Генетическая модификация дистрофин-дефицитной мышечной ткани в клеточной терапии наследственных миодистрофий

Актуальность проблемы.

К настоящему времени согласно данным МЗ РФ в России зарегистрировано около 2,5 млн. людей, страдающих двигательными нарушениями различного генеза. Медико-социальная реабилитация таких больных резко ограничена наличием органических дефектов мышечной ткани, а также центрального и периферического нейронов. Среди этих заболеваний особое место занимает прогрессирующая мышечная дистрофия Дюшенна / Беккера (МДД/Б), которая является одним из наиболее тяжелых наследственных болезней человека. Заболевание начинается в раннем возрасте, быстро прогрессирует, приводя к обездвиживанию к концу первого десятилетия жизни и смерти при явлениях сердечной и дыхательной недостаточности к концу второго десятилетия.

В последние годы достигнут большой прогресс в изучении природы данного заболевания, идентифицирован ген и белок, ответственные за развитие миодистрофии, налажена система ДНК-диагностики. Однако терапия болезни по-прежнему остается безуспешной. Большие надежды на успех в лечении этого заболевания были связаны с генотерапией. Действительно, первые работы по трансгенозу минигена дистрофина мышам шёх, были обнадеживающими. Однако, как стало ясно из последующих исследований, эффект от трансгеноза оказался непродолжительным. Возникли проблемы с доставкой генетических конструкций в ткань, а также выраженный иммунный ответ на повторное введение минигена в составе вирусных носителей (1).

Новым направлением в лечении МДД/Б могла бы стать клеточная терапия. В основополагающем исследовании А. Н. Студицкого (1977) и его сотрудников (Булякова и соавт, 1995) было показана высокая способность стимуляции репарации поврежденной мышечной ткани суспензией измельченных мышц. В работах П. Лоу (114) показана эффективность терапии МДД/Б размноженными в культуре миобластами, которыми обкалывались мышцы больных. Однако, как оказалось в последующем, клиническое действие таких процедур было незначительным, а стоимость крайне высокой. Кроме того, такие трансплантации требовали интенсивной терапии иммуносупресснтами с развитием характерных осложнений от их применении. Новые надежды на эффективную терапию МДД/Б появись после установления высокой пролиферативной активности и пластичности эмбриональных предшественников миогенеза, а также их способность восстанавливать поврежденные ткани (Г.Т. Сухих, B.C. Репин, 1998). Показаны большие терапевтические возможности лечения заболеваний нервной системы трансплантацией эмбриональных клеток (A.C. Брюховецкий, 2003; М. А. Александрова, А, В, Ревищин, Л. И. Корочкин, 2000).

Новый импульс к применению цитотерапии МДД/Б был получен после открытия стволовых клеток независимо друг от друга научными исследованиями Джона Герхарда и Джеймса Томсона в 1998 году. Оказалось, что стволовые клетки обладают выраженным дифференцировочным потенциалом и способностью компенсировать самые различные тканевые дефекты. Это определило начало нового поиска терапии МДД с помощью стволовых и прогениторных клеток. Соответственно, задачей дальнейшего развития этого направления исследований остается всестороннее изучение возможных механизмов влияния на дистрофин-дефицитные мышцы различных типов клеток предшественников миогенеза, в том числе эмбриональных миобластов и мезенхимальных клеток, а так же комплексный подход к диагностике преди посттрансплантационного состояния.

Новым практически не исследованным путем клеточной терапии не только МДД/Б, но и других патологических процессов, является изучение эффекта действия стволовых клеток при межвидовых трансплантациях.

Начатые в 1912 году работы С. С. Воронова (прообраз литературного персонажа М. Булгакова профессора Преображенского) по пересадке клеток щитовидной железы шимпанзе в щитовидную железу ребенка, больного врожденным гипотиреозом развития не получили. Это было обусловлено кратковременностью положительного действия пересадки вследствие развивающейся иммунологической несовместимости тканей донора и реципиента, механизмы которой тогда были неизвестны. Понятно, что наличие дешевого источника клеток в ксеногенных трансплантатах, в случае их успешности, решает множество проблем, в том числе и этических. Трансплантации стволовых клеток животных человеку теоретически вполне возможно, учитывая мощный стимулирующий бласттрансформационный потенциал чужеродных клеток и относительно низкую иммуногенность стволовых клеток. Эта магистральная идея и легла в основу настоящего исследования, являющегося первой попыткой изучения терапевтического влияния ксеногенных (человек — мышь) трансплантаций на примере одного из самых тяжелых и распространенных заболеваний, каким является МДД/Б.

Таким образом,.

Целью настоящего исследования явилось определение возможности генетической модификации дистрофин-дефицитной мышечной ткани мышей с наследственной миодистрофией при воздействии на нее ранними предшественниками миогенеза человека.

В работе поставлены следующие конкретные Задачи:

1. Определение выраженности и длительности эффекта индукции синтеза дистрофина у экспериментальных дистрофин-дефицитных мышей шёх с помощью ранних предшественников миогенеза человека.

2. Мониторинг биохимических и иммунологических показателей активности дистрофического процесса дои после трансплантации.

3. Комплексная оценка функционального состояния различных систем организма экспериментальных животных в ответ на ксеногенные клеточные воздействия.

Научная новизна.

Впервые сделана успешная попытка генетической модификации дистрофин-дефицитной мышечной ткани мышей с наследственной мышечной дистрофией (линия тс! х) путем ксенотрансплантации культуры эмбриональных клеток миогенного ряда человека.

Впервые получены данные о высокой пластичности трансплантированных ксеногенных клеток, их способности ассоциироваться с мышечными волокнами реципиента и компенсировать генетический дефект.

Так же впервые показаны низкая иммуногенность трансплантированных ксеногенных клеток, которые в течение длительного времени функционировали в мышечной ткани мышей-реципиентов без какой-либо иммуносупрессии. В то же время, пересадка миобластов, полученных из мышечной ткани генетически близких (отеческих) биопсий, как следует из работ ряда авторов, оказалась менее успешной из-за быстрого развития отторжения пересаженных клеток. Даже при условии интенсивной иммуносупрессии циклоспорином время переживания и функционирования пересаженных клеток было меньшим, чем в наших экспериментах. Это указывает на возможность большего эффекта при использовании ксеногенных клеток, при этом очевидно, что фактором успеха при трансплантации является не столько генетическое родство трансплантированных клеток и тканей реципиента, сколько онтогенетический статус этих клеток. Не исключено, что ксенотрансплантация является дополнительным фактором усиления репаративных процессов в тканях хозяина за счет бласттрансформации клеток реципиента.

Впервые проведено комплексное исследование различных эффектов трансплантации: оценка состояния и возможностей двигательного аппарата, определение активности биохимических маркеров миодистрофического поражения (креатинкиназа, лактатдегидрогеназа), показателей иммунного статуса.

Впервые дана оценка состояния различных тканей и внутренних органов экспериментальных животных при локальных введениях эмбриональных клеток. Показана положительная реакция таких трансплантаций на сердечную мышцу, что делает перспективным клеточную терапию миокардиодистрофий и кардиомиопатий.

Научно-практическая значимость.

Получены данные о возможной компенсации генетического дефекта с помощью клеточной терапии такого тяжелого наследственного заболевания как миодистрофия Дюшенна, что определяет новый этап в разработке этиологической и патогенетической терапии наследственных миодистрофий. Показано, что для проведения такой терапии не обязательно использовать генетически родственный клеточный донорский материал. По нашим данным лучший терапевтический эффект возникает при ксеногенных трансплантациях. Это исключительно важно для поиска дешевого клеточного материала, получаемого от животных, филогенетически близких по иммунологическим маркерам. Учитывая неспецифический характер действия трансплантированных клеток и их способность генетически модифицировать и корректировать различные дефекты, лечение пересадками ранних предшественников миогенеза можно использовать при большом количестве различных мышечных патологий как наследственной, так и экзогенной природы. Можно также предположить, что настоящее исследование станет новым стимулом к поиску эффективной клеточной терапии болезней человека.

выводы.

1. Ксенотрансплантация ранних предшественников миогенеза человека мышам тс1х с наследственной миодистрофией (аналог мышечной дистрофии Дюшенна у людей) приводит к генетической модификации скелетной мускулатуры с восстановлением синтеза дистрофина, утерянного мышцами в результате генетического дефекта.

2. Трансплантированные клетки сохраняют свою жизнеспособность в течение длительного срока (не менее 5 месяцев) и функционально активны. Они мигрируют вдоль поврежденных волокон, вступают во взаимодействие как между собой с образованием миотубулярных структур, так и с мышечными волокнами мышей-реципиентов.

3. После трансплантации активируется ген дистрофина донорских клеток. В результате в мышечных волокнах мышей-реципиентов синтезируется полноразмерный человеческий дистрофии. Синтез сохраняется в течение длительного срока, не менее 5 месяцев.

4. Динамическое изучение маркеров дистрофического процесса дои после трансплантации выявило наличие фенотипически значимого улучшения состояния животных с генетически модифицированными мышечными волокнами. Это проявлялось снижением показателей активностей креатинфосфокиназы и лактатдегидрогеназы.

5. Специфической особенность ксенотрансплантации ранних предшественников миогенеза является отсутствие выраженных явлений отторжения, что проявляется длительным периодом сохранения функциональных свойств трансплантата в условиях отсутствия какой-либо иммуносупрессии. Однако отмечается увеличение числа активированных (СБ25+) лимфоцитов и моноцитов на 4 сутки после трансплантации, что может указывать на активацию иммунной системы и на усиление репаративных процессов.

6. Ксеногенная трансплантация улучшает функциональное состояние опорно-двигательного аппарата у мышей с наследственной миодистрофией, что особенно наглядно проявляется при проведении плавательного теста. Даже спустя 30 дней после трансплантации продолжительность плавания у мышей тс1х была достоверно выше, чем до введения РПМ.

7. Отмечено положительное влияние пересадки эмбриональных клеток на состояние сердечно-сосудистой системы: восстановление нормального пульса, улучшение кровоснабжение миокарда и нормализация процессов его реполяризации.

8. Отдаленная межвидовая трансплантация эмбриональных предшественников миогенеза в системе «человек-мышь» не только возможна, но и способна вызвать не только заместительный эффект в случае генетической аномалии, но и оказать общестимулирующее влияние на весь организм реципиента. Это открывает новые перспективы в развитии трансплантологии, клеточной терапии и, в частности, в лечении прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Спектр рассмотренных в настоящей диссертации проблем имеет отношение к одной из наиболее актуальных и перспективных проблем современной медицинской генетики — возможности направленной генетической модификации тканевых образований с наследственно-детерминированной-патологией.

До недавнего времени наиболее эффективным путем решения такой задачи считался перенос здорового гена в ткани мишени в составе генноинженерных конструкций. Однако, как стало очевидно, позднее генотерапия наследственных заболеваний пока оказалась мало продуктивной. Это обусловлено сложностями доставки генных конструкций в ткань, кратковременностью их действия, наличия иммунного ответа на введения (1). Кроме того, даже в случае удачной интеграции нужного гена, в геном пораженных соматических клеток, полного восстановления их функции, очевидно, достичь крайне сложно.

Это обусловлено тем, что возникшие в организме к этому времени многочисленные патологические процессы, запущенные первичным действием мутантного гена, введением «здорового» гена едва ли можно устранить. Хорошим примером данного положения является безуспешная попытка генотерапевтического воздействия на мышечную ткань при.

МДД/Б трансгенозом минигена дистрофина в составе аденовирусного или других носителей. Даже априори трудно себе представить возможность терапевтического воздействия на дистрофическую мышечную ткань транспортированного минигена, так как к моменту его введения мышечные волокна будут морфологически грубо изменены: потеря ими полигональной структуры, централизация саркоплазматических ядер, наличие фокальных некрозов, а в отдельных фрагментах потеря мышечными волокнами анатомической целостности.

Несформированность дистрофин-ассоциированного комплекса приводит к нарушению межтканевых взаимодействий (16, 19) — между всеми элементами двигательной единицы: мышечными волокнами,.

— 118соединительной тканью, сосудами и нервными окончаниями, каждый их которых претерпел к этому моменту сложные морфологические изменения. В этих условиях восстановление биосинтеза дистрофина введением минигена будет носить лишь фрагментарный характер и не исправит всего комплекса сложных морфо-функциональных расстройств в дистрофической мышечной ткани. Генотерапия зиготы, несущей мутантный ген, остается единственным возможным путем генно-инженерного решения проблемы, однако этот путь едва ли получит развитие из-за его сложности и недостаточной гарантированности успеха. Значительно рациональнее тестировать зиготы женщин носительниц гена МДД на наличие мутантного гена. Отбирая, таким образом, здоровые зиготы, или, по крайней мере, зиготы, детерминированные к развитию ребенка женского пола.

Совершенно иные перспективы открывает применение для терапии МДД стволовых клеток не миогенного происхождения или еще предпочтительнее ранних предшественников миогенеза (мезенхимальных стволовых клеток, сателлитных клеток, эмбриональных миобластов), которые можно получить из эмбриональной мышечной ткани после ее размельчения, активации в культуре с дифференцировкой на прогениторные элементы скелетных мышц.

Введение

таких клеток в пораженную мышечную ткань теоретически способно оказать влияние на все элементы двигательной единицы: мышечные волокна с восстановлением синтеза дистрофина за счет избирательной экспрессии гена этого белка миобластамизаполнение брешей в зонах фрагментации мышечных волокон, новообразование новых волокон (действие сателлитных клеток и эмбриональных миобластов), а также благоприятное воздействие на провизорные структуры за счет мезенхимальных клеток (соединительная ткань, сосуды).

Проведенное нами исследование эффектов трансплантации РПМ человека в дистрофированную мышцу мышей тс! х продемонстрировало правомочность теоретических допущенийо возможности эффективного терапевтического воздействия на пораженную мышечную ткань.

Прежде всего, важнейшим итогом проведенной работы является установление факта длительного сохранения жизнеспособности пересаженных клеток в ткани хозяина. При этом оказалось, что характерные для аутогенных трансплантаций эффекты быстрого развития процессов отторжения вследствие иммунологической несовместимости, не подавляемой мощной иммунносупрессией, при трансплантации ксеногенного материала были выражены значительно менее. При морфологическом исследовании не выявлялись характерные для процессов отторжения клеточные реакции с образованием воспалительных инфильтратов, макрофагальных скоплений лишь только на третьем — пятом месяцах после трансплантации признаки отторжения начинали проявляться, что очевидно приводило к неуклонному снижению числа дистрофин-положительных волокон. Параллельно с клеточной реакцией отторжения появлялись и иммунологические признаки развития этих процессов — увеличение количества С025+лимфоцитов и С025+моноцитов. Как нами уже подчеркивалось в обзоре литературы, реакция отторжения при аутогенной пересадке мышечных клеток или миобластов, полученных из зрелой мышечной ткани, выявлялись в ближайшие после трансплантации времени. Причина столь низкого иммунного ответа при ксеногенной трансплантации остается до конца не ясной.

Стоит отметить, что на ранних сроках после трансплантации (до 14 суток) большая часть клеток мигрирует от зоны введения вдоль мышечных волокон. Введенные РПМ вступают с ними во взаимодействие, создают подобие муфт вокруг мышечных волокон и скапливаются в местах их анатомических повреждений, «блокируя» бреши в участках разрывов. Трансплантированные клетки сливаются с хозяйскими с хозяйскими мышечными волокнами с формированием химерных структур, доставляя внутрь свои ядра, сохраняя свою видовую.

— 120специфичность, а следовательно и способность экспрессировать гены человека. Как было показано в другом исследовании (55), именно на этих ранних сроках (до 10 суток) после трансплантации развертывается основная картина компенсаторного миогенеза: синтез миогенных факторов (МуоЭ, Му55, миогенин), слияние клеток с мышечными волокнами, начало с синтеза дистрофина.

Нами было установлено, что трансплантация ксеногенных РПМ определяет более отчетливый и длительный синтез дистрофина человека в волокнах мышей-реципиентов спустя 1 месяц после трансплантации. Этот синтез наблюдался и на поздних стадиях исследования до 5 месяцев. При этом те волокна, в которых появился дистрофин человека, изменили свою морфологию — они приобрели полигональную форму, а их собственные ядра заняли характерное для здоровых мышц субсарколемальное положение. Однако, со временем отмечается снижение количества волокон, в которых синтезируется дистрофин человека, со временем после трансплантации. Такое медленное нарастание дегенеративных изменений в мышечной ткани мышей-реципиентов, по-видимому, можно связать с несколькими факторами.

Во-первых, это результат нерезко выраженной иммунной агрессии, которая возможна в случае возникшей барьерной толерантности вследствие образования химерных мышечных волокон или же низкой иммуногенности трансплантированных клеток. Ядро клетки человека, оказавшись в составе мышечного волокна мыши, начинает продуцировать собственные белки, при этом возможно только те, которые необходимы для нормального функционирования данного волокна, исключая антигены гистосовместимости. Тем самым волокна, появившиеся в результате слияния донорских клеток с поврежденными участками хозяйских мышечных волокон или же с активированными сателлитными клетками мышей-реципиентов, в меньшей степени подвергаются иммунной агрессии, чем новые волокна, целиком построенные из донорских РПМ.

Во-вторых, как установлено, дистрофин человека является мощным антигеном для иммунной системы мышей тёх. Генетически модифицированные мышечные волокна мышей-реципиентов постепенно вновь подвергаются дистрофическим изменениям вследствие механических воздействий при мышечных сокращениях и от других факторов. При этом происходит снятие барьерной толерантности для дистрофина человека вследствие разрушения сарколеммы мышечных волокон и окружающей их базальной мембраны. Возникает иммунная реакция на дистрофин человека, и эти уже частично разрушенные мышечные волокна подвергаются иммунной агрессии.

Как было сказано ранее, дистрофин стабилизирует сарколемму мышечного волокна от повреждений при механической нагрузке. В случае дефекта его синтеза происходит разрушение сарколеммы волокна и проникновение в кровь биологически активных веществ, ионов, а также маркерных ферментов: креатинфосфокиназы (КФК) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Как мы установили, спустя месяц после трансплантации РПМ активность КФК у мышей-реципиентов резко упала до уровня, близкого к нормальным значениям, что в свою очередь свидетельствует в пользу возникшей стабилизации сарколеммы мышечных волокон за счет репаративной пластики «проколов» в сарколемме волокон синтезированным дистрофином человека. Спустя 2 месяца после трансплантации активность КФК вновь снизилась, но менее значительно, оставаясь при этом на нормальных значениях. Однако уже на сроке 4 месяца после трансплантации активность КФК вновь вернулась к первоначальному высокому значению, что свидетельствует в пользу нарастающих дегенеративных изменениях в мышечной ткани мышей-реципиентов — падением синтеза дистрофина на этом сроке и возвращением к исходному состоянию мышечной ткани. Аналогично изменялась активность ЛДГ. Что характерно, ксеногенный дистрофин почти также стабилизирует сарколемму мышечного волокна, как и собственный дистрофин мыши, что свидетельствует, очевидно, об.

— 122универсальности молекулярных взаимодействий и механизмов в мышечной ткани.

Как мы установили в нашей работе, функциональные изменения скелетной мускулатуры мышей тёх, оцененной нами по показателям плавательного теста, имели четкую зависимость от морфологических и биохимических показателей. эффекта трансплантации. Как подчеркивалось ранее, мыши тс! х характеризуются сниженной двигательной активностью вследствие патологических изменений в скелетной мускулатуре, сердечной мышце и дыхательной системе. Однако, спустя 1 месяц после трансплантации обнаружилось возрастание двигательной активности мышей-реципиентов в виде увеличения времени их плавания. Эта тенденция сохранялась на сроке до 4 месяцев и более. Стоит отметить, что увеличение двигательной активности мышей-реципиентов сохраняется также на фоне повышения активности КФК. Как нам представляется, это связано с дополнительными компенсаторными механизмами, в частности, с положительными изменениями со стороны сердечно-сосудистой системы.

Среди показателей улучшения состояния сердечно-сосудистой системы мы отметили увеличение частоты сердечных сокращений (ЧСС) с низких патологических значений (300−400 уд/мин) до нормальных значений (600−700 уд/мин) у ряда мышей с брадикардией и признаками сердечной недостаточности. Также мы зафиксировали у части мышей улучшение кровоснабжения миокарда в виде исчезновения ЭКГ признаков ишемии.

Это позволяет считать, что введенные клетки действуют не только местно в мышце, подвергшейся трансплантации, но и системно, оказывая влияние на многие ткани, в частности на эндокринную, нервную, сердечно-сосудистую, иммунную, кроветворную системы и др. (рисунок 41). На нем мы представили схему возможного системного воздействия РПМ человека на ткани и органы мышей шёх.

Внутримышечное введение человеческих ранних миогенных предшественников (РМП) (750 тыс, клеток на мышь).

Рисунок 41. Системное действие трансплантированных РПМ человека на организм мыши-реципиента.

Это системное воздействие может быть опосредовано как через действие цитокинов и медиаторов, выделяемых самими клетками, так и благодаря прямой эмиграции РПМ из поперечно-полосатых мышц в кровоток, а затем и в органы мишени. Нами также не исключается возможность активации за счет эмбриональных медиаторов, выделяемых РПМ, внутренних компенсаторных механизмов и, как следствие, выбросу в кровоток собственных стволовых клеток их костного мозга и других донорных органов и миграции их в органы мишени. Так известно, что после трансплантации мезенхимальных стволовых клеток человека mdx мышам произошло увеличение экспрессии’мышиных транскрипционных миогенных факторов в 6 раз интенсивнее, по-сравнению с эффектом от введения плазмиды, содержащей ген дистрофина человека,(55).

Из ряда литературных источников известно, что некоторый процент внутримышечно трансплантированных миогенных стволовых клеток (Sca-1± CD34″ - L-selectin+) обнаруживается в костном мозге (0,1- 0,5% клеток), печени (около 2%), диафрагме (около 33%) и периферической крови (менее 1%) спустя 1 неделю, а в случае внутривенной трансплантации уже через 2 часа после введения. У летально облученных mdx мышей процент чужеродных клеток в периферической крови возрастает со временем после трансплантации ксеногенных миогенных клеток вместе с собственными гемопоэтическими стволовыми клетками, что свидетельствует о возможности гемопоэтической дифференцировки ряда миогенных клеток после их эмиграции в костный мозг мышей-реципиентов (184).

Проведенное нами исследование на выявление в периферической крови мышей-реципиентов клеток с ядрами, положительно окрашенными на человеческий ядерный антиген (human nucleus), не дало достоверный результат, вероятнее вследствие незначительного процента ксеногенных клеток в крови у мышей-реципиентов. Однако, по нашим данным спустя 14 суток после внутривенной трансплантации клетки человека были обнаружены в печени и селезенке мышей-реципиентов.

— 125.

На системный характер действия трансплантированных РПМ указывает обнаруженные нами у части животных увеличение продолжительности жизни, а также положительная динамика некоторых признаков старения животных в виде восстановления шерстяного покрова на местах возрастной алопеции.

Таким образом, на основании вышеизложенного мы установили некоторые общие закономерности регенераторных механизмов в дистрофичных мышцах при ксенотрансплантации эмбриональных РПМ человека. На начальных этапах посттрансплантационного периода происходит значительное нарастание компенсаторных регенеративных изменений, важнейшим проявлением которого является генетическая модификация мышечных волокон хозяина путем активации гена дистрофина трансплантированных РПМ человека. Этот дистрофии является функционально активным, что приводит к стабилизации сарколеммы мышечных волокон мышей миопатов и как следствие уменьшению активности сывороточной креатинфосфокиназы и лактатдегидрогеназы в плазме крови. Признаки превалирования процессов регенерации над процессами дегенерации наблюдается на сроках до 2−3 месяцев после трансплантации, затем наступает некоторая стабилизация и равновесие этих двух тенденций, а через 4−5 месяцев после трансплантации — превалирование дегенеративных изменений. Это фактически выражается в увеличении активности сывороточной КФК и ЛДГ и значительному снижению количества дистрофин-позитивных волокон к 4−5 месяцам после трансплантации. При этом стоит отметить, что скорость дегенеративных изменений на всем протяжении эксперимента остается относительно постоянной.

Целесообразно еще раз подчеркнуть значение того факта, что в нашем исследовании была продемонстрирована эффективность межвидовой трансплантации, которая, по крайней мере, не уступает таковой при трансплантации гомологичных РПМ. Само по себе это исключительно важно не только с теоретической, но и с практической.

— 126точки зрения. Понятно, что подбор наиболее полно отвечающих задачам в восстановлении функций патологически измененных мышц клеток позволяет использовать РПМ животных в качестве источника эмбриональных тканей. При этом решаются многие этические проблемы.

Возможно, наиболее удивительным итогом нашего исследования явилось обнаружение того факта, что ксеногенные клетки ранних стадий эмбрионального развития (стволовые и прогениторные клетки) миогенного ряда способны взаимодействовать со зрелыми патологически измененными мышечными волокнами без какой-либо иммуносупрессии. Это является еще одним подтверждением низкой иммуногенности стволовых и прогениторных клеток.

По-видимому, использование РПМ для лечения МДД/Б и других миопатий гораздо эффективнее, чем генно-инженерная терапия. Например, введение минигена дистрофина даже в условиях идеально проведенного трансгеноза в мышечные волокна приведет к генетической модификации волокна и синтезу дистрофина, однако, появление этого синтеза не устранит уже возникший на эмбриональной и ранней постнатальной фазе развития комплекс структурных нарушений в двигательной единице мышц — соединительной ткани, нервных окончаниях, сосудах. В то же время, введенные в суспензии стволовые и прогениторные клетки плода благодаря их полипотентности могут привести к восстановлению межтканевых взаимодействий в мышечной ткани.

В настоящее время терапия стволовыми и прогениторными клетками получает все большее развитие и постепенно внедряется в практику лечения многих тяжелых заболеваний. Главным препятствием на пути к еще более широкому ее применению стоит такая важная проблема как иммунологическая несовместимость трансплантат и тканей хозяина, требующая активной иммунносупрессирующей терапии. Другим грозным осложнением такой терапии является возможность превращения стволовых клеток в опухолевые. Имеются также и другие важные.

— 127проблемы, в частности пока еще необъясненный интенсивный апоптоз клеток трансплантата, сложность и дороговизна получения и культивирования клеток, этические проблемы т.п. Нам представляется, что в данной работе удалось получить некоторые ответы на поставленные вопросы.

Как оказалось, ксенотрансплантация, по крайней мере, на первых этапах посттрансплантационного периода не требует иммуносупрессии. Вполне вероятно, что подключение иммуносупрессантов с этапа (конец 2-ого месяца) нарастания высокого уровня иммунокомпетентных клеток, ответственных за отторжение трансплантата, позволит еще более пролонгировать морфологическую целостность и функциональную активность мышечной единицы.

Наше исследование также предположить о возможности резкого снижения риска опухолевой трансформации трансплантата. Известно, что такой трансформации могут подвергаться, прежде всего, стволовые клетки. В тоже время, когда стволовые клетки начинают дифференцироваться в клетки-предшественники специализированной ткани (прогениторные клетки), они теряют способность к опухолевой трансформации. В этом смысле использование эмбриональной ткани первых недель гестации (8−10 недели) для заместительной терапии является более предпочтительным, так как она содержит преимущественно именно прогениторные элементы.

И, наконец, еще одним существенным обобщением, вытекающем из настоящего исследования, является констатация чрезвычайно высокой пластичности трансплантированных клеток к замещению специфического генетического дефекта. Так в наших наблюдениях экспрессия гена дистрофина начиналась в эмбриональных клетках под действием микроокружения мышечной ткани донора. Как мы уже подчеркивали, у человека экспрессия гена дистрофина начинается к 26 неделе гестации (51). Такой исключительно тонких характер взаимодействия индукторов генной экспрессии с геномом трансплантата с селективным включением.

— 128активности одного из множества генов позволяет заключить, что подобный механизм компенсаторных взаимодействий возможен и при других генетических аномалиях. Это определяет перспективу дальнейшего изучения возможностей генетической модификации тканей с различным типом мутации, по крайней мере, в рамках генетической миологии.