pd полипептиду, эти результаты демонстрируют, что 23 кДа белок обозначенный как Pd' синтезируется в результате проскальзывания рибосомой амбер стоп-кодона ОРТ для pd белка (Zhou et al., 1996) Экспрессия четырех полипептидов с тройного блока генов является уникальной особенностью ВШМЯ, хотя pd' белок, видимо, не требуется для транспорта вируса (Donald et al., 1997). РНКу ВШМЯ кодирует предполагаемый полимеразный компонент РНК-репликазы и регуляторный белок.

Было показано, что снижение уровня синтеза 58 кДа ТБ в инфицированных клетках приводит к ослабленному фенотипу вирусной инфекции (Jackson et al., 1989; Petty and Jackson, 1990b).

Показано, что pb белок обладает РНК-связывающей активностью (Donald et al., 1997). Для pb белка показано, что основная часть белка обнаруживается во фракции растворимых белков, но 30−40% белка обнаруживается во фракции клеточных стенок, небольшое количество белка.

41 обнаруживается во фракции Р1 и РЗО (Donald et al., 1993). pb белок обнаруживается на ранних стадиях инфекции 4−7 день после инокуляции, затем его количество достигает максимума, а затем после 10 дня после инокуляции его количество постепенно уменьшается. Было показано, что существует 2 формы Pb белка — pb и pb' (Petty and Jackson, 1990b). pd и Pc белки являются сильно гидрофобными и характеризуются как мембранносвязанные (Morozov et al., 1989). Иммуноблот анализ показал, что Pd белок обнаруживается в основном мембранной фракции, что согласуется с его гидрофобной природой и фракции клеточных стенок (Donald et al., 1993). Время накопления pd белка подобно динамике накопления pb белка (Donald et al., 1993).

Предполагается, что такая локализация pd белка обусловлена тем, что белок может функционировать как мост между клеточной стенкой и плазматической мембраной. Возможно, что pb белок является функциональным гомологом 30 кДа белка ВТМ (Deom et al., 1992, Wolf et al., 1991), это предположение было сделано на основе субклеточной локализации белка, а также в результате того, что в цитоплазме на ранней стадии инфекции обнаружили ассоциированный pb белок с неинкапсидированной РНК (Brakke et al., 1988), а также известно, что in vitro Pb белок образует комплекс с синтезированной РНК (Donald et al., 1997). Вероятно, что маленькие белки, кодируемые двумя другими белками тройного блока генов ВШМЯ, требуются для стабилизации или взаимодействия с белками ПД (Donald et al., 1993).

На основании полученных данных по биохимическим свойствам 58 кДа ТБ, Donald et al., 1997, предложили две гипотетические модели функционирования этого ТБ. Согласно первой модели, АТФазная активность 58 кДа белка сопряжена с расплавлением РНК-дуплексов (отсюдя и сродство к двуцепочечной РНК). Отсутствие хеликазной активности in vitro авторы объясняют возможным участием дополнительных детерминант, в комплексе с которыми 58 кДа ТБ мог бы проявлять хеликазную активность. Согласно второй модели, функционирование 58 кДа белка не связано с хеликазной активностью, а подобно 30 кДа ТБ ВТМ. Сродство к двуцепочечной РНК, по мнению авторов, могло бы в таком случае увеличивать специфичность узнавания собственной геномной РНК путем связывания со специфическими структурированными участками РНК (Donald et al., 1997).

Мутационный анализ показал, что 17 кДа ((Зс) белок необходим для распространения ВШМЯ в ячмене, в N. benthamiana и в Chenopodium amaranticolor (Petty and Jackson, 1990b). Для 17 кДа белка не была показана гомология с аналогичными белками потекеи фуровирусов, однако, он подобно 15 кДа белку фуровируса некротического пожелтения жилок свеклы и 8 кДа ХВК, обладает особенностями мембрано-связывающих белков (Morozov et al., 1989). 14 кДа ((3d) белок ВШМЯ, также необходимый для транспорта вируса (Petty and Jackson, 1990b), имеет явную гомологию с аналогичными белками потекеи фуровирусов (Morozov et al., 1987).

Показано, что для межклеточного транспорта ВШМЯ в ячмене не требуется БО (Petty and Jackson, 1990b). Интересно, что мутанты ВШМЯ с делецией БО успешно заражали растения ячменя и симптомы на растении были более выраженные, чем в случае ВШМЯ дикого типа (Petty and Jackson, 1990b). Предполагают, что в период развития симптомов (острая фаза) ВШМЯ распространяется по растению в неинкапсидированной форме. Затем острая фаза сменяется хронической, характеризующейся смягчением симптомов, во время которой вирус, возможно, перемещается в форме вирионов (Petty and Jackson, 1990b).

Результаты опытов по комплементации показали, что рекомбинантные вирусы, несущие транспортный ген ВТМ, способны к межклеточному транспорту в инокулированных листьях N. benthamiana, общих хозяевах родительских вирусов (Solovyev et al., 1996).

Вирус некротического пожелтения жилок свеклы.

Геном фуровируса некротичского пожелтения жилок свеклы кодирует 5 РНК. 2 самые большие РНК кодируют белки, необходимые для образования локальных некрозов при механической инокуляции листьев, 3 более маленькие РНК кодируют белки, необходимые для развития вирусной инфекции. РНК2 кодирует белки ТБГ: 42 кДа, 13 кДа и 15 кДа, необходимые для межклеточного транспорта (Gilmer et al., 1992). БО не требуется для межклеточного транспорта.

Показано, что 42 кДа ТБ обладает способностью связываться с РНК (Bleykasten et al., 1996). Эксперименты по изучению НТФазной активности 42 кДа ТБ ВНПЖС не проводились.

42 кДа и 13 кДа белки обнаруживаются с момента появления симптомов заражения. Для 42 кДа белка, кодируемого ОРТЗ ВНПЖС показано, что основная часть белка представлена в мембранной фракции РЗО. Локализация 13 кДа белка, кодируемого ОРТ4, такая же, как и в случае 42 кДа белка — большая часть белка представлена во фракции РЗО, в меньших количествах белок выявляется во фракциях ядер и клеточных стенок, но во фракции растворимых белков 42 кДа ТБ не обнаруживается (Niesbach-Klosgen et al., 1990). Предполагается, что 42 кДа белок заякоривается мембранами для взаимодействия с 13 кДа белком, однако, функция 42 кДа белка (или комплекса 42 кДа/13 кДа) неизвестна (Niesbach-Klosgen et al., 1990. ТБГр2 белок содержит высоко консервативный центральный мотив, окруженный гидрофобными аминокислотами Недавно было обнаружено, что мутации в ТБГр2 и ТБГрЗ белках снижают уровень накопления ТБГр1 белка (Lauber et al., 1998).

Результаты недавних экспериментов показали, что 30 кДа ТБ ВТМ может комплементировать все три белка ТБГ ВНПЖС. Однако 3 комплементация не наблюдалась в случае использования ТБ вирусов, чей межклеточный транспорт требует образования тубулярных структур (Lauber et al, 1998). Интересно, что в случае ВМБК комплементация транспорта в трансгенных растениях проходит in trans, а в случае ВНПЖС — только если ТБГр2 и ТБГрЗ белки синтезируются с одной матрицы в одном и том же растении (Lauber et al, 1998).

Предполагаемый механизм межклеточного транспорта ВНПЖС состоит в том, что гидрофобные ТБГр2 и ТБГрЗ белки выполняют роль заякоривающих белков, а ТБГр1 белок в комплексе с вирусной РНК транспортируется через модифицированные ПД. Предполагается, что ТБГр1 белок вместе с другим или обоими ТБГ увеличивают ППС ПД (Lauber et al, 1998).

Поскольку объектом данной работы являются ТБГр1 белки, содержащие консервативные мотивы, принадлежащие к НТФазам/хеликазам суперсемейства I, в следующей главе рассмотрены структура и возможные механизмы функционирования хеликаз.

Вирусные РНК хеликазы.

Расплетание двунитевых полинуклеотидов или шпилечных структур однонитевых молекул — необходимый этап основных генетических процессов: репликации, репарации, рекомбинациикроме того, этот процесс обязателен на некоторых стадиях генной экспрессии. Существует несколько типов белков, способных катализировать эту реакцию. Среди них самыми важными являются полинуклеотид-зависимые нуклеозид трифосфат фосфатазы, чаще называемые хеликазами.

Функция хеликаз состоит в разрушении водородных связей, соединяющих две цепи нуклеиновых кислот в дуплексе. Источником энергии для этого процесса является НТФ. Механизм сопряжения гидролиза НТФ с расплетанием полинуклеотидных цепей пока не вполне ясен.

Три суперсемейства предполагаемых РНК хеликаз.

Компьютерный анализ позволил выявить общий мотив в аминокислотной последовательности белков, для которых продемонстрирована или предполагается способность связывать НТФ, гидролизовать НТФ и расплетать дуплекс, образованный нуклеиновыми кислотами. Основываясь на сравнении аминокислотных последовательностей, выделяют 3 суперсемейства (SF) хеликаз. Хеликазы вирусов есть во всех SF. SF1 объединяет Синдбис-подобные (альфавирусо-подобные) (шР2-подобные) белкиSF2 включает полипептиды, подобные тем, которые кодируются поти-флави-пестивирусами (NS3-подобные) и хеликазу вируса осповакциныSF3 включает пикорна-подобные белки неподобные) (Gorbalenya and Koonin, 1993; Kadare et al., 1997).

Наиболее изученные вирусные хеликазы, сгруппированные в суперсемейства по характеру консервативных мотивов их первичной структуры.

Белок SF2 Белок SF3 Белок.

РНК Альфа 1а Бимо Р270 Комо Р58 вирусы Бромо 1а Поти Cl Непо Р72 растений Капилло р241 Секву Р336.

Карло р26 Вайка ORF-1.

Клостера р295.

Кукумо 1а.

Фуро р237.

Гордеи р130.

Идаео р190.

Потеке р180.

Тобамо р126.

Тобра р134.

Тимо р206.

РНК Альфа NsP2 Флави NS3 Афто 2С вирусы Альтери Р159 Гепатита NS3 Калици р257 животных Корона ORF-lb С NS3 Кардио 2С.

Гепатита ORF-1 Пести Ентеро 2С.

Е Р220 Гепато 2С.

Раби Рино 2С.

Двухцепо HAV ОРТ В чечные.

РНК вирусы.

ДНК Гемини AL1 вирусы растений.

ДНК Герпес BBLF4, Герпес Gp51, Папова Т антиген, вирусы Gp55, Покс UL9 Парво El животных UL5 NPH-I, II NS1.

Консервативные мотивы.

В SF1 и SF2 выделяют 7 консервативных сегментов, обозначаемых как I (или, А сайт), 1а и II (или В сайт), III, IV, V, VI. В SF3 выделяют только 3 консервативных сегмента, включающем, А и В сайты и третий консенсус С (Gorbalenya and Koonin, 1993).

Впервые НТФ-связывающий мотив был охарактерезован Walker et al, 1982. Этот мотив состоит из, А и В сайтов. А сайт состоит из гидрофобных остатков в консервативной последовательности GxxxxGKS/T, где х — любая аминокислота. В сайт содержит DE или DD в окружении гидрофобных аминокислот (Gorbalenya and Koonin, 1993). Данные кристаллографии показали, что, А сайт прямо участвует в связывании с р и у фосфатами НТФ, считается, что остаток лизина связывается с фосфатом, в то время как В сайт образует Mg-НТФ комплекс.

Мотивы I, II, V и VI являются высоко консервативными, в то время как мотивы la, III и IV — менее консервативны (Kadare and Haenni, 1997). На рис. 7 представлена схема расположения консервативных мотивов в хеликазах SF1, SF2 и SF.

SF1 •.

I la II III IV V VI шь—// ДД 111-Si-У/—СООН.

SF2.

I la II III IV V VI.

SF3 аш в «о с шгУ/-Д.I |—COOH'.

50 aa.

Рис. 7. Расположение консервативных мотивов в хеликазах SF1, SF2, SF3. (По Kadare and Haenni, 1997).

Для NPH-II белка вируса вакцины показано, что мутанты с заменой в А-сайте (А вместо К) и мутанты с заменой в В-сайте (А вместо N или, А вместо Q) связывают РНК также хорошо, как и белки дикого типа, но при этом они дефектны по НТФазной и хеликазной функциям. Интересно, что замена Н на, А в В-сайте приводит к успешному связыванию мутантного белка с РНК, а также к нормальному его функционированию как НТФазы, но расплетать дуплекс такой мутант уже не может. Отсюда был сделан вывод о том, что Н в В-сайте обеспечивает кооперативность работы (Lohman et al., 1992). Замена на аланин в консервативном мотиве A NPH-II белка вируса осповакцины приводила к снижению эффективности АТФазной и хеликазной активности на 10% в сравнении с белком дикого типа (Gross et al., 1998). Замена К в GKS мотиве на Q NS3 белка вируса гепатита С приводила к тому, что НТФазная активность в отсутствии полиУ снижалась на 5% и на 50% в присутствии полиУ в сравнении с белком дикого типа и полностью терялась хеликазная активность (Kim et al., 1997).

Мотивы V и VI вносят вклад в образование АТФ-связывающего сайта и могут быть важными для хеликазной активности белка (Subramanya et al., 1996), а также нужны для связывания с РНК (Pause et al., 1992, Fernandez et al., 1995). Замена Y в мотиве VI ДНК-хеликазы UL5 вируса простого герпеса I, относящегося к SFI, приводит к блокированию хеликазной активности и снижению эффективности гидролиза АТФ, но не влияет на способность связываться с ДНК (Graves-Woodward et al., 1997). Интересно, что двойная мутация (замена консервативного Т и R) в мотиве VI РНК/ДНК хеликазы Upflp SFI, приводит к полной потере способности связываться с РНК и блокированию хеликазной и АТФазной активностей (Weng et al., 1996).

Мутационный анализ мотива III в РНК-хеликазе клеточного фактора инициации трансляции eIF4A показал, что этот мотив вовлечен в процесс гидролиза АТФ, необходимого для хеликазной активности. Мотив IV соединяет 2 домена белка и участвует в формировании АТФ-связывающего сайта. Очень важным оказалось взаимодействие между II и VI мотивами. Было показано, что белки, имеющие в мотиве II последовательность DEAd, в мотиве VI всегда имеют последовательность hx2GRx2R. Выяснилось, что замена Н на Q в мотиве VI DEAd белков блокирует их хеликазную активность, при этом, практически не нарушая АТФ-связывающей и АТФазной активностей (Gorbalenya and Koonin, 1993).

Характеристика вирусных хеликаз.

Все изученные хеликазы обладали НТФазной активностью. Эта активность зависит от присутствия НТФ и двухвалентных катионов, в основном магния. Продуктами гидролиза НТФ являются НДФ и неорганический фосфат. Обычно НТФазная активность хеликаз стимулируется в присутствии одноцепочечных нуклеиновых кислот. Возможно, что происходит этот процесс по такой схеме: белок связывается с одной цепью РНК и в результате энергии гидролиза АТФ расплетает пары основания дуплекса, разрушая водородные связи. Кроме того, НТФазная активность белка стимулируется предподчтительно функционально родственной нуклеиновой кислотой (Kadare et al., 1997).

Результаты недавних экспериментов предполагают, хеликаза II Е. coli SFI, связываясь с АТФ, изменяет конформацию, что приводит к повышению сродства белка к одноцепочечной ДНК. В отсутствии АТФ сродство белка к одноцепочечной ДНК ниже, чем в присутствии АТФ (Hall et al., 1998).

Предполагаемые механизмы функционирования хеликаз требуют двух условий: АТФ-зависимую конформацию белка для дальнейшего генерирования энергии и двуспиральные участки в нуклеиновых кислотах, где с помощью этой энергии белок может расплести этот дуплекс. Множественные участки связывания с нуклеиновой кислотой могут находится в пределах одного полипептида, но наиболее вероятно, что множественные сайты связывания с нуклеиновой кислотой образуются в результате олигомеризации хеликазы или в некоторых случаях при взаимодействии хеликазы с дополнительным белком (Kadare et al., 1997).

РНК хеликазная активность РНК и ДНК вирусов Данные, полученные при изучении хеликазной активности белков, кодируемых +РНЕС-содержащими вирусами, показали, что уровень НТФазной активности был высоким в отсутствии нуклеиновых кислот в отличии от большинства клеточных или РНК хеликаз ДНК вирусов (Kadare et al., 1997). Например, для eIF-4A в отсутствии РНК не обнаруживали АТФазной активности (Pause et al., 1992).

Для хеликазной активности С1 белка потивируса шарки сливы не требовались другие вирусные и растительные белки, хотя нельзя исключать возможного участия белков вируса или растения-хозяина in vivo (Fernandez et al., 1995). C1 белок обладает АТФазной активностью. Интересно, что АТФ может быть заменен на дАТФ в хеликазной реакции. Таким образом была продемонстрирована и дАТФазная активность С1 белка. В присутствии полиА наблюдалась стимуляция АТФазной и дАТФазной активностей.

Fernandez et al., 1995). Делеция 103 аминокислотных остатков с С-конца белка не влияла на НТФазную и хеликазную активности белка. Дальнейшее удаление аминокислотных остатков приводило к блокированию РНК хеликазной активности белка и снижению эффективности гидролиза НТФ, хотя все семь доменов РНК хеликазного мотива оставались интактными. Этот результат может быть обусловлен присутствием аминокислотных остатков в С-конце, участвующих в ферментативных активностях белка. Однако данные по гомологии последовательности и анализ мутантов, обладающих НТФазной активностью, показал, что потеря активности может быть обусловлена необходимостью участия этих аминокислот в поддержании структуры белка, хотя с другой стороны эти данные сильно противоречат данным о том, что нет структурной зависимости между С-концевым доменом, пока с неизвестной функцией и РНК хеликазным N-концевым районом С1 белка (Fernandez et al., 1995).

Показано, что РНК-хеликазный мотив VI необходим для связывания с РНК (Fernandez et al., 1995). Этот аргинин богатый район требуется eIF4A белку также для связывания с РНК (Pause et al., 1993). Интересно, что для эффективного связывания eIF4A требуется гидролиз АТФ, в то время как для С1 мутантных белков, не обладающих НТФазной активностью, для эффективного связывания с РНК гидролиз НТФ не требовался (Fernandez et al., 1995). Возможно, что механизмы действия каждой РНК-хеликазы могут быть разными, что вероятно, отражает разные биологические функции белков.

Около 80% всех +РНК-содержащих вирусов кодирует хотя бы одну потенциальную хеликазу. Только вирусы с относительно небольшим геномом (менее 5,8 кб) не кодируют собственную хеликазу (Gorbalenya et al., 1989). Вероятно, для репликации таких маленьких вирусов не требуется расплетания РНК или они используют клеточные ферменты.

Большинство изученных хеликазных белков не требует присутствия дополнительных белков для активности in vitro, однако, eIF-4A требуется белок eIF-4B для проявления активности (Rozen et al., 1990). Для РНК-хеликазной активности NS3 белка вируса гепатита С, требуются ионы магния, как кофактор, но для РНК-связывающей активности Mg2+ не требуется (Gwack et al., 1996).

Участие хеликаз, в процессах не связанных с репликацией вирусов.

В основном результаты по структуре и предполагаемым механизмам действия хеликаз получены при изучении хеликазной активности репликативных белков. Интересно, что вирусы растений с тройным блоком генов кодируют наряду с репликазой второй белок, также содержащий нуклеотид-связывающую последовательность хеликазного домена (Gorbalenya and Koonin, 1993). Таким образом, в вирусном геноме имеется второй хеликазо-подобный белок — ТБГр1, кодируемый вне репликативного блока генов. Таким образом, хеликазная активность требуется не только в репликации, но также и при трансляции и межклеточном транспорте вируса в растении.

Было показано, что Cl белок потивирусов (SF2), необходимый для репликации геномной РНК, выполняет также функцию ТБ (Carrington et al., 1998).

Были проведены эксперименты по изучению хеликазной активности |ЗЬ белка ВШМЯ (SF1), который как известно, обладает способностью связываться с РНК, АТФ, а также обладает АТФазной активностью, которая не стимулируется в присутствии РНК. Однако хеликазная активность не детектировалась в условиях проведения экспериментов (Donald et al., 1997).

Анализ аминокислотной последовательности 26 кДа белка потексвируса мозаики лисохвоста (SF1), относящийся к Синдбис-подобной супергруппе, предположил, что этот белок является АТФ-зависимой РНК-хеликазой, однако эффекта стимуляции АТФазной активности в присутствии РНК не наблюдается (Rouleau et al., 1994).

Интересно, что для 42 кДа белка ФНПЖС (SF1) удаление хеликазного мотива VI не влияет на РНК-связывающие свойства. Возможно, что механизм связывания между 42 кДа белком и РНК отличается от механизма взаимодействия РНК и белков вирусов, содержащих хеликазный домен, вовлеченный в РНК-репликацию (Шеук^еп et а1., 1996).

Интересные результаты были получены при изучении функции Р4 белка бактериофага фб. Белок Р4 бактериофага фб является НТФазой. Энергия гидролиза используется для упаковки РНК. Показано, что для НТФазной активности необходим гексамер белка Р4. Для образования гексамера требуется присутствие АДФ и двухвалентных катионов (Лшй et а1., 1998). Показано, что белок Р4 выполняет функцию транслокации вирусной РНК внутрь прокапсида, то есть участвует в сборке вирионов (.Ьшй е1 а1., 1998).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Реактивы.

В работе использовали следующие реактивы: радиоактивный а32Р АТФ, ГТФ, УТФ (удельная активность 3000 Ки/моль) производства г. лл.

Обнинска (Россия), у Р АТФ, ГТФ, УТФ (удельная активность 3000.

Ки/моль) производства г. Обнинска (Россия). Агароза, легкоплавкая агароза.

• 2+ производства фирм «Promega», «Sigma» (США). Ni нитрилотриацетатная (Ni-HTA) агароза, QIAEX-смола фирмы DIAGEN/QIAGEN (Германия, США). Бактоагар, бактотриптон, дрожжевой экстракт Difco (США). Персульфат аммония, ЕДТА, HEPES, канамицин Serva (Германия). TEMED Reanal Венгрия. X-Gal, IPTG, ампициллин, тетрациклин Биопол (Москва, Россия). Акриламид, N, N'-метил енбисакриламид, дитиотреитол, меркаптоэтанол, неионогенные детергенты Tween20, Triton Х-100, глицин, кумасси бриллиантовый синий, бромфеноловый синий, додецилсульфат натрия, NaOH, RbCl, СаС12, LiCl, Na2HP04, NaH2P04 Sigma (США). Глицерин, гуанидин гидрохлорид ICN (США). Мочевина, трис Merck (Германия). Все реактивы отечественного производства имели квалификацию осч и изредка хч. Рентгеновская пленка производства фирм Kodak (США), Fujifilm (Япония).

2. Ферменты.

Свободная от РНКазной активности ДНКаза, РНазин, РНКазаА, Т7-РНК-полимераза, Т4-ДНК-лигаза фирмы Promega (США). ДНК-полимераза Thermus aquatics (Taq), эндонуклеазы рестрикции BamHl, Hindi 11, Xbal, Xhol, Ncol, EcoRl, Snal, Smal, Bspl201, фрагмент Кленова производства Fermentas (Литва), Биопол (Москва, Россия), Promega (США).

3. Векторы для клонирования и бактериальные штаммы.

В работе использовали высококопийные плазмидные векторы, содержащие ген устойчивости к ампициллину. При клонировании использовали штаммы E. coli XL-1 Blue (с устойчивостью к тетрациклину) и DH5a. Клонированные в pQE30 гены экспрессировали в штамме Ml 5, трансформированном репрессорной плазмидой pRep-4, несущей ген устойчивости к канамицину. Ряд плазмид, содержащих полные копии или участки геномов были предоставлены различными лабораториями (см. Результаты).

4. Выделение плазмидной ДНК.

Для приготовления компетентных клеток использовалась следующая методика. Бактериальный клон высевали в 3 мл бульона 2xYT (Sambrook et al., 1989), содержащего ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, и выращивали в течение ночи при 37 С0 в режиме 185 качаний/мин. При работе с клетками E. coli штамма Ml5[pRep-4] в бульон помимо ампициллина добавляли канамицин в концентрации 25 мкг/мл. Для дальнейших операций использовали настольную центрифугу фирмы «Eppendorf' (ФРГ) и пробирки той же фирмы. Клетки осаждали центрифугированием в течение 4 минут (10 000 об/мин), ресуспендировали в 200 мкл раствора 1 (50 мМ глюкозы, 10 мМ ЭДТА, 25 мМ трис-НС1 — pH 8,0) и добавляли 250 мкл раствора 2 (0,2 M NaOH, 1% ДСН), осторожно перемешивали и выдерживали во льду 5 мин. К лизату клеток добавляли 250 мкл 3 M ацетата натрия (pH 4,8) перемешивали и центрифугировали 10−15 мин. Супернатант переносили в новые пробирки, добавляли равный объем 96% этанола, и центрифугировали 10 мин. Осадок растворяли в 100 мкл дистилированной воды, добавляли равный объем 8 M LiCl, перемешивали и выдерживали 20 мин. при -20 С0. После этого ДНК осаждали центрифугированием в течение 10 мин. (14 000 об/мин.), осадок промывали 70% этанолом, высушивали, а затем растворяли в 50−100 мкл воды.

5. Трансформация бактериальных клеток плазмиднй ДНК.

Для трансформации клеток E. coli применялась следующая методика. 0,5 мл ночной культуры клеток E. coli (штамм XL-1, «Stratagene») высевали в 40 мл L-среды (бакто-триптон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, NaCl 5 г/л), содержавший тетрациклин в концентрации 5мкг/мл, и выращивали при качании 200 об/мин. около 2 часов при 37 С0. Затем клетки осаждали центрифугированием при 6000 об/ мин. При 4 С0 (ротор J-20, центрифуга JA-21 фирмы «Beckman», США). Осадок ресуспендировали в 25 мл холодного раствора 10 мМ трис-HCl pH 7,8, 50 мМ СаС12. Суспензию инкубировали 20 мин. При 0 С0. Затем повторно центрифугировали при 6000 об/ мин в течение 5 мин, осадок ресуспендировали в 2,5 мл раствора 50 мМ трис-HCl pH 7,8, 50 мМ СаС12 и инкубировали 30 мин. при 0 С0. 200 мкл суспензии клеток, обработанных таким образом, смешивали с 20 мкл лигазной смеси. Инкубировали 30 мин. во льду и, после теплового шока (2 мин. 42 С0 с последующем охлаждением во льду) добавляли 1 мл L-бульона и инкубировали в течение 1 час, а при 37 С0. Затем клетки высевали на чашки Петри с 1,5% агаром, приготовленном на L-среде и содержащем ампициллин (50 мкг/мл) и тетрациклин (10 мкг/мл). Чашки Петри инкубировали при 37 С0 около 18 часов.

6. Расщепление ДНК рестриктазами.

Рестрикцию проводили в объеме 20 мкл, в каждом случае добавляя по 2 мкл соответствующего десятикратного буфера и 1−5 ед. рестриктазы, инкубируя смесь при 37 С0 2 часа.

7. Электрофорез в агарозном геле.

РНК или ДНК пробы смешивали с буфером дя нанесения, содержащего 50% глицерина и 0,025% бромфенолового синего, и наносили на гель (0,8−2,0%) под слой электрофорезного буфера (0,089 М трис-борат, 0,002 М ЭДТА pH 7,8).

8. Извлечение фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы.

Из геля вырезали кусочек, содержащий необходимый фрагмнет ДНК и помещали его в пробирку типа «Eppendorf'. Добавляли 250 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис-HCl pH 7,6, 1 мМ ЕДТА). Прогревали при 65 С0 10 мин., затем дважды обрабатывали пробы равным объемом фенола, насыщенного водой. Отобранную водную фазу экстрагировали трехкратным объемом диэтилового эфира для удаления следов фенола, затем добавляли раствор тРНК до конечной концентрации 20 мкг/мл и осаждали ДНК этанолом.

9. Затупление концов фрагментов ДНК и лигирование.

При лигировании фрагментов с несовместимыми липкими концами реакцию лигирования проводили в следующих условиях: на 20 мкл лигазной смеси брались 2 мкл десятикратного лигазного буфера (0,66 М трис-HCl pH 7,5, 50 мМ MgCl2, 50 мМ ДТТ), АТФ до конечной концентрации 0,5 мкМ, дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ до конечной концентрации 100 мкМ, 5 ед. ДНК-лигазы фага Т4 и 1 ед. фрагмента Кленова. Реакцию проводили при 20 С0 2 часа. При лигировании фрагмент с совместимыми липкими концами в лигазную смесь не добавляли дНТФ и фрагмент Кленова, а лигирование проводили при 14 С0 12 часов.

выводы.

1. Получены бактериальные штаммы-суперпродуценты транспортных белков, кодируемых первым геном тройного блока генов (ТБГр! белков), — 25 кДа белка ХВК и 63 кДа белка ПЛВМ и серии их мутантных вариантов. Препараты рекомбинантных белков получены в очищенном виде.

2. ТГБр1 белки 25 кДа белок ХВК и 63 кДа белок ПЛВМ, содержащие семь консервативных мотивов НТФаз/хеликаз суперсемейства I, являются магний-зависимыми АТФазами. Их активность стимулируется в 1,5−1,9 раз в присутствии одноцепочечных полирибонуклеотидов. Оба белка обладают также ГТФазной и УТФазной активностями.

3. 25 кДа белок ХВК и 63 кДа белок ПЛВМ являются РНК-связывающими белками. 63 кДа белок эффективно взаимодействует с РНК. РНК-связывающие свойства 25 кДа белка проявляются только в растворах с низкой ионной силой. В составе 25 кДа белка ХВК картирован участок, ответственный за связывание с РНК, который включает собственно Ы-концевую часть белка и мотивы 1,1а и II.

4. Делеционные мутанты ТБГр1 белков, не содержащие И-концевых мотивов I, 1а и II, не обладают НТФазной и РНК-связывающей активностями. Делеционные мутанты ТБГр1 белков, не содержащие С-концевых мотивов V и VI, способны более эффективно гидролизовать АТФ/ГТФ/УТФ, чем соответствующие белки дикого типа, и сохраняют РНК-связываюшую активнолсть.

5. Методом иммуноблот-анализа изучена кинетика синтеза 25 кДа белка ХВК в инфицированных растениях и его субклеточная локализация.