Функциональная активность лейкоцитов, перенесших крионабиоз при — 20NаС

Актуальность темы

.

В настоящее время многими исследователями (Zhang Q., Tiersch T.R., 1995; Svedentsov Е.Р. et al., 1998; Goltsev A.N. et al, 2000; Halle P. et al, 2001; Nishimura M. et al, 2001; Сведенцов Е. П. и соавт., 2000, 2003, 2004;0сташко В.Ф., Осташко Ф. И., 2004; Смольянинова Е.И.и соавт., 2004) активно — изучаются механизмы криоповреждения и криозащиты клеток животного происхождения. Большое внимание уделяется изучению физиологии клеток крови после воздействия различных стресс-факторов, в том числе отрицательных температур (Терентьева Э.И. и соавт., 1966; Цуцаева A.A. и соавт., 2004). Ядерные клетки крови обладают сложной внутренней организацией, повышенными процессами метаболизма и являются весьма неустойчивыми к действию факторов холодового стресса (Белоус A.M., Грищенко В. И., 1994). Необходимость исследования физиологических свойств белых клеток крови человека и разработки способов сохранения их в биологически полноценном состоянии, прежде всего, связана с расширением показаний к применению лейкоцитных концентратов (ЛК). Трансфузии JIK являются эффективным средством профилактики и лечения инфекционного менингита, разлитого перитонита, сепсиса, лучевой болезни и других заболеваний (Ермолович C.B., 1981; Рыжков C.B. и соавт., 1992, 1995; Мельникова В. Н. и соавт., 1993; Cairo M.S. et. al., 1992; Bhatia S. et. al., 1994; Ханевич М. Д., Маринин A.B., 1995; Мирошниченко А. Г. и соавт., 1996; Neppert J., 1996; Herzog R., 1999; Балашов Д. Н., 2001).

На протяжении многих лет (Абезгауз H.H., Леонтович В. А., 1966; Пушкарь Н. С. и соавт., 1978; Ермолович C.B., 1981; Аграненко В. А. и соавт., 1982; Утемов C.B. и соавт., 1995, 1999; Сведенцов Е. П. и соавт., 1999, 2000, 2004) ведется поиск оптимальных методов замораживания и хранения лейкоцитов в состоянии холодового анабиоза. Накопленный опыт свидетельствует о том, что сохранить в биологически полноценном состоянии лейкоциты при положительной температуре (+4°С) можно до 24 часов (Цуцаева A.A., 1983), при температуре от О С до — до 48 часов (Белоус A.M., Грищенко В. И., 1994), при -5°С в условиях гипербарии (при 400 атм) — до 3 недель (Павленко P.A. и соавт., 1988), при -60°С -^-80°С — до 12 месяцев (Лаврик С.С., Когут Г. И., 1971; Утемов C.B., 1995; Galmes A., et al., 1996; Halle P. et-al.,—-2001),-a. при -196°C — в среднем до 20 месяцев (Лобынцева Г. С. и соавт., 1974; Пушкарь Н. С. и соавт., 1974; Аграненко В. А. и соавт, 1982, 1997).

Анализ данных литературы позволяет заключить, что существующие методы замораживания-до—196-G и хранение при-данной температуре, хотя и являются наиболее результативными, но в тоже время требуют применения дорогостоящего криогенного оборудования, жидкого азота и привлечения высококвалифицированного обслуживающего персонала, что делает технологию криоконсервирования сложной, громоздкой и экономически неэффективной, существенно затрудняет ее использование в криобиологической практике.

Поэтому весьма актуальным является создание простого, эффективного и экономичного метода введения лейкоцитов в холодовой анабиоз без использования жидкоазотной технологии при других температурах, в том числе субумеренно-низких тем более, что в отечественной и зарубежной литературе метод сохранения лейкоцитов в функционально полноценном состоянии при температуре -20°С не описан.

Для защиты различных клеток организма от неблагоприятного воздействия холодового стресса используют различные криопротекторы: глицерин, диметилсульфоксид (ДМСО) и другие, которые не являются абсолютно безвредными для организма и требуют удаления перед их применением с помощью отмывания (Аграненко В.А., Тибилова Н.Н.Д997). Менее токсичный криопротектор диметилацетамид (ДМАЦ) в нашей стране не производится. Поэтому необходима разработка нетоксичного, эффективного и не требующего отмывания хладоограждающего раствора. С другой стороны, для сохранения функциональной активности клеток требуется применение щадящей и нетрудоемкой программы охлаждения. Данным условиям отвечает экспоненциальная программа замораживания (Гордиенко Е.А., Пушкарь Н. С., 1994).

Таким образом, дляизучения физиологических особенностей— лейкоцитов, перенесших холодовой анабиоз при -20°С, актуальной остается разработка технологии замораживания и хранения их в условиях субумеренно-низких температур.

Разработка данного метода сохранения лейкоцитов в полноценном^—' состоянии имеет и большое теоретическое значение, так как касается высокодифференцированных со сложными функциями клеток организма. Выяснение условий введения таких клеток в холодовой анабиоз при данной температуре и выведения из него создаст теоретическую основу для разработки подобных методов в отношении высокоорганизованных клеток и тканей организма млекопитающих и человека.

Цель исследования — определить функциональную активность лейкоцитов, перенесших холодовой анабиоз при —20°С, достигнутый применением экспоненциальной программы охлаждения и нового криозащитного раствора.

Задачи исследования: 1. С целью выбора оптимального хладоограждающего раствора провести сравнительную характеристику влияния трех вариантов растворов (№№ 1, 2, 3) на сохранение жизнеспособности и функциональной активности лейкоцитов крови человека, замороженных по экспоненциальной программе до -20°С и хранившихся в условиях холодового анабиоза в течение 24 часов.

2. Изучить жизнеспособность и морфологический состав лейкоцитов, фагоцитарную и метаболическую активность нейтрофилов и моноцитов, перенесших криоанабиоз (-20°С) продолжительностью 1−90 суток под защитой оптимального варианта хладоограждающего раствора.

3. Оценить в опытах на животных острую и хроническую токсичность и пирогенность оптимального хладоограждающего раствора и установить переносимость аутологичных лейкоцитных концентратов после их———————хранения в течение 1 суток при -20°С.

Научная новизна. В лабораторно-экспериментальном исследовании впервые изучены функциональные и морфологические свойства лейкоцитов, вышедших из холодового анабиоза при достигнутого с использованием оригинального хладоограждающего раствора и экспоненциальной программы замораживания, показано, что в этих условиях сохранить фагоцитарную активность нейтрофилов и моноцитов, целостность плазматической мембраны лейкоцитов, стабильность их морфологического состава и их общее количество на высоком уровне возможно в течение 21 суток.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты работы расширяют представления о механизмах криоповреждения и криозащиты лейкоцитов крови человека, в том числе о высокой жизнеспособности лейкоцитов в условиях применения гексаметиленбистетраоксиэтилмочевины (ГМБТОЭМ) и оксиметилэтилпиридина сукцината (ОМЭПС) при -20°С. Дано научное обоснование криозащитных свойств разработанного хладоограждающего раствора, ингредиентами которого являются вещества отечественного производства — криопротектор смешанного действия ГМБТОЭМ и мембраностабилизирующее и антиоксидантное веществоОМЭПС. На данный раствор получен патент на изобретение № 2 240 000.

РФ) от 20.11.2004 года. Кроме того, в опытах на экспериментальных животных доказана безвредность этого раствора на клеточном и организменном уровнях. Для высокой функциональной и морфологической сохранности лейкоцитов крови человека, подвергнутых холодовому анабиозу при -20°С, предложен эффективный недорогостоящий и доступный метод, включающий в себя применение хладоограждающего раствора, медленной экспоненциальной программы охлаждения, быстрого отогрева. Доказано,———что применение экспоненциальной программы замораживания лейкоцитов обеспечивает высокую эффективность криоконсервирования и является более предпочтительной, т.к. она значительно сокращает продолжительность и трудоемкость^ процедурызамораживания,—подходит—для —взвеси, содержащей разные популяции клеток. Установлено, что для осуществления данной процедуры замораживания не требуется применение дорогостоящей жидкоазотной технологии, возможно использование электрического морозильника для осуществления экспоненциальной программы и не требуется высокой квалификации обслуживающего персонала. На основе данных об отсутствии пирогенности, острой и хронической токсичности оригинального хладоограждающего раствора, о полноценной морфофункциональной сохранности замороженных с ним клеток дано заключение о возможности и безопасности внедрения его в работу научных лабораторий и криобиологическую практику.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Функциональная активность и морфологическая полноценность лейкоцитов, введенных в холодовой анабиоз при -20°С, сохраняются на высоком уровне в течение 21 суток.

2. Хладоограждающий раствор, содержащий ГМБТОЭМ и ОМЭПС, и являясь нетоксичным, апирогенным, не требующим отмывания после оттаивания биообъекта, способствует сохранению функциональной активности лейкоцитов, подвергнутых криоанабиозу при -20° С. 3. Экспоненциальная программа введения лейкоцитов в холодовой анабиоз способствует сохранению их жизнеспособности и потому наряду с разработанным хлад о ограждающим раствором может использоваться для замораживания лейкоцитов при температуре —20°С.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы регионального экологического мониторинга: теория, методика, практика» (Киров, 2003), на заседании Кировского отделения физиологического общества имени И. П. Павлова (Киров, 2004), на научной сессии Кировского филиала Российской Академии Естествознания (Киров, 2004), Ученом Совете Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, 2004), Международной конференции «Сохранение генетических ресурсов» (СанктПетербург, 2004), заседании Кировского областного научного общества гематологов и трансфузиологов (Киров, 2005).

Личное участие автора в получении результатов. Автором были выполнены все исследования по изучению функциональных свойств нативных и размороженных лейкоцитов и проведена статистическая обработка результатов исследования. Автор принимал участие в разработке метода введения лейкоцитов в холодовой анабиоз при -20°С, в проведении биологических испытаний криозащитного раствора и в написании статей.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 3 в центральной печатиимеется 1 патент.

выводы.

1. Оптимальным криозащитным раствором, сохраняющим жизнеспособность, морфологический состав и фагоцитарную активность нейтрофилов, введенных в состояние криоанабиоза (-20°С) по экспоненциальной программе и хранившихся в течение 1 и 21 суток, признан раствор № 2, содержащий криопротектор ГМБТОЭМ (14% в конечной концентрации) и мембраностабилизирующее, антиоксидантное и антигипоксантное вещество ОМЭПС (0,075%). В его присутствии сохраняется в течение 1 суток 95,25% лейкоцитов, жизнеспособными из которых являются 84,00%, а фагоцитарной активностью обладают 82,33% нейтрофилов. Способность проявлять криозащитные свойства у данного раствора сохраняется в течение 45 суток (при ~+60°С), что эквивалентно й годам хранения при+4°С.

2. Оптимальным сроком хранения лейкоцитов в условиях криоанабиоза (-20°С) являются 21 сутки, в течение которых сохраняется 90,91±7,56% лейкоцитов, из них 89,27±6,84% остаются жизнеспособными. Фагоцитарная активность нейтрофилов составляет 71,67±10,82%, их метаболическая активность (НСТ-тест) повышается в 3 раза. Фагоцитарная активность моноцитов не изменяется после размораживания при всех сроках хранения. Метаболическая активность моноцитов увеличивается в зависимости от сроков нахождения клеток в состоянии холодового анабиоза: через 1 и 14 суток — в 6 раз, через 21 сутки — в 12 раз, а через все последующие сроки (2890 суток) — в 26 раз.

3. Хладоограждающий раствор № 2 является нетоксичным и апирогенным, так как не вызывает гибель животных и не изменяет их поведения, показателей ЭКГ, гемограммы, урограммы, не повышает ректальную температуру, не приводит к деструктивным изменениям органов. Физиологически активные аутологичные лейкоцитные концентраты, подвергнутые холодовому анабиозу при -20°С с хладоограждающим раствором, не требующим отмывания после размораживания, при внутривенном переливании не вызывают реакций и осложнений у экспериментальных животных.

4. Применение экспоненциальной программы замораживания и оригинального хладоограждающего раствора является эффективным и доступным методом для хранения лейкоцитов в условиях субумеренно-низкой температуры (-20°С), что может использоваться для криофизиологии и трансфузиологии.