Биологические свойства изолятов Listeria monocytogenes, выделенных из различных объектов и территорий

1.1 Актуальность темы.

Проблема листериоза до настоящего времени остается актуальной. Это обусловлено широкой распространенностью листерий в природе, полиморфизмом клинических проявлений болезни, высоким уровнем летальности при генерализированных формах инфекции, а так же экономическим ущербом, наносимым сельскому хозяйству заболеваемостью и падежом животных. Интерес ученых и клиницистов к этой инфекции обусловлен также и многочисленными эпидемическими вспышками пищевого листериоза у человека, связанными с употреблением в пищу продуктов, контаминированных л истерия ми в таких развитых странах, как Франция, США, Канада, Германия, Испания и т. д. [И. С. Тартаковский- 2000].

Существующие в настоящее время схемы осуществления надзора^ за листериозом рассматривают все выделенные изоляты L. monocytogenes как в равной степени патогенные, однако-многочисленные наблюдения показали, что вирулентность различных штаммов варьирует [S. Roche, et al., 2004; Москаленко В. Ф., 2006; G. Buchrieser, 2004]. Как правило, снижение вирулентности возбудителя наблюдают при нахождении его в сапрофитической фазе развития. Большинство эпидемических вспышек пищевого листериоза этиологически связаны с относительно узкой филогенетической группой изолятов внутри вида Listeria monocytogenes, характеризующихсяпринадлежностью к сероварам 4Ь, ½а, ½с и ½Ь. При этом все основные вспышки пищевого листериоза и спорадические случаи у людей вызваны штаммами серовара 4Ь. На основании этого рядом ученых высказано предположение о вероятном наличии у штаммов данного серовара уникальных вирулентных свойств. Наряду с высоковирулентными в природе выявляются низковирулентные изоляты L. monocytogenes с так называемым «неинвазивным» фенотипом, роль которых в эпидемическом и эпизоотическом процессах до конца остается не ясной. Также пока остаются невыясненными особенности биологических свойств L. monocytogenes, обитающих в разных экологических условиях. Таким образом, вопрос о патогенных свойствах листерий, выделяемых из различных объектов, является актуальным.

Работы последних десятилетий показывают, что L. monocytogenes претерпевает адаптационные изменения, особенно под воздействием антропогенных факторов (бесконтрольное применение антибиотиков, консервантов, дезинфицирующих средств и т. п.), которые выражаются в изменении биологических свойств. В основном они проявляются резистентностью к антибактериальным препаратам определенных групп, способностью формировать биопленки, появлением авирулентных и слабовирулентных мутантов [Т. И. Карпова, С. А. Ермолаева, 2001; С. Morvan et al., 2010; S. A. Granier et al., 2010; S. Monden et al., 2010; S. Roche et al., 2004; I. Secic, 2010].

Учитывая вышеизложенное, изучение биологических свойств изолятов L. monocytogenes, выделенных из различных источников и на разных территориях позволит отследить изменение фенотипических и генетических характеристик культур, расширить спектр тестов внутриродовой дифференциации листерий, усовершенствовать схемы индикации и идентификации данного патогена, выявить ведущие внутривидовые варианты L. monocytogenes, характерные для сапрофитической и паразитической фазы его развития.

5. ВЫВОДЫ.

1. Установлено, что наименьшая вариабельность проявления феноти-пических признаков характерна для культур, изолированных от восприимчивых животных, а наибольшая — для изолятов, выделенных из организма естественно резистентных животных (шиншилла, пятнистый олень, пастбищные клещи).

2. Штамм ы/изоляты L. monocytogenes имеют различия в продукции гемолитически активных веществ (листериолизина О). Из 16 изученных культур 5 экспрессировали гемолизины на низком уровне, а 10 — на среднем. Изо-лят, выделенный от пятнистого оленя, не вызывал деградации красных кровяных телец.

3. Корреляционным анализом установлена прямая сильная взаимосвязь (г>0,5) показателей вирулентности культур (LDioo и LD50) для белых аут-бредных мышей с однородностью популяции (форма колоний) и уровнями продукции основных экспрессируемых факторов патогенности (листериолизина О и фосфолипазы С).

4. Выделение изолятов, содержащих в популяции 95−98% клеток в S-форме, с высоким (средним) уровнем экспрессии листериолизина О и фосфолипазы С свидетельствует о принадлежности их к вирулентным культурам.

5. Штаммы/изоляты L. monocytogenes имеют различия по вирулентности для белых аутбредных мышей. По показателю LDioo 9 культур являлись вирулентными, 5 — умеренновирулентными и 2 — авирулентными. По показателю LD50 5 культур признаны высоковирулентными, 6 — вирулентными, 3 — умеренновирулентными и 2 — авирулентными.

6. Разработана схема дифференциации листерий по показателям вирулентности, которая позволяет объективно оценивать патогенные свойства культур L. monocytogenes и распределять их на группы.

7. При изучении генетической вариабельности изолятов L. monocytogenes с помощью метода REA PFGE выявлены 8 пульс-электротипов. Три пульс-электротипа являются общими для нескольких изолятов, циркулировавших на территории бывшего СССР в период с 1943 по 1976 г., 1 пульс-электротип образован, возможно, родственными изолятами, а 4 пульс-электротипа — уникальны.

8. Выявление идентичных пульс-электротипов для изолятов, выделенных в Украинской и Татарской СССР, в Краснодарском крае и Читинской области, в Украинской СССР и Новосибирской области свидетельствует об общности их происхождения.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. На основании проведенных исследований разработаны и рекомендуются в практику научно-исследовательских учреждений «Методические рекомендации по комплексной оценке культур Listeria monocytogenes на основе изучения фенотипических и генетических характеристик», которые утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 07.07.2010 г.

2. Составлены генетические паспорта на изученные культуры L. monocytogenes.

4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В данной работе представлены результаты исследования биологических свойств изолятов L. monocytogenes, выделенных в пространственно отдаленных регионах в различные промежутки времени, как из объектов внешней среды, так и различных биологических объектов, относящихся к разным семействам и видам.

Предварительное изучение сформированной рабочей коллекции культур листерий показало, что большинство из них (за исключением изолята № 41 -06) являлись типичными представителями своего вида. В основном культуры принадлежали к I серологической группе, что согласовывалось с данными отечественных ученых о преимущественной изоляции на территории РФ культур L. monocytogenes I серогруппы [К.Н. Шлыгина, 1963; JI.A. Буренкова, 1962].

Известно, что вирулентные штаммы бактерий состоят на 95−100% из клеток, формирующих на твердых питательных средах колонии S-формы. В наших исследованиях также было установлено, что популяции большинства вирулентных для белых аутбредных мышей культур состояли на 88,87 — 99,32% из клеток S-форм. Популяции авирулентных культур листерий, наоборот, были представлены преимущественно RS — и R-формами, что подтвердило существующую взаимосвязь между формой колоний и вирулентностью (коэффициент корреляции 0,62). Как правило, гетероморфизм был присущ изолятам, выделенным от естественно резистентных животных (пятнистый олень, шиншилла, пастбищные клещи), которые являются лишь носителями возбудителя листе-риоза. Давление факторов неспецифического иммунитета на листерии в организме этих животных, скорее всего, приводит к изменчивости патогена, которая проявляется в расщеплении популяции на Sи R-формы и, соответственно, снижении патогенности.

Одним из косвенных доказательств естественной аттенуации штамма под прессингом иммунной1 системы может служить первый случай выделения на территории РФ авирулентной культуры листерий из головного мозга пятнистого оленя. До настоящего времени не представляется возможным проведение ее полной идентификации. С одной стороны, отсутствие у данной культуры фе-нотипического выражения in vitro продукции основных факторов патогенности (LLO и Pic С) и авирулентность для белых мышей позволяют отнести ее к виду L. innocua, с другой стороны — наличие в ее геноме «молчащего» Hly-гена и некоторых генов интерналина, присущих патогенным листериям (неопубликованные данные), свидетельствуют о принадлежности ее к виду L. monocytogenes. По крайне мере, выявленные феномены свидетельствуют о сложных филогенетических и эволюционных взаимоотношениях между этими двумя видами. О выделении негемолитичных слабои авирулентных культур листерий также сообщают S. Roche с соавторами (2004), Т. И. Карпова, С. А. Ермолаева (2001) и группа норвежских исследователей во главе с I. Secic (2010). Причем до настоящего времени роль таких культур в этиологии листе-риоза человека остается неясной.

За реализацию патогенных свойств листерий ответственность несут гены патогенности, локализованные как и у большинства бактерий, на, так называемых, «островках патогенности». Особый интерес для изучения у листерий представляют два основных экспрессируемых фактора патогенности — листериолизин О (LLO) и фосфатидилспецифичная фосфолипаза С (Pic С). Для тестирования этих факторов in vitro применяют однослойные среды, содержащие питательную основу и субстрат. Классически для качественной оценки гемолитической и лецитиназной активности бактерий принято использовать кровяные и желточные агары, однако, как уже отмечалось выше (разд.3.3.2.1 и 3.3.2.2) эти среды имеют ряд недостатков. В своих исследованиях мы применили разработанную ранее двухслойную среду СОГАЛ [патент на изобретение № 2 318 022 от 27.02.2008 г.], коммерческий ALOA-arap и предложенный нами метод полуколичественной оценки экспрессии этих факторов [И. Ю. Егорова, Ю. О. Селянинов, 2005]. Использованные нами среды и подходы позволили установить межштаммовые различия в синтезе гемолизинов и фосфолипаз у изучаемых культур и выявить взаимосвязь между уровнем продукции этих ферментов и степенью патогенности культур. Результаты показали, что чем выше уровень продукции гемолизинов и фосфолипаз, тем выше вирулентность культур листерий (г>0,6).

В современных условиях, когда воздействие антропогенных факторов на среду обитания патогенов является существенным, выживание и поддержание популяции листерий в природе достигается за счет адаптационных изменений патогена (как уже указывалось выше). Одним из таких факторов является формирование устойчивости к антимикробным препаратам. Современные данные свидетельствуют о том, что листерии приобретают резистентность ко многим современным препаратам из группы фторхинолонов, цефалоспоринов, пени-циллинов, тетрациклинов, аминогликозидов и др. Результаты наших исследований подтверждают эти данные. Ни у одного из исследуемых штам-мов/изолятов, циркулирующих на территории бывшего СССР и ФРГ в период с 1943 по 1976 г. г., когда еще эти препараты для терапии инфекционных заболеваний животных в ветеринарной практике не применялись, не обнаружено устойчивости к ним.

Одним из механизмов сохранения возбудителя в межэпизоотический период считается его способность к персистенции. Персистенция или длительное переживание патогена в экологической нише (организме хозяина) широко распространенное явление и ее следует рассматривать как одну из наиболее интересных и интенсивно разрабатываемых проблем микробиологии. Это обусловлено тем, что расшифровка механизмов бактериальной персистенции открывает перспективы для решения таких вопросов, как понимание природы бактерионосительства, выявление причинно-следственных связей дисбиозов, совершенствование диагностических препаратов и, наконец, создание основ микроэкологического мониторинга объектов внешней среды [Бухарин О. В., Усвяцов Б. Я, 1996; Прозоровский С. В. и др., 1981]. На биомолекулярном уровне персистенция характеризуется способностью микроорганизма вырабатывать специфические функционально активные вещества, так называемые факторы персистен-ции. Известно, что к ним относятся антилизоцимная, антикомплементарная, ан-тиинтерфероновая, ДНК (РНК) — азная, антикарнозиновая, антиглобулиновая, антигистонная и другие активности. Из персистентных свойств у листерий изучали антикомплементарную, антилизоцимную и ДНК-азную активности. К сожалению, выявить данный вид активностей у листерий не удалось и это может свидетельствовать либо о более сложных механизмах персистенции листерий как внутриклеточных патогенов, либо о необходимости совершенствования уже существующих методов оценки персистентных свойств патогенов, либо разработки совершенно новых подходов с учетом биологических особенностей листерий.

Существующие в настоящее время схемы осуществления надзора за листериозом рассматривают все выделенные изоляты L. monocytogenes как в равной степени патогенные. Однако наблюдения некоторых авторов показали, что вирулентность различных штаммов варьирует [S. Roche et al., 2004; С. Buchrieser, 2004; Москаленко В. Ф., 2006]. Как правило, патогенность культур листерий принято определять путем постановки кератоконъюнктивальной пробы на морских свинках. Эта качественная реакция позволяет дифференцировать листерии на патогенные и непатогенные и не позволяет объективно оценить уровень патогенности каждого из штаммов. Для объективной оценки вирулентности культур определяют показатели LDioo и LD50. Однако в России до настоящего времени не существует единой схемы дифференциации штаммов листерий внутри вида по этим показателям. Проведя анализ показателей LD10o и LD50 для белых аутбредных мышей, мы разработали схему дифференциации изолятов L. monocytogenes по вирулентности, которая позволила нам распределить их на 3−5 групп, в зависимости от того какой показатель был взят за основу. Примененный нами подход позволяет проводить межштаммовую дифференциацию изолятов патогенных листерий и может быть использован при проведении эпизоотического (эпидемиологического) анализа вспышек листериоза среди животных и человека.

Изучение фенотипических свойств изолятов листерий при помощи классических, вновь разработанных и усовершенствованных микробиологических методов позволило выявить у них различия в проявлении ряда признаков. Однако использованные методы не отражали полной картины вариабельности популяций, не выявляли степени генетического родства между исследуемыми культурами и их специфических особенностей. Поэтому для решения этих вопросов нами было проведено изучение генетической вариабельности культур сформированной рабочей коллекции.

В последние годы для типирования наиболее значимых в эпидемиологическом отношении штаммов L. monocytogenes разработаны молекулярно-генетические методы — гель — электрофорез в переменном поле (REA PFGE), мультилокусное секвенирование (мультилокусное секвенирование-типирование — MLST),.

В российской литературе встречаются данные о типировании с использованием данных методов в основном клинических изолятов от человека и культур, выделенных из пищевой продукции, смывов с объектов окружающей среды в результате проведения мониторинговых исследований или эпидемиологического анализа случаев возникновения листериоза у человека. Работ посвященных изучению генетического разнообразия культур листерий, выделенных от различных животных (сельскохозяйственных, домашних, диких) практически нет. Встречаются сообщения о генотипировании штаммов L. monocytogenes, изолированных от морских гидробионтов [Е. А. Зайцева и др., 2007].

Использование двух крупнощепящих рестриктаз Smal и Apal позволило нам выявить 8 пульс-электротипов, причем некоторые из них были общими для нескольких штаммов, а другие выявляли различия между исследуемыми штам-мами/изолятами и особенности некоторых из них. Какой-либо взаимосвязи между источником выделения и пульс-электротипом мы не установили, лишь изоляты, выделенные от грызунов являлись генетически родственными. Однако мы обнаружили 100% сходство в распределении фрагментов ДНК для нескольких изолятов, циркулировавших на территории бывшего СССР в период с 1943 по 1976 г. г. Причем эти изоляты формировали 4 группы.

Итак, проведенные молекулярно-биологические исследования позволили выявить геномный полиморфизм штаммов/изолятов L. monocytogenes и установить идентичность распределения рестрицированных фрагментов ДНК для нескольких культур, выделенных в Украинской, Татарской СССР и Новосибирской области, а также Краснодарском крае и Читинской области. Последнее является свидетельством общности их происхождения.

Таким образом, в результате проведенных комплексных исследований с использованием как традиционных, так и разработанных в последнее десятилетие методик, изучены биологические свойства культур L. monocytogenes, выделенных из различных объектов в разные промежутки времени на географически отдаленных территориях.

Разработанные нами подходы и полученные данные могут быть использованы для сравнения коллекционных культур листерий со свойствами современных изолятов, циркулирующих на территории РФ и за рубежомоценки эпизоотической значимости выделяемых изолятов листерийразработки средств специфической профилактики и совершенствования схем лабораторной диагностики.