Физиологические процессы регуляции онтогенеза свеклы обыкновенной (Beta vulgaris L.)

Углубление наших знаний в области регуляции онтогенеза, прежде всего фитогормоналшой (Шевелуха, 1997), приближает нас к созданию эффективной системы регуляции, применение которой в ответственные периоды онтогенеза организмов может обеспечить оптимальную его реализацию.

В отличии от биологии развития животных организмов, теория онтогенеза растений еще не приобрела целостный вид.

Физиологические (фитошрмональные) механизмы регуляции генеративного развития растений изучают как возрастную регуляцию (Баврина, Константинова, Аксенова, 97Т) или как коррелятивные взаимодействия органов в процессе адаптогенеза, включая регуляцию водообмена (Бернье, Кине, Сакс, 1985). Фитогормоны могут участвовать в регуляции донорно — акцепторных отношений при формировании органов запасания и возобновления, причем ауксины и цитокинины усиливают акцепторные свойства (Яшков, Борзенкова, 1997; Роньжина, 1997), а АБК-донорные (Заякин, Шжелуха, 1997; Кузьмина, 1999).

В литературе рассматривается еще один возможный участник процесса передвижения ассимилятов и рост органов — осморегуляция. Регулирование содержания осмотически активных веществ в цитоплазме клеток может осуществляться как путем отложения запасных веществ в вакуолях клеток посредством механизма активного транспорта через тонопласт, так и оттоком веществ, в соответствии с полузабытой теорией «массового потока», по градиенту концентрации (Леопольд, 1968). Однако, работы Т. J Buckhout (1989) и J. M Davies (Davies, Hint, Sanders, 1994) позволяют вернуться к использованию этой теории. № сегодняшний день вопросы взаимодействия двух регуляторных механизмов (фитогормонального и осмотического) и их участие в регуляторных процессах онтогенеза двухлетних растений остаются не достаточно изученными.

Физиологические процессы регуляции роста и развития двухлетних (и вообще многолетних) растений изучались в основном в отдельные, «ответственные» периоды онтогенеза' формирование органов возобновления и накопления запасных веществ, инициация и ход генеративного развитая и проч. Отсутствует единый подход к изучению регуляторных процессов онтогенеза таких объектов от начала и до окончания онтогенеза.

Цель и задачи исследования

.

Целью работы явилось выделение и изучение ведущих физиологических процессов регуляции онтогенеза двухлетнего растенияBeta vulgaris L.

В задачи исследования входило: изучение физиологических процессов формирования корнеплода Свеклы обыкновеннойизучение физиологических процессов в период покоя корнеплодаизучение физиологических процессов регуляции в период генеративного развитая.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объект исследования.

Объектом исследования служили растения свеклы Beta vulgaris L. (сорт Бордо).

Свекла обыкновенная относится к семейству маревых (Chenopodiaceae), входящему в крупный порядок центросеменных (Centrospearmae). Род Свекла (Beta L.) принадлежит к древнему подсемейству Cyclolobeae, у видов которого зародыш семени окружает питательные ткани периспермы (Вавилов, Гриценко, Кузнецов и др., 1979).

В культуре известны четыре разновидности Свеклы обыкновенной (Beta vulgaris L.) — сахарная, кормовая, столовая и листовая (мангольд) (Матвеев, Рубцов, 1985).

В работе объектом исследования служили растения Свеклы обыкновенной (с. Бордо 237). Этот средаеранний сорт, вьюеденный ВНИИ селекции и семеноводства овощных кулыур, рекомендуется для всех регионов России (Сорта.2001). Корнеплод округлый и округдогоюскии, с небольшой головкой, массой 230 — 500 г. Незначительно склонен к цветушности — до 2,9% (на севере 10 — 15%).

Свекла обыкновенная является растением сухих местообитаний, полупустынь. Свекла столовая — это одна из разновидностей Beta vulgaris L., наряду с сахарной, кормовой, листовым и побеэговым мангольдом, происходит из районов Ассирии, Вавилонии, Ощилии, известна более двух тысяч лег (Жуковский, 1964).

Столовая свекла является двухлетним растением. У двухлетних растений жизненный цикл отличается от такового однолетних и многолетних культур. Двухлетние овощные растения произошли в условиях Средиземноморья, где температура зимних месяцев от +7,4° до •+ 10,8°.

В условиях Средиземноморского климата с жарким засушливым летом, семена созревают летом, осыпаются на землю и прорастают в ооенний дождливый период и растения растут в условиях мягкой зимы, они выработали спездиалшое приспособление для перенесения кратковременных заморозков: при температурах, близких к О3, сахароза, крахмал и другие сложные углеводы гидролизуются до моносахаров, повышающих осмотическое давление и снижающих температуру замерзания клеточного сока Переживая мягкую зиму, растения заканчивают развитие вплоть до созревания семян жарким летом.

Эти биологические особенности средиземноморских растений накладывают свой отпечаток и на агротехнику их возделывания в наших условиях Большой экономический ущерб наносит так называемая «цветушность» корнеплодных растений, некоторых сортов лука капусты и корнеплодов. В условиях затяжной весны или возвратных летних похолоданий закладываются цветоносные побега и растения вместо овощей дают «урожаи» цветоносов с цветами или зачатками семян. В последние десятилетия выведены новые отечественные сорта, утрачивающие «цветушность» однолетних растений. Биологические особенности средиземноморских растений заложены в агротехнику семеноводства этих растений. Корнеплоды, капусту, луковицы лука закладывают на зимнее хранение, во время которого закладываются цветоносы, ранней весной маточники высаживают в поле с тем, чтобы образование семян пришлось на самый теплый период.

В литературе корнеплод рассматривается как целый орган, но тем не менее вклад его частей в транспортные и запасакжцие процессы не одинаковый. Анатомо-морфолэшческие особенности корнеплода Свеклы обыкновенной позволяют его подразделить на три части — головку, шейку и непосредственно корень (Бавтуго, Еремин, 1997). Головка — стеблевое образование и несет на себе листья, нижняя граница ее совпадает с линией проведенной через основания самых нижних листьев, а также содержит конус нарастания листьев (почки возобновления). Головка древеснеет быстрее всего и беднее остальных частей корнеплода запасными углеводами.

Шейка у корнеплода расположена между головкой и корнем, ни боковых корешков, ни листьев она не имеет. Основная масса Сахаров запасается в шейке корнеплода Корень у Свеклы обыкновенной богат сазарами, но основная функция корня заключается в обеспечении растения водой и минеральными веществами.

Сжаронакопитальная функция корнеплода изучена у Свеклы сахарной (Пзвлинова, Прасолова, 1972, 1979).

Корнеплод Beta vulgaris развивается из главного корня и гипокоталя. С 12−14 дня жизни проростка начинаются процессы преобразования корня в корнеплод. При активации камбия возникает перестройка первичного строения на вторичное, а затем сразу и на третичное в результате перехода от монокамбиальносш к поликамбиальности. ГЬликамбиальность возникает в результате деления клеток перицикла и протофлоэмы Этот добавочный «камбиальный» слой откладывает мощное кольцо паренхимы кнаружи от центрального цилиндра Часть клеток этой запасающей паренхимы не утрачивает мфистематическую активность и продолжает делится, увеличивая диаметр корнеплода, так возникает поликамбиальность. Всего камбиальных колец может быть до 8 (рис. 1). Число колец в основном соответствует числу листьев, деленому на 2. Добавочные камбиальные слои образуют преимущественно запасающую светлоокрашенную паренхиму. Кроме запасающей паренхимы дополнительная меристема образует также ксилему и флоэму — образующие темноокрашенное кольцо. Так возникает слоистость корнеплодов Свеклы обыкновенной (Круг, 2000). Известно также, что формирование органов запасания связано с переходом от линейного роста клеток к изодиаметрическому с увеличением их объема (Корзинников, 1971; Реймерс, Корзинников, 1968). Увеличение объема клеток может сопровождаться снижением концентрации всех осмотически активных соединений и по теории «массового потока» определять направление транспорта запасаемых веществ.

Растения выращивали летом в поле на экспериментальном участке СИФИБРа СО РАН Представленные данные являются результатом исследований, проводимых в течение пяти лет: с 1996 по 2000 годы.

ЕЬращивание растительного материала проводили следующим образом. Семена намачивали в водопроводной воде в течение 1−2 часов. Семена.

0,1 см.

Всходы.

Первый год.

2,0 см.

1.1.

21 см.

1.2.

98 2 3.

Период хранения 11 см.

11 см.

III. 1 378.

12 см.

III. 2.

Рис. 1 Схематическое отображение поперечного среза корнеплода свеклы по периодам онтогенеза. Условное обозначение: А — первый год, Б — период хранения, В — второй год. 1 — схематическое обозначение, 2 — периоды онтогенеза, 3 — число дней от появления всходов. высевали в гряды с междурядьями шириной 15 — 20 см, на глубину 1 — 2 см. Корнеплоды размещали на участках по схеме: ширина междурядий 40 см., расстояние между корнеплодами — 30 см. Применение таких схем посадки позволяет проводить необходимые исследования не сокращая площадь питания растений и приближены к условиям производства.

Дружные всходы появлялись через три недели после высева семян. В конце сентября — начале октября, до наступления устойчивых осенних заморозков, свеклу убирали на хранение. Для предотвращения потери массы и сахара корнеплоды хранили в овощехранилище при естественной системе вентиляции в контейнере при температуре О3, +4°. Растения второго года роста начинали формировать листья через неделю после высадки в открытый грунт. Массовое цветение у свеклы наступало во второй декаде июля. В течение всего летнего периода за посевами и посадками ухаживали: проводили периодические прополки, ряхления, поливы и прореживание.

Для проведения анализов брали корнеплоды и листья растений. № допускалось использование поврежденных листьев и корнеплодов.

Культурная Свекла обыкновенная является двухлетним растением. Основываясь на анатомо — морфологических особенностях роста и развития Свеклы обыкновенной онтогенез разделили на периода! первый год роста (I), хранение (II), второй год вегетации (III) (рис. 2). Для выяснения динамики содержания фитогормонов, ионов и Сахаров в растительных тканях Свеклы обыкновенной образцы отбирали в начале и в конце каждого периода, соответственно: в первый год роста у молодых растений (1.1.) и у растений с и.

Рис. 2 Этапы онтогенеза Свеклы обыкновенной, являющейся объектом изучения в данной работе. Условное обозначение: А — первый год роста, Б — период хранения, В — второй год роста. 1 — схематическое обозначение, 2 — периоды онтогенеза, 3 — число дней от появления всходов. вызревшими корнеплодами (1.2.), в начале хранения (II. 1.) и в конце периода (II.2.), во второй год роста у высаженных в грунт растений, наращивающих вегетативную массу (III. 1.), в период массового цветения (III.2.), у растений с созревшими семенами (III. 3.). Каждый период характеризовался преобладающим физиологическим процессом: 1.1. рост корнеплода происходит преимущественно за счет деления клеток, I.2. рост корнеплода осуществлялся за счет растяжения клеток с отложением поступающих в них запасных веществ (сахаров), II — корнеплоды находятся в состоянии покоя, III. 1. — за счет использования запасных питательных веществ из корнеплодов происходило формирование розетки листьев, при высадке корнеплодов в грунт, III.2. — растения цвели и формировали семена, III.3. — растения старели, отмирали корнеплоды, семена созрели.

Завядание создавали выдерживая цветущие растения и хранящиеся корнеплоды на свету при комнатной температуре. Принесенные в лабораторию растения взвешивали и подсушивали на воздухе в течение 48 часов, за это время сырая масса цветущих растений (надземной части и корнеплодов) снижалась на 15 — 20%, а сырая масса у хранящихся корнеплодов снижалась на 5 — 6%. Для восстановления оводненности растения помещали в сосуды с водой на одни — пять суток. Стрессированные растения сравнивали с контрольными, не под вергавшимися завяданию.

Определяли величину относительного содержания воды в высечках из листьев по формуле:

RWC = (FwDw/ SwDw) х 100 (%), водного дефицита = (Sw — Fw/ Sw-Dw) x 100 (%), где Fw — сырая масса (г), Dw — сухая масса (г), Sw — сырая масса водонасыщеиных высечек листа (Wright, 1977). Содержание воды определяли также по разнице Fw-EXv, а также в расчете на сырую или сухую массу:

Fw — Dw/ Fw) х 100 (%), или (Fw — Dw/ Dw) x 100 (%) (Слейчер, 1970).

Гипотермию создавали помещая хранящиеся корнеплоды в морозильную камеру на пять — шестьдесят минут (0,12 — 1 час). Время и интенсивность гипотермии экспериментально подобрано и отражает временную динамику изменений концентраций ионов, фитогормонов и Сахаров.

Так как овощехранилище снабжено естественной системой вентиляции, то температурные условия в овощехранилище не реаулировали. В условиях эксперимента температура в овощехранилище была + 2,8°, в контейнере -+1.8° ± 0.32°. С целью предотвращения перепада температур корнеплоды переносили из овощехрагошища до места проведения опытов в пенопластовых контейнерах, предварительно охлажденных до температуры + 2,8°. Стрессированные растения сравнивали с контрольными, не подвергавшимися охлаждению.

Из факторов внешней среда, влияющих на «яровгоационные» физиологические процессы в покоящихся корнеплодах мы изучали действие пониженных (- 93) и относительно повышенных температур (+ 22°, + 23°). Измерения температуры внутри корегоюдов и взятие проб для анализов проводили через 0,12 — 1,0 час.

В связи с тем, что завядание корнеплодов является лимитирующим фактором завершения онтогенеза и формирования семян Свеклы обыкновенной (Луцилов, 2000) в отдельном опыте мы изучали влияние подсушивания на физиологические процессы развивающихся растений Завядание создавали выдерживая отмытые цветущие растения на воздухе, на свету при комнатной температуре. Подсушенные в течение 48 часов растения взвешивали до и после окончания эксперимента Для восстановления оводненности растения помещали в сосуды с водой на одни — пять суток. Стресофованные растения сравнивали с контрольными, не подвергавпшмися завяданию.

2. Биохимические и физиологические методы исследования.

При проведении экспериментов листья и корнеплоды мыли под проточной водопроводной водой, осушали и использовали для дальнейшего анализа Реактивы, используемые для фиксации и экстракции были предварительно очищены.

Фиксация и экстракция растительного материала.

Ауксины (ИУК и ЙААм). Методику выделения ауксинов: ИУК и ИААм, модифицировали, в связи со сложностью объекта исследования (рис. 3). Фиксировали растительную ткань кипящим 96% этанолом с добавлением 0.015% дитиотретола (Sigma). Образцы оставляли на ночь в холодильнике при + 3.0°. Растительную ткань гомогенизировали на гомогенизаторе MPW — 324 и.

Рис. 3 Сановная схема выделения индольных соединений (Триптофан, ПУК, ИААм) из растительной ткани листьев и корнеплодов Свеклы обыкновенной (по Rekoslavskaya et al., 1992; РЬкословская, 1990). фильтровали через двойной бумажный фильтр в воронке Еюхнера Объединенные этанольные экстракты упаривали на роторном испарителе до водной фракции при температуре не выше 40°. Удаляли липиды и пигменты серным эфиром в присутствии 0.1% МЩ. Водный остаток подкисляли 0.1 N НИ до рН 3.0 и ауксины экстрагировали трижды серным эфиром. Для удаления примесей воды и кислоты эфирную фракцию осушали безводным сульфатом натрия, в расчете 5 гр. соли на 50 мл эфира, фильтровали и упаривали досуха Очистку экстрактов проводили на колонке с Silasorb 600 (LQ ацетонитришм, уравновешенной этим же раствором. Коэффициент потерь составлял 40 — 50%.

Образцы анализировали на жидкостном хроматографе ЖХ 1311, снабженном С18 микроколонкой (250×0.7 мм) и шектрофотометрическим детектором, используя изократический режим элкжрования смесью 45% ацетонитриш в 1% уксусной кислоте. Профили элюции экстракта приведены на рисунке 4.

Абсцизовая кислота (АБК) Выделение и очистку АБК проводили по методу, описанному в Методических рекомендациях по определению фитогормонов (1988), (рис. 5). Фиксированные в жидком азоте растительные ткани массой 50 г гомогенизировали с 250 мл 80% охлажденного этанола. Спиртовые фракции объединяли и упаривали на роторном испарителе при температуре не выше 4СР до водной фазы Для удаления пигментов и других примесей водную фазу подкисляли 10% - ной серной кислотой до рН 2.5 — 3.0, замораживали жидким азотом с последующим оттаиванием при комнатной.

ИААм.

ИУК и ввод.

L/ jUJ.

Рис. 4 Профили элкщни экстракта, выделенного из корнеплода Свеклы становой. А—старт метчика ПУК, Б—образец.

Рис. 5 Основная схема выделения абсциэовой кислоты (АБК) из растительной ткани корне шюдов Овеклы обьпсновенной (Методические рекомендации по определению фитогормонов, 1988). температуре и центрифугировали 20 мин. при 15 000 об./мин. Для удаления примесей из подкисленного водного раствора АБК переэкстрагировали в серный эфир. Из водной фазы в дальнейшем извлекали коньктарованные формы АБК Эфирную фракцию сгущали до 15 — 20 мл и переносили в делительную воронку и трехкратно экстрагировали 5%-ным водным раствором натрия гидрокарбоната (по 15 — 20 мл). Водные фракции объединяли, подкисляли 10%-ным раствором серной кислоты до рН 7.0 и трижды экстрагировали в делительной воронке диэтшювым эфиром (соотношение объемов 1:1). Эфирные фракции, содержащие примеси слабокислой и нейтральной природы отбрасывали. После этого рН водного раствора доводили до 2.5−3.0 и трижды экстрагировали диэтшювым эфиром. Эфирную фракцию концентрировали и высушивали безводным натрием сульфатом и упаривали досуха.

Для извлечения конъюгарованных форм АБК водную фазу после первой эфирной экстракции подвергали щелочному гидролизу. Для этого водный остаток доводили 10%-ным раствором гидрооксида натрия до рН 11.0 и нагревали в колбе с обратным холодильником в течение 40 мин. при 60°. Охлажденный щцролизат подкисляли 10%-ным раствором серной кислоты до рН 2.5 — 3.0 и освободившуюся в результате гидролиза АБК трижды экстрагировали диэтшювым серным эфиром в делительной воронке. Дальнейшую очистку и выделение АБК проводили по описанной выше методике.

Тестирование образцов проводили на жидкостном хроматографе ЖХ.

1311, снабженном С18 микроколонкой (250×0.7 мм) и спектрофотометрическим детектором, используя изокрагаческий режим элкжрования смесью 45% ацетонитрила в 1% уксусной кислоте (рис. б).

Для определения активности фитогормона использовали биотест, основанный на ингибировании удлинения гипокошжй пшеницы и снижения всхожести семян редиса (Кефели и др., 1989). Выделение и очистку образцов проводили по описанной выше методике. Сухой остаток растворяли в 96% этаноле и наносили на хроматограммы по 0.1 мл (на Whatman I (8.2×13 cans, made in eangland by W.& RBalston LTD). Для хроматографии на бумаге использовали ранее подобранную систему растворителей: изопропанолNH (OHЦО (80: 5: 15). Хроматограммы высушивали и вырезали зону Rf 0.2 — 0.3 см. Элкжровали АБК водой, 3.5 мл при +4.0 24 часа Элюаты отделяли на стеклянном фильтре № 1 и использовали для биотеста.

Цитокинины (ЦК). ЕЬзделшие и очистку ЦК проводили по методу (Кулаева, 1973) (рис. 7). Растителытый материал (30 г) гомогенизировали в 50 мл 96% этанола Гомогенат фильтровали через двойной стой фильтровальной бумаги. Объединенные этанольные экстракты упаривали под ваккумом на роторном испарителе при температуре 30° до водной фазы Для очистки экстракта от ингибиторов и пигментов эталацетотом. Эфирные фракции упаривали досуха и анализировали. ГЬсле экстракции эфиром водный остаток нейтрализовали NaHCOj до рН 7 и экстрагировали трижды равными объемами водонаоыщенного N-бутанола Объединенные бутанольные экстракты упаривали на ротационном испарителе под ваккумом при.

ВВОД.

АБК Б.

Рис. 6 Профили эли"дай экстракта, выделенного из корнеплода СЬеклы столовой. А—старт метчика АБК, Б — образец.

РАСТИТЕЛЬНАЯ ТКАНЬ.

Фиксация 96% С2 Н5 ОН.

Экстракция ^ г 80% С2 Н5 ОН.

ЭТАНОЛЬНЫЙ ЭКСТРАКТ.

Упаривание Ваккум, 40 0 г.

ВОДНЫЙ ОСТАТОК.

Экстракция С2 Н5ОС2Н5.

Упаривание.

Ваккум, 40'.

Сухой остаток.

Тонкослойная, бумажная хроматография.

КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ.

БИОТЕХЛИРОВАНИЕ.

Рис. 7 Основная схема выделения цигокининов (ЦК) из растительной ткани корнеплоде" Свеклы обыкновенной (Кулаева, 1983) температуре 40 — 45° досуха и подвергали дальнейшему анализу. ГЪ литературным данным в бутанольных экстрактах все анализиуемые ЦС имеют наивысший коэффициент распределения. Известно, что цщокининнуклеотиды и цитокининглюкозиды остаются в водной фазе после экстрации бутанолом. ГЪэтому водный остаток мы также подвергали анализу.

ГЬлученные эшлацеташые, бутанольные и водные экстракты хроматографировали на бумаге Ватман I в системе растворителей изопропанол-аммиак-вода (10: 1: 1). ГЬ литературным данным в этой системе растворителей инактивированные формы ЦК находятся в области Rf = 0.2 -0.5, а свободные UJC — в области Rf = 0.5 — 0.9. >фоматограммы высушивали и делили на 10 зон. Каждую зову элюировали 3.5 мл 1/75 М фосфатного буфера рНб. З с добавлением 0,01% L-тирозина в течение 3-х часов. Элюаты отделяли на стеклянном фильтре № 1 и использовали для биотеста.

Образцы тестировали на жидкостном хроматографе ЖХ 1311, снабженном С18 микроколонкой (250×0.7 мм) и шектрофотометрическим детектором, используя изократический режим элюирования смесью 45% ацетонитрила в 1% уксусной кислоте (рис. 8).

Для биотестирования использовали так же биотесты основанные на сохранении хлорофилла в отрезанных листьях ячменя (в модификации Кенде) и биотесг на проростках амаранта (Кулвева, 1983). Анализы проводили следующим образом. Растения ячменя (сорт Неван) выращивали в вегетационных сосудах с почвой. У растений в возрасте 14 дней срезали листья первого яруса отступая 2 см от нижнего края листа Листья помещали в.

ВВОД.

Зеатин 1.

Рис. 8 Профили элкждии экстракта, выделенного из корнеплода Свеклы столовой. А — старт метчика ЦК (зеатина), Б — образец. дистиллированную воду в темноту при температуре 25° на 24 час для обеднения хлорофиллом. Затем нарезали отрезки длинной 2 см и переносили их на 3 мл исследуемого раствора, к которому добавляли 250 единиц пенициллина Каждая проба состояла из 4 кусочков. Кусочки инкубировали при 25° в темноте 48 час. Затем определяли хлорофилл Для этого из каждого отрезка выбивали пробковым сверлом по два диска (d = 5 мм). Все восемь дисков растирали в фарфоровой ступке в 96% этаноле. Полученный раствор количественно переносили в центрифужные пробирки на 10 мл и центрифугировали 5 мин. при 3000 об/мин. Затем супернатант сливали и объем раствора доводили в мерной пробирке до 5 мл Оптическую плотность раствора определяли на спектрофотометре (СФ — 26) при 645 и 665 нм прошв контрольного раствора, который получали путам объединения экстрактов хлорофилла из отрезков листьев на воде. Полученные данные выражали в показаниях спектрофотометраЕ545×1000. Эти данные отражали вызванное ЦК отклонение от контроля в содержании хлорофилла в листовых отрезках (Кунаева, 1983).

Для опредешния ЦК активности использовали биотест, основанный на стимуляции синтеза бешцианинов в семядолях шприцы Amaranthus caudatus L. Биосинтез амарашпина в темноте прямо пропорционален логарифму концентрации экзогенных веществ с ЦК активностью и поэтому позволяет дать количественную оценку содержания цитокининов в растительных тканях В своей работе мы использовали амарантусный биотест в модификации В. В. Мазина (1976).

Семена щирицы раскладывали на смоченную водой фшштровольную бумагу в чашке Пзтри и проращивали в темноте при 25 0 в темноте в течение 72 часов. На рассеяном светофильтром зеленом свету у проростков отделяли корешок и раскладывали по 15 штук в чашки Петри на фильтровальную бумагу диаметром 5 см, смоченную 1 мл 1/75 М фосфатного буфера с добавлением L — тирозина в 0.01% концентрации и исследуемьш раствор ЦК или 1 мл элюата зоны хроматограммы ПЬвторность опытов трехкратная. Чашки Пеггри с семядолями ширицы инкубировали в темноте при температуре 25° в течение 18 часов. ПЬсле инкубации проростки помещали в 3 мл 0.1N Ю и дважды замораживали и оттаивали для извлечения бетацианинов. Оптическую плотность бетацианинов определяли на спектрофотометре СФ -16 при 540 нм. Активность и содержание ЦК пересчитывали на активность зеатина (Sigma).

Изучение качественного состава ЦК позволило установить наличие пята веществ, проявляющих цитокининовую активность. В работе приведены данные, подтвержденные двумя биотестами, проявляющими высокую отезцифичность в отношении веществ, обладающих ЦК активностью. При хроматографировании в различных системах растворителей вещества с Rf 0.3 — 0.4 см и 0.5 — 0.6 см были определены как зеатин и зеатинрибозид.

Цнтокининовая активность, совпадающая по хроматографической подвижности с веществами — метчиками (зеатин и зеатинрибозид), была определена в эшлацетатной, бутанольной и водной фракциях.

Появление в водном остатке цитокининовой активности по мнению некоторых авторов (van Staden, 1973; frown, Chamberes, 1973) может быть обусловлена зеатинрибозидом и зеатинглкжозидом. По мнению ряда авторов (Дерфлинг, 1985) эти вещества являются связанными запасными формами цитокинина в растении. Поэтому мы можем предположить, что в водной фракции нами обнаружены связанные формы цитокининов.

Цпокининовая акшвносль была обнаружена и в эфирной фракции. Ив литературных данных известно, что кинетин, изопептеншвденин и изопеаттениладенозил имеют значительные коэффициенты распределения в эфире при кислых значениях рН (Власов и др., 1979). Так как изопептениладенин является эндогенным цитокинином, то можно предположить, что цитокининовая активность в эфирной фракции обусловлена изопептениладенином и его производными.

При изучении динамики количественного изменения ЦК в корнеплодах Свеклы обыкновенной в онтогенезе и при завядании цветущего растения образцы анализировали на На жидкостном хроматографе ЖХ1311, снабженном С18 микроколонкой (250×0.7 мм) и шектрофотометрическим детектором. Г%)и изучении количественного изменения ЦС при стрессировании ранящихся корнеплодов концентрацию веществ определяли по двум биотестам, т.к. синтез бетацианинов и устойчивость хлорофилла напрямую зависят от концентрации ЦКАктивность веществ цитокининовой природы пересчитывали по калибровочному графику на активность зеагина.

Гиббереллиноподобные вещества (ГПВ). В растениях шбберегашны находятся как в свободном состоянии в виде кислот, так и в форме различных соединений с иными физико-химическими свойствами (Муромцев и др., 1973). Использованная в работе схема выделения ГПВ предусматривала первоначальную фиксацию растительного материала, экстракцию ГПВ, очистку методами бумажной и тонкослойной хроматографии и установление качественного состава и физиологической активности с помощью специфических биологических тестов (рис. 9).

Образцы растительной ткани (50 г) гомогенизировали и трижды экстрагировали с 150 мл 80% охлажденного этанола. Ожртовые экстракты объединяли и фильтровали через воронку Вюхнера и упаривали на ротационном испарителе при температуре не выше 45°. Водный остаток переносили в фарфоровые чашки и промораживали при температуре 24° в течение суток, после чего размораживали в обычном холодильнике при 4°, переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали в течение 10 мин при 10 000 об/мин. В виду того, что природные ГПВ представлены большим классом активных веществ, изменяющих свою активность при различных рН среды из супернатанта свободные ГПВ экстрагировали при рН 3.0 эшдацетатом, а связанные ГПВ N — бугонолом при рН 3.0, 7.0 и 8.0. Эшлнцетатные и бутанольные фракции высушивали безводном сульфатом натрия и упаривали досуха.

Для очистки ГПВ использовали метод бумажной хроматографии на Whatman I (8.2×13 cans, made in england by W.& RBalston LTD).

РАСТИТЕЛЬНАЯ ТКАНЬ.

Фиксация 96% С2 Н3 ОН.

Экстракция г 80°/оС, Н, ОН.

ЭТАНЮЛЬНЫЙ ЭКСТРАКТ.

Упаривание.

Ваккум, 40'.

ВОДНЫЙ ОСТАТОК.

Фракция щелочных 11Ш.

Фракция нейтральных ГПВ.

Подкнсленне.

1NH2S04 рНЗ, 0 Экстракция С2 Н50С2Н5 N — бутанолом.

Подщелачивание.

NaOH рН 8,5.

Экстракция.

N — бутанолом.

Подщелачивание.

NaOH рН7,0.

Экстракция.

N — бутанолом.

Упаривание Ваккум, 40'.

Рис. 9 Основная схема выделения гиберреллиноподобньк веществ (ГПВ) та растгельной ткани корнеплодов Свеклы обыкновенной (Муромцев и да, 1973).

Качественный состав 11 IB в анализируемых образцах определяли при помощи хроматографирования в тонком сгое на Silufol (150×150 мм, Avalier, Czechoslovakia).

Сухой остаток растворяли в 96% этаноле и наносили на хроматограммы по 0.1 мл Для хроматографии на бумаге использовали ранее подобранную систему растворителей: изопропанол — NHfOH — Н^О (80: 5: 15). Для хроматографии в тонком слое использовали две системы 1) бензол — нбутанолуксусная кислота (70: 25: 5) и 2) ОСЦ — уксусная кислота — вода (80: 3: 5), нижняя фаза с добавлением 20% этилацетата Для проявления пятен ГПВ гаисшнки Silufol опрыскивали 5% HSO4 в 96% этаноле, просушивали и прогревали 5 мин. при 120? В качестве свидетеля использовали 2 мМ раствор ГКд (Serva). ГЬсда разделения прет пятен ГПВ просматривали в УФ свете.

Для определения биологической активности и количества ГПВ использовали два биотеста, основанных на стимуляции амшюлитической активности эндосперма пшеницы (сорт Скала) и удлинении гипокотеля салата (сорт Берлинский желтый) или огурца (сорт Конкурент). После бумажной хроматографии пластинку делили на 10 зон и ГПВ элюировали дистиллированной водой в течение 3 часов при 4°. Калибровочные графики строили по стандартному раствору вещества — свидетеля.

Стимуляция амилолитической активности эндосперма пшеницы (сорт Скала). Зерновки стерилизовали в 4%-ном растворе гипохлорита 3 часа при 25°, затем интенсивно промывали стерильной водой. Цххперилизованные семена вымачивали в стерильной воде 20 час. при 4°. У набухших семян отделяли зародыш от эндосперма Три кусочка эндосперма пометили в закупориваемые стеклянные бкжсэы, содержащие 1 мл водного раствора анализируемой зоны хроматограммьь Инкубировали 36 час. при 30°. После инкубации материал замораживали и после оттаивания определяли количество Сахаров. Диапазон линейной зависимости метода — от 1С5 до Ю" 3 мг/л.

Удлинение гипокотилей проростков огурца (по Брайену и Хеммингу в модификации Агнистиковой). Семена сорта Конкорд проращивали на влажной фильторовальной бумаге в эмалированных кюветах Семена раскладывали на двойной слой бумага и заливали водой. Проращивали в темноте при 24° трое суток. Для анализа отбирали проростки с семядолями наполовину или полностью освободившимися от семенной кожуры и с шпокотилями длиной 407 мм Проростки высаживали на 0,75%-ный водный агар в фитоконы по 10 штук в каждый. № гипокотили наносили по 1 мкл испытуемого раствора Контрольные растения обрабатывали водой. Инкубировали проросши двое суток при комнатной температуре с периодическим освещением. Затем у проростков измеряли длину гипокотилей. Диапазон чувствительности метода составляет для А} 0,001 мкл на растение, А7 — 0,0001 мкл на растение, Ад -0,0015 мкл на растение.

Удлинение гипокотилей салата (сорт Берлинсжий желтый). Семена салата проращивали на влажной фильтровальной бумаге в чашках Пзтри в темноте 36 час. при температуре 25°. Для биотеста отбирали проросши с длинной гипокоталя 3−4 мм. Проростки помещали в чашки ГЪтри на фильтровальную бумагу с испытуемым раствором (3 мл на каждую чашку). Количество проростков на каждую чашку — 10 штук. Проростки проращивали при непрерывном освещении (300 — люкс), при температуре 25 °C и 90% влажности воздуха Продолжительность проращивания — 3 суток. У проростков измеряли длину гипокотиля. Калибровочный график строили по стандартному раствору ГКз в диапазоне концентраций от 1СТ4 до 10″ 8 М.

При изучении динамики изменения качественного состава гиббереллинов установлено наличие девяти веществ, проявляющих гиббереллиновую активность. В работе приведены данные, подтвержденные двумя биотестами, проявляющими высокую специфичность в отношении веществ, обладающих ГПВ активностью.

По мнению ряда авторов в эфирной фракции содержатся свбодные формы ГПВ, а в бутанольных фракциях — связанные формы (Муромцев и др., 1973; Дерфлинг, 1985). Вещества проявляющие ГПВ специфичеслую активность при кислых рН принято называть кислыми, при нейтральной рНнейтральными и при щелочных (рН 8,0) — щелочными (Муромцев и др., 1973). Анализ связанных ГПВ затруднен в связи с невысокой физиологической активностью веществ, а так же с различным влиянием, оказываемым на растения. РЬльзя упускать из виду, что растения проявляют высокую специфичность по отношению к отдельным ГПВ и, сждовательно, не могут достоверно отражать количественные изменения содержания всех гиббереллинов. ГЬэтому содержание ГПВ выражают в эквивалентах гибберелловой кислоты (А3) и относят к единице сырой или лиофшжжрованной ткани (Муромцев и др., 1973). Тем не менее динамика изменения количественного содержания 111 В в наших опытах, в основном, совпадала.

Для установления количественного содержания ГПВ использовали биотест, основанный на стимуляции амилолетичеосой активности эндосперма семян пшеницы (Муромцев и др., 1973). В качестве стандартного вещества использовали Аз и активность ГПВ пересчитывали на активность А3.

Опеделения концентрации Сахаров, ионов и аминокислот, осмотического потенциала сока, водного дефицита и водного потенциала ткани. Содержание Сахаров в соке определяли по общепринятой методике с использованием антрона (Туркина, Соколова, 1971). Концентрацию суммы Сахаров выражали в мМ, в пересчете на сахарозу.

Содержание ионов определяли в соке. Концентрацию ионов К, Na, Са и Mg определяли на пламенном фотометре. Содержание Р04 проводили по методу Лоури и Лоренса в модификации Скулачева (Кочетов, 1980). Концентрацию NH определяли при помощи реактива Неслера.

Для определения содержание аминокислот в образцах растительную ткань (10 грамм для определения триптофана и 1 грамм для всех остальных аминокислот) кипятили 5 мин. в 96% этаноле с добавлением 0.01% ДТТ (рис. 3). Образцы гомогенизировали, фильтровали и объединенные этанольные экстракты упаривали на роторном испарителе до суха Сухой остаток разводили в 3 мл 0.2N натриевого лимоннокислого буффа рН 2.2, добавляли.

3 мп 10% ТХУ дли осаждения белков и пигментов. Затем центрифугировали образцы 10 мин. при 1000 об/мин. Супернатант упаривают досуха и развод или в 0.5 мп того же буфера Образцы количественно переносили на колонку (20×0.7 см) с ионнообменной смолой (ДАУКС 50 В х 12 100/200). Колонку промывали 50 мл натриевого лимоннокислого буфера, аминокислоты с сорбента смывали 4N пиридином. Вытяжку упаривали досуха Количественный и качественный анализ аминокислотного состава образцов проводили на аминокислотном анализаторе AAA (Mcrotechna, ЧССР) по Т.Д. КЬзаренко (1975).

Осмотический потенциал сока определяли на осмометре типа ОМКА 1Ц-01.

Водный дефицит и водный потенциал ткани определяли помещая тканевые диски в раствор с дистиллированной водой и в растворы ПЭГ 1000 (Steuter, Mokafar, Goodin, 1981; Третьяков, 1982).

Выделение и определение активности митохондрий. К&гтохондрии выделяли из ткани хранящегося корнеплода согласно методике (Нагаев, Вьккребенцезва, 1985). На 30 г ткани корнеплода брали 100 мл охлажденной до + 4,0 ° средой выделения (0,6 М сахароза 0,04 М ЭДГА, 0,012 М цистеина, 0,1% БСА в 0,033 М фосфатном буферерН 7,6 доводили NaOH). Среда промывания содфжала 0,5 М сахарозу, 0,04 М ЭДТА, 0,1% БСА в 0,016 М фосфатном буфере, рН7,8. Среда ресушендирования содержала 0,5 М сахарозу, 0,1% БСА в 0,016 М фосфатном буфере, рН 7,2. В состав реакционной среды входили 0,5 М сахароза, 0,1% БСА, 0,005 М в 0,016 М фосфатном буфере, рН.

7,2.

Поглощение кислорода митохондриями определяли полярографически. Количество митохондриалшого белка определяли по Лоури с БСА в качестве стандарта (Кочетов, 1980).

Для статистической обработки материала применяли методы, позволяющие расчитать средние арифметические значения, дисперсию, коэффициент корреляции и езго ошибку по методу Фишера (Доспехов, 1985).

ВЫВОДЫ.

1. В слабозасугшшвом климате Предбайкалья растения Овеклы обыкновенной первого года жизни решают проблему водообешеченности, как и у себя на родине, в засушливом климате Средиземноморья, формированием мощной корневой системы и корнеплода Низкотемпературный режим «покоя» корнеплодов поддерживается на природном «яровизационном» уровне искусственно в зимних храшшищах. После утраты первичной мощной корневой системы высаженные в открытый грунт маточники становятся чувствительными к характерной для Предбайкалья весенне — летней засухе;

2. Физиологические процессы онтогенеза Свеклы обыкновенной на первом году жизни складываются из двух фаз: процессы опережающего роста объема корнеплода на первой фазе, затем определяющее значение низкого осмотического потенциала в накоплении Сахаров в заключительной фазе формирования корнеплода;

3. Ведущими физиологическими процессами в период «покоя» корнеплодов являются накопление ГПВ, растворимых Сахаров. Стабилшация «яровизационной» температуры внутри корнеплодов осуществляется регулированием сопряженности процессов дыхания и фосфорилирования;

4. Физиологические процессы онтогенеза Свеклы обыкновенной второго года жизни направлены на выживание растений и формирование семян в условиях утраты первичной мощной корневой системы и возможной.