Общая характеристика работы.
Актуальность проблемы.
Макромолекулы нуклеиновых кислот (НК) устойчивы к прямому действию ближнего УФ и видимого света. Однако в присутствии органических красителей — природных или синтезированных — в растворах и биосистемах возможны светоиндуцированные процессы, сопровождающиеся модификацией полимерных цепей. Важность исследования фотомодификации нуклеиновых кислот в том, что любое нарушение компонентов ДНК приводит к изменениям в метаболизме клетки и ее генетических свойств.
Совместное действие света и органических красителей на макромолекулы НК получило название фотодинамического действия (ФДД) или фотодинамического эффекта (ФДЭ). Хотя ФДЭ известен давно и опубликовано большое число работ, описывающих его проявление, молекулярные процессы, лежащие в основе явления, еще не полностью объяснены. Все существующие теории физико-химических механизмов ФДД предполагают, что на первой стадии реакции краситель поглощает видимый свет и переходит в возбужденное состояние. Вторая стадия — передача энергии хромофорным группам макромолекул. Вместе с тем, до настоящего времени окончательно не выяснено через какое возбужденное состояние — синглетное или триплетное — идут реакции, не завершена дискуссия о роли кислорода в ФДЭ органических красителей, требуются дополнительные исследования, подтверждающие необходимость для ФДД предварительного связывания красителей с макромолекулами, а также, изучение влияния на этот процесс локального нагрева среды и продуктов фотохимического распада. Поиск ответов на перечисленные вопросы открывает перспективы разработки методов избирательного управления процессами в молекулярных системах для целенаправленного изменения их свойств и характеристик.
Обоснованием актуальности изучения процессов адресной фотомодификации макромолекул НК с помощью органических красителей служат реальные перспективы применения полученных результатов для совершенствования современных биомедицинских технологий, включая технологии, основанные на пространственно локализованной модификации биополимеров in vivo. В этой связи необходимо решить две основные задачи, во-первых, найти оптимальные фотосенсибилизаторы реакций, отвечающих основным требованиям по физико-химическим, биологическим и технологическим критериям, во-вторых, оптимизировать режимы лазерного облучения окрашенных систем, обеспечивающих высокую эффективность оптического воздействия на вещество.
Эффективность фотопревращений в макромолекулах, характеризующихся специфической организацией, зависит от состава, строения и упаковки полимерных цепей. Применительно к нуклеиновым кислотам, эффективность модификации зависит от их структуры (вторичной или третичной) и служит источником информации о свойствах полимеров.
Цель работы.
Цель настоящей работы — разработка методов модификации окрашенных макромолекул нуклеиновых кислот лазерным излучением видимого диапазона и установление механизмов процессов.
Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:
• исследовать взаимодействие органических красителей различных классов с макромолекулами нуклеиновых кислот в водных и буферных растворах;
• изучить спектрально-люминесцентные свойства связанных макромолекулами мономеров, димеров и ассоциатов органических красителей, исследовать кинетику дезактивации их возбужденных состояний и определить соотношение эффективности конкурирующих каналов внутримолекулярной релаксации в связанных молекулах;
• исследовать действие лазерного излучения видимого диапазона на нуклеиновые кислоты в окрашенных растворах, содержащих свободные и связанные макромолекулами органические красители и установить, какое возбужденное состояние — синглетное или триплетное — ответственно за фотодинамическое действие красителей;
• определить роль кислорода в фотодинамическом эффекте и установить, на какой стадии в облучаемых растворах образуются химически активные формы молекулярного кислорода;
• разработать методы идентифицикации типов повреждений полимерных цепей и установить механизмы фотодеструкции окрашенных макромолекул.
Научная новизна.
1. Исследовано взаимодействие органических красителей различных классов с макромолекулами нуклеиновых кислот в водных и буферных растворах. Показано, что в результате самоорганизации лигандов при кооперативном связывании с макромолекулами, за счет слабых межмолекулярных взаимодействий на внешней стороне двойной спирали формируются устойчивые наноструктуры определенной формы и размеров. Изучены особенности формирования органических наноструктур в растворах, оценено количество молекул красителей в них, исследовано распределение образующихся субмикронных структур вдоль двойной спирали ДНК и их слияние в более крупные агрегаты.
2. Оптимизированы условия синтеза наноструктур, определены критические концентрации самоагрегации молекул, исследована зависимость степени связывания от ионной силы растворов и его состояния, изучена зависимость константы диссоциации от типа иона и ингибирование связывания ионами различных металлов. Показано, что связанные красители могут инактивиро-вать нуклеиновые кислоты за счет стерического экранирования формирующимися структурами.
3. Исследованы фотопревращения биополимеров под воздействием интенсивного лазерного излучения в растворах, сенсибилизированных органическими красителями. Осуществлено селективное лазерное разрезание макромолекул нуклеиновых кислот с помощью слабо связанных хромофоров и установлены молекулярные механизмы явления. Установлено, что первичным процессом фрагментации полимерных цепей с помощью красителей с малым выходом интеркомбинационной конверсии в триплетное состояние является безрадиационный синглет-синглетный перенос энергии с высоких электронно-возбужденных уровней молекул красителей на хромофорные группы макромолекул.
4. Изучена кинетика термостимулированной замедленной флуоресценции молекул красителей в условиях кратковременного импульсного нагрева среды и экспериментально доказано возникновение областей локального разогрева среды. За счет гипертермии макромолекул в результате тепловыделения при безызлучательной дезактивации высоковозбужденных электронных состояний связанных хромофоров осуществлена денатурация ДНК и изучены конформационные изменения двойной спирали под влиянием локальных температурных полей.
5. Экспериментально показано, что фотосенсибилизированная генерация химически активных форм молекулярного кислорода связанными и несвязанными люминофорами приводит к деструкции полимерных цепей. Установлено, что предварительное связывание красителя с субстратом, в общем, не является необходимым условием фотодинамического действия.
Практическая значимость результатов.
1. Использование синтезированных органических наноструктур в качестве функциональных элементов фотомодификации полимерных цепей может быть положено в основу разработки нового метода локального фотовоздействия на биополимеры. Разработка таких методов, в свою очередь, приблизит к решению важнейшей проблемы биофизики, связанной с комплексными исследованиями молекулярных механизмов селективной лазерной (фотохимической и тепловой) модификации нуклеиновых кислот.
2. Результаты исследования взаимодействия молекул органических красителей с нуклеиновыми кислотами могут быть использованы для разработки методов контрастирования биообъектов, в диагностических и терапевтических целях. Установленные закономерности существенно облегчат поиск оптимальных фотосенсибилизаторов физико-химических процессов в биосистемах.
3. Сведения о теплофизических свойствах связанных макромолекулами наноструктур окажутся полезными при использовании их в качестве микротеплогенераторов и сенсоров в современных биомедицинских технологиях.
4. Лазерная модификация окрашенных макромолекул, характеризующихся специфической организацией, дает важную информацию о структуре макромолекул для фотофизики и фотохимии полимеров, биофизики и молекулярной биологии.
5. Представленные методы селективного поражения лазерным излучением макромолекул в присутствии специфических красителей будут способствовать дальнейшему развитию метода фотодинамической терапии. Полученные нами сведения о лазерном локализованном воздействии на макромолекулы посредством синтезированных наноструктур также будут полезными при совершенствовании данного метода терапии.
Методы исследования.
Основные экспериментальные результаты, представленные в работе, получены при изучении спектрально-люминесцентных свойств окрашенных растворов нуклеиновых кислот методами стационарной и кинетической спектро-фотометрии и флуориметрии, упругого рассеяния света, а также зондовой сканирующей атомно-силовой и туннельной микроскопии.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Кооперативное связывание молекул органических красителей-катионов с дезоксирибонуклеиновыми кислотами сопровождается формированием на внешней стороне двойной спирали плоских субмикронных стэкинг-структур со стопочной укладкой слоев молекул. Устойчивость таких структур сохраняется за счет слабых межмолекулярных взаимодействий.
2. При воздействии интенсивным лазерным излучением видимого диапазона на связанные комплексы органический краситель — нуклеиновая кислота происходит фотомодификация макромолекул. Фрагментация полимерных цепей с помощью слабо связанных лигандов инициируется безрадиационным переносом энергии с высоких электронно-возбужденных синглетных уровней молекул красителей на хромофорные группы макромолекул.
3. Для органических молекул, являющихся эффективными фотосенсибилизаторами химически активных форм молекулярного кислорода, в водных растворах предварительное связывание с нуклеиновыми кислотами не является необходимым условием их фотодинамического действия. Фотомодификация биополимеров в растворах с несвязанными красителями происходит в результате их химического взаимодействия с электронно-возбужденными молекулами кислорода.
4. Тепловыделение при безызлучательной дезактивации высоких электронно-возбужденных состояний связанных хромофоров приводит к гипертермии макромолекул и сопровождается локальной денатурацией двойной спирали с конформационными изменениями полимерных цепей.
Публикации.
Основные результаты проведенных исследований опубликованы в 15 печатных работах. В перечне опубликованных работ 4 статьи в центральных отечественных и международных журналах, рецензируемых научных сборниках и материалах конференций, 11 тезисов докладов на международных и всероссийских конференциях.
Апробация работы.
Основные результаты работы обсуждались на:
Региональной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов (Оренбург, 2000 г.) — Third International Conference «Electronic Processes in Organic Materials» (ICEPOM-3), (Kharkiv, Ukraine, 2000 г.) — Международной конференции «JIomohocob-2001» (Москва, 2001) — II международной конференции молодых ученых и специалистов «0птика-2001» (Санкт-Петербург, 2001 г.) — Международной научно-практической конференции, посвященной 30-летию ОГУ (Оренбург, 2001 г.) — VII Международной конференция «Лазерные и лазерно-информационные технологии: фундаментальные проблемы и приложения» (Суздаль, 2001 г.) — XVII International Conference on Coherent and Nonlinear Optics (ICONO-2001), (Minsk, Belarus, 2001 г.) — Междул народной конференции «Оптика, оптоэлектроника и технологии О Т-2001», (Ульяновск, 2001 г.) — V Международной конференции «Импульсные лазеры на переходах атомов и молекул», (Томск, 2001 г.) — Международном форуме «Инновации — 2002», (Оренбург, 2002 г.) — IX Всероссийской научной конференции молодых исследователей с международным участием (Москва, 2002 г.) — International Quantum Electronic Conference IQEC — 2002, (Moscow, Russia, 2002 г.).
Структура работы.
Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения, списка использованных источников из 211 наименований, содержит 167 страниц машинописного текста, 53 рисунка и 3 таблицы.
Основные результаты и выводы.
1. Исследовано взаимодействие органических красителей различных классов с макромолекулами нуклеиновых кислот и установлено, что в результате кооперативного связывания лигандов с полианионами на наружной стороне макромолекул образуются плоские органические наноструктуры. Устойчивые субмикронные молекулярные структуры имеют размеры 150*50*5 нм3 с числом молекул красителей в них до 1.5−104.
2. Определены критические концентрации самоагрегации молекул красителей в растворах полианионов, исследованы зависимости степени связывания от ионной силы растворов и его состояния, изучено ингибирование связывания ионами различных металлов, исследована динамика образования молекулярных агрегатов и их распределение вдоль макромолекул нуклеиновых кислот. Показано, что из отдельных наноструктур, при высоких концентрациях красителей, могут формироваться микрокристаллы, стерически экранирующие полимерную цепь ДНК.
3. Разработаны способы лазерной фотомодификации макромолекул нуклеиновых кислот и методы идентификации повреждений полимерных цепей с помощью связанных и свободных органических красителей.
4. Показано, что возможно двунитевое разрезание макромолекул ДНК с помощью слабо связанных органических красителей. Механизм разрезания основан на безызлучательном переносе энергии фотовозбуждения с высоких синглетных уровней молекул красителей на хромофорные группы макромолекул. Квантовый выход такого процесса не превышает значения 10″ 4.
5. Экспериментально доказана возможность локальной гипертермии макромолекул в результате тепловыделения при безызлучательной дезактивации высоких электронно-возбужденных состояний молекул слабо связанных хромофоров. Осуществлена адресная денатурация биополимеров и исследованы конформационные изменения полимерных цепей под влиянием локальных температурных полей. Установлено, что локальная тепловая денатурация является доминирующим процессом фотодеструкции макромолекул с помощью слабо связанных красителей.
6. Для органических молекул, являющихся эффективными фотосенсибилизаторами синглетного кислорода, предварительное связывание с нуклеиновыми кислотами не является необходимым условием их фотодинамического действия в растворах. Фотомодификация биополимеров в растворах с несвязанными красителями происходит в результате их химического взаимодействия с электронно-возбужденными молекулами кислорода.
7. Экспериментально показано, что в окрашенных водных растворах ДНК синглетный кислород возникает только в результате тушения триплетных состояний несвязанных или слабо связанных молекул красителей. Интер-калированные красители не являются генераторами синглетного кислорода.
Заключение
.
На протяжении двух последних десятилетий интенсивно исследуются процессы совместного действия света и органических молекул различных классов на нуклеиновые кислоты. Результаты этих исследований нашли применение при разработке современных методов диагностики и терапии, основанных на возможности селективного окрашивания и фотовоздействия на биологически важные макромолекулы. Повышение эффективности адресного воздействия на макромолекулы требует установления молекулярных механизмов фотосенсибилизированных реакций взаимодействия излучения с веществом.
Представленный в настоящей работе материал, по мнению автора, существенно дополняет имеющиеся сведения о природе фотореакций в окрашенных растворах биополимеров. Разумеется, мы не утверждаем, что полностью изучены все особенности связывания органичесюгх красителей с ДНК в растворах и дальнейшие исследования не дадут новых сведений о взаимодействии органических соединений с нуклеиновыми кислотами и специфике фотопроцессов с их участием. Скорее наоборот, полученные нами результаты дают возможность планирования дальнейших фундаментальных и прикладных исследований, и в первую очередь, в области фотобиологии. Так, локальная гипертермия макромолекул, осуществленная нами in vitro, может быть положена в основу принципиально нового метода поражения полимерных цепей. А выявленные закономерности связывания органических красителей с биологическими макромолекулами позволяют уже в настоящее время приступить к разработке методов флуоресцентной диагностики ранней патологии клеток и тканей.
Таким образом, решенные в настоящей работе задачи позволили с одной стороны достичь определенного уровня понимания особенностей фотопроцессов с участием биологически важных макромолекул, а с другой, определить перспективные направления использования уже полученных результатов и дальнейших исследований.
В завершение благодарю сотрудников института микрои нанотехноло-гий Оренбургского государственного университета — доцентов С. Н. Пашкевича, Ю. Д. Лантуха, Э. К. Алиджанова, аспирантов O.K. Давыдову и Д.А. Раздоб-реева за помощь в работе и понимание. Я глубоко признателен доктору физико-математических наук, профессору Гарри Альбертовичу Кецле за заботу и внимание к моей работе.
Особую благодарность выражаю моему научному руководителю доктору физико-математических наук Сергею Николаевичу Летуте за моральную и интеллектуальную поддержку и оказавшему мне значительную помощь в работе над диссертацией.
