Помощь в написании студенческих работ
Антистрессовый сервис

Генетическая модификация штаммов Escherichia coli, направленная на получение продуцентов бутирата и бутанола

Диссертация: Генетическая модификация штаммов Escherichia coli, направленная на получение продуцентов бутирата и бутанола
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Такой двухстадийный процесс обеспечивает клетки АТФ как во время интенсивного роста культуры, так и при подготовке к споруляции, однако значительно затрудняет промышленное производство бутанола и делает его нерентабельным, по сравнению с производством из нефтяного сырья. Кроме того, С. acetobutylicum является строгим анаэробом и обладает низкими показателями роста, что приводит к его низкой… Читать ещё >

Генетическая модификация штаммов Escherichia coli, направленная на получение продуцентов бутирата и бутанола (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Содержание

  • Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
    • 1. 1. Микробиологический синтез бутанола
      • 1. 1. 1. Биосинтез бутанола в клетках Clostridium acetobutilicum
      • 1. 1. 2. Ферменты, участвующие в ABE ферментации
      • 1. 1. 3. Генно-инженерный инструментарий для модификации метаболизма клостридий
      • 1. 1. 4. Стратегии увеличения продукции бутанола у клостридий
      • 1. 1. 5. Альтернативный путь биосинтеза бутанола и других спиртов
      • 1. 1. 6. Альтернативные штаммы-продуценты бутанола
      • 1. 1. 7. Потенциальные возможности биосинтеза бутанола в клетках E. col
      • 1. 1. 8. Путь /?-окисления жирных кислот в клетках E. col
      • 1. 1. 9. Ферменты пути /?-окисления жирных кислот
      • 1. 1. 10. Рост Е. coli на этаноле и бутаноле, как источниках углерода
    • 1. 2. Проблема устойчивости бактерий к бутанолу
      • 1. 2. 1. Уровни толерантности к бутанолу у различных микроорганизмов
      • 1. 2. 2. Стрессовое воздействие бутанола
      • 1. 2. 3. Механизмы устойчивости к бутанолу у клостридий
      • 1. 2. 4. Устойчивость E. coli к органическим растворителям
  • Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
    • 2. 1. Бактериальные штаммы и плазмиды
    • 2. 2. Среды и условия культивирования
    • 2. 3. Фенотипические характеристики культур штаммов Е. col
      • 2. 3. 1. Определение устойчивости к бутанолу стационарных культур штаммов Е. col
      • 2. 3. 2. Определение осмотической толерантности
      • 2. 3. 3. Определение устойчивости к антибиотикам
      • 2. 3. 4. Определение состава жирных кислот целых клеток
      • 2. 3. 5. Суперэкспрессия белков холодового шока
    • 2. 4. Манипуляции с ДНК
    • 2. 5. Выделение фракции белков внешней мембраны
    • 2. 6. Конструирование транскрипционных слияний
    • 2. 7. Измерение активности ß--галактозидазы
    • 2. 8. Мутагенез
    • 2. 9. Получение делеций целевых генов
    • 2. 10. Амплификация фрагментов для Red-зависимой рекомбинации
    • 2. 11. ПЦР
    • 2. 12. Red-зависимая рекомбинация ПЦР-фрагментов
    • 2. 13. Электропорация
    • 2. 14. Выщепление CmR маркера
    • 2. 15. Секвен ирование
    • 2. 16. Определение метаболитов
  • Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
    • 3. 1. Конструирование штамма E. coli, продуцирующего бутират без использования чужеродных генов
      • 3. 1. 1. Инактивация гена fadR
      • 3. 1. 2. Инактивация гена aceF
      • 3. 1. 3. Получение adhE мутантов E. coli, способных расти на этаноле в аэробных условиях
      • 3. 1. 4. Идентификация мутаций в гене adhE
      • 3. 1. 5. Получение мутантов, растущих на бутирате и бутаноле, как единственных источниках углерода
      • 3. 1. 6. Восстановление функционального аллеля гена aceF
      • 3. 1. 7. Подстановка гена atoB под контроль промотора Ptet
      • 3. 1. 8. Инактивация генов IdhA и pta, ответственных за синтез побочных продуктов при ферментации глюкозы в бутират и бутанол
      • 3. 1. 9. Содержание продуктов ферментации глюкозы в кулътуралъной среде
    • 3. 2. Фенотипические свойства бутанол-толерантного мутанта
      • 3. 2. 1. Направленная микроэволюция штаммов в средах, содержащих бутанол
      • 3. 2. 2. Устойчивость к бутанолу культур E. coli в стационарной фазе
      • 3. 2. 3. Устойчивость к спиртам
      • 3. 2. 4. Чувствительность к антибиотикам
      • 3. 2. 5. Оксидативный стресс
      • 3. 2. 6. Чувствительность к осмотическому шоку
      • 3. 2. 7. Различия в липидном составе мембран штаммов MG1655 ButR и MG
      • 3. 2. 8. Влияние ионов Са2+ на устойчивость к бутанолу
      • 3. 2. 9. Влияние суперэкспрессии белков холодового шока на устойчивость к бутанолу
    • 3. 3. Бутанол как фактор регуляции экспрессии генаотрС в клетках E. col
      • 3. 3. 1. Композиция белков внешней мембраны у бутанол-толерантных мутантов
      • 3. 3. 2. Определение нуклеотидной последовательности генов отрС и отрЯ у мутанта ВшЯ
      • 3. 3. 3. Определение уровня экспрессии гена отрС в бесклеточных экстрактах мутанта ВшЯ
  • Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
  • ВЫВОДЫ

Актуальность темы

.

В связи с ограниченными запасами доступной нефти, ростом парка автомобилей и некоторыми проблемами экологического, экономического и политического характера, возрастает интерес к биотопливу (альтернативным источникам энергии из возобновляемого сырья). Биомасса является четвертым по величине источником энергии после угля, нефти и природного газа.

Одним из основных видов биотоплива являются спирты, прежде всего этанол, который может быть добавлен к бензину, как для его экономии, так и для улучшения его некоторых параметров. Однако, у этанола есть сильный конкурент — бутанол, который полностью заменяет бензин для двигателей автомобилей. Бутанол может использоваться как в смеси с бензином, так и выступать в качестве ко-растворителя в дизельной топливной смеси. Возможность получения бутанола из биомассы была открыта еще в ранние 1900;е. В течение двух Мировых Войн заводы по производству биобутанола были построены в США, России, Китае, Индии, Южной Африке и т. д. Однако, с развитием нефтяной индустрии, производство бутанола микробиологическим путем отошло на второй план из-за потери рентабельности (7).

За последние несколько лет возобновился интерес к бактериям рода Clostridia и к подобным микроорганизмам, как к возможным способам получения органических веществ, особенно бутанола, в настоящее время получаемого из нефтяного сырья. Clostridium acetobutylicum наиболее часто используется для промышленного производства бутанола.

С. acetobutylicum, осуществляет ацетонобутиловое брожение углеводов в две стадии: на первой накапливаются ацетат и бутират, во второй стадии продолжается утилизация глюкозы, в результате чего кислоты конвертируются в органические растворители н-бутанол, ацетон и этанол (2, б.

3). Такой двухстадийный процесс обеспечивает клетки АТФ как во время интенсивного роста культуры, так и при подготовке к споруляции, однако значительно затрудняет промышленное производство бутанола и делает его нерентабельным, по сравнению с производством из нефтяного сырья. Кроме того, С. acetobutylicum является строгим анаэробом и обладает низкими показателями роста, что приводит к его низкой продуктивности. Недостаточно изученная генетическая система и физиология Clostridia затрудняют модификацию метаболических путей, необходимую для эффективной продукции бутанола (4). Известны многочисленные попытки конструирования рекомбинантных штаммов на основе различных микроорганизмов, содержащих чужеродные клостридиальные гены биосинтеза бутанола (2, 3, 5−7). Использование E. coli в качестве реципиента генов клостридий позволяет применить разработанную методологию конструирования рекомбиниантных штаммов. Однако конструирование промышленных продуцентов бутанола предполагает не только высокий уровень экспрессии клонированных генов, но и высокую устойчивость культуры к бутанолу, — качество, которым известные штаммы E. coli и многие другие реципиенты не обладают.

Попытки конструирования продуцентов бутанола путем клонирование генов клостридий в различных микроорганизмах не привели к созданию эффективных штаммов, более того, в результате возникли существенные правовые ограничения в использовании генов клостридий для создания рекомбинантных продуцентов бутанола. Поскольку процесс биосинтеза бутанола может быть представлен как инвертированный процесс |3-окисления жирных кислот, возникло предположение о возможном биосинтезе бутанола в клетках E. coli без использования чужеродных генов.

Цель и задачи исследования

.

Целью настоящей работы было выяснение возможности биосинтеза бутанола культурой E. coli без использования чужеродных генов посредством обращенного пути (3-окисления жирных кислот. Кроме того, целью настоящей работы было получение штамма E. coli, обладающего повышенной толерантностью к бутанолу и исследование его фенотипических характеристик.

Для достижения указанных целей были сформулированы следующие задачи:

1. Конструирование штамма E. coli, усваивающего бутанол, как единственный источник углерода, с последующим обращением этого процесса при выращивании мутанта на среде с глюкозой.

2. Оптимизация метода получения бутанол-толерантного мутанта E. coli MG1655 ButR;

3. Проведение экспериментов по изучению различных фенотипических свойств полученного в ходе направленной микроэвалюции мутанта MG1655 ButR;

4. Изучение влияния бутанола на экспресию in vivo лидерной области гена отрС у мутанта MG1655 ButR и родительского штамма MG1655;

Научная новизна и практическая ценность работы.

В силу хорошей изученности, способности роста как в аэробных, так и в анаэробных условиях, Escherichia coli является одним из наиболее привлекательных объектов для конструирования рекомбинантных продуцентов бутанола. В геноме E. coli присутствуют гены, потенциально способные осуществить все этапы биосинтеза бутирата и бутанола. В рамках настоящего исследования была произведена реконструкция пути биосинтеза бутирата и бутанола на основе естественного метаболического пути (38 окисления жирных кислот. Впервые была показана возможность обращения этого процесса с целью получения продуцентов бутирата и бутанола. Тем не менее, E. coli обладает высокой чувствительностью к таким токсическим факторам как органические растворители и в частности к бутанолу. Таким образом, вторым не менее важным направлением исследования является решение проблемы толерантности E. coli к бутанолу. В процессе селекции был получен штамм E. coli, толерантный к бутанолу и обладающий рядом фенотипических особенностей: гиперчувствительность к осмотическому шоку, устойчивость к этанолу и изопропанолу, устойчивость к сурфакцину, отсутствие агрегации клеток в среде с бутанолом. Определен липидный состав мембраны бутанол-толерантного мутанта. Установлено, что бутанол является фактором регуляции экспрессии основных мембранных белковпоринов. Экспрессия гена отрС, кодирующего порин ОтрС, возрастает под действием бутанола. Нуклеотидные замены, обнаруженные в регуляторной области гена отрС мутанта ButR, обуславливают более низкий уровень экспрессии в нормальных условиях и обеспечивают более высокий уровень синтеза в присутствии бутанола. Выявление основных механизмов и ключевых генов, задействованных в повышении толерантности клеток к органическим растворителям, позволит оптимизировать создание штаммов-продуцентов бутанола и других органических растворителей и сделать более рентабельным их производство.

выводы.

1. Методом направленной микроэволюции получен штамм E. coli MG 1655 ButR, способный расти в присутствии 1.5% бутанола в питательной среде.

2. Впервые показано, что содержание в мембранной фракции клеток E. coli белка ОтрС зависит от присутствия в среде такого гидрофобного агента, как бутанол. У мутанта ButR существует прямая корреляция между уровнем экспрессии гена отрС и содержанием порина ОтрС в мембранной фракции клеток.

3. В регуляторной области гена отрС у мутанта ButR выявлены три нуклеотидные замены, которые локализуются в перекрывающихся сайтах связывания белков-активаторов OmpR и CpxR. Присутствие этих мутаций в регуляторной области гена отрС у мутанта ButR обусловливает снижение уровня экспрессии гена отрС в нормальных условиях роста, однако обеспечивает более высокий уровень синтеза порина ОтрС при добавлении бутанола.

4. Определен ряд фенотипических характеристик штамма MG1655 ButR (устойчивость к этанолу и изопропанолу, отсутствие агрегации клеток в среде с бутанолом, устойчивость к сурфактину, измененный состав жирных кислот, а также гиперчувствительность к осмотическому шоку), свидетельствующих о структурных перестройках клеточных мембран, затрагивающих, как липидную, так и белковую компоненты.

5. Осуществлено генетическое конструирование штамма E. coli AfadR, adhE, atoC, Ptet-atoB, AldhA, способного продуцировать бутират. Тем самым впервые показана возможность обращения этапов процесса ß—окисления жирных кислот в E. coli и использование этого процесса для биосинтеза бутирата — предшественника бутанола.

Показать весь текст

Список литературы

  1. Huang, H., Liu, H., and Gan, Y. R. (2010) Genetic modification of criticalenzymes and involved genes in butanol biosynthesis from biomass, Biotechnol Adv 28, 651−657.
  2. Qureshi, N., Ezeji, Т. C., Ebener, J., Dien, B. S., Cotta, M. A., and Blaschek, H. P. (2008) Butanol production by Clostridium beijerinckii. Part I: use of acid and enzyme hydrolyzed corn fiber, Bioresour Technol 99, 5915−5922.
  3. Lee, J. Y., Yang, K. S., Jang, S. A., Sung, В. H., and Kim, S. C. (2010) Engineering butanol-tolerance in escherichia coli with artificial transcription factor libraries, Biotechnol Bioeng, 28.
  4. Gu, Y., Jiang, Y., Wu, H., Liu, X., Li, Z., Li, J., Xiao, H., Shen, Z., Dong, H., Yang, Y., Li, Y., Jiang, W., and Yang, S. (2011) Economical challenges to microbial producers of butanol: feedstock, butanol ratio and titer, Biotechnol J 6, 1348−1357.
  5. Peralta-Yahya, P. P., Zhang, F., del Cardayre, S. В., and Keasling, J. D. (2012) Microbial engineering for the production of advanced biofuels, Nature 488, 320−328.
  6. Zheng, Y. N., Li, L. Z., Xian, M., Ma, Y. J., Yang, J. M., Xu, X., and He, D. Z. (2009) Problems with the microbial production of butanol, J Ind Microbiol Biotechnol 36, 1127−1138.
  7. Inui, M., Suda, M., Kimura, S., Yasuda, K., Suzuki, H., Toda, H., Yamamoto, S., Okino, S., Suzuki, N., and Yukawa, H. (2008) Expression of Clostridium acetobutylicum butanol synthetic genes in Escherichia coli, Appl Microbiol Biotechnol 77, 1305−1316.
  8. Atsumi, S., and Liao, J. C. (2008) Metabolie engineering for advanced biofuels production from Escherichia coli, Curr Opin Biotechnol 19, 414 419.
  9. Rutherford, B. J., Dahl, R. H., Price, R. E., Szmidt, H. L., Benke, P. I., Mukhopadhyay, A., and Keasling, J. D. (2010) Functional genomic study of exogenous n-butanol stress in Escherichia coli, Appl Environ Microbiol 76, 1935−1945.
  10. Keis, S., Bennett, C. F., Ward, V. K., and Jones, D. T. (1995) Taxonomy and phylogeny of industrial solvent-producing Clostridia, Int J Syst Bacteriol 45, 693−705.
  11. Dabrock, B., Bahl, H., and Gottschalk, G. (1992) Parameters Affecting Solvent Production by Clostridium pasteurianum, Appl Environ Microbiol 58, 1233−1239.
  12. Vasconcelos, I., Girbal, L., and Soucaille, P. (1994) Regulation of carbon and electron flow in Clostridium acetobutylicum grown in chemostat culture at neutral pH on mixtures of glucose and glycerol, J Bacteriol 176, 14 431 450.
  13. Yan, R. T., Zhu, C. X., Golemboski, C., and Chen, J. S. (1988) Expression of Solvent-Forming Enzymes and Onset of Solvent Production in Batch Cultures of Clostridium beijerinckii («Clostridium butylicum»), Appl Environ Microbiol 54, 642−648.
  14. , I. S. (1989) The acetone-butanol-ethanol fermentation: recent progress in technology, Biotechnol Genet Eng Rev 7, 189−220.
  15. Maddox, I. S., Steiner, E., Hirsch, S., Wessner, S., Gutierrez, N. A., Gapes,
  16. J. R., and Schuster, K. C. (2000) The cause of «acid-crash» and «acidogenic88fermentations» during the batch acetone-butanol-ethanol (ABE-) fermentation process, JMol Microbiol Biotechnol 2, 95−100.
  17. Hartmanis, M. G., and Gatenbeck, S. (1984) Intermediary Metabolism in Clostridium acetobutylicum: Levels of Enzymes Involved in the Formation of Acetate and Butyrate, Appl Environ Microbiol 47, 1277−1283.
  18. Ballongue, J., Amine, J., Masion, E., Petitdemange, H., and Gay, R. (1986) Role of acetate and butyrate in the induction of NADH: rubredoxin oxidoreductase in Clostridium acetobutylicum., Biochimie 68, 575−580.
  19. Wiesenborn, D. P., Rudolph, F. B., and Papoutsakis, E. T. (1989) Phosphotransbutyrylase from Clostridium acetobutylicum ATCC 824 and its role in acidogenesis, Appl Environ Microbiol 55, 317−322.
  20. Sullivan, L., and Bennett, G. N. (2006) Proteome analysis and comparison of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 and SpoOA strain variants, J Ind Microbiol Biotechnol 33, 298−308.
  21. Papoutsakis, E. T., and Bennett, G. N. (1993) Cloning, structure, and expression of acid and solvent pathway genes of Clostridium acetobutylicum, Biotechnology 25, 157−199.
  22. Welch, R. W., Rudolph, F. B., and Papoutsakis, E. T. (1989) Purification and characterization of the NADH-dependent butanol dehydrogenase from Clostridium acetobutylicum (ATCC 824), Arch Biochem Biophys 273, 309 318.
  23. Wiesenborn, D. P., Rudolph, F. B., and Papoutsakis, E. T. (1989) Coenzyme A transferase from Clostridium acetobutylicum ATCC 824 and its role in the uptake of acids, Appl Environ Microbiol 55, 323−329.
  24. Jones, D. T., and Woods, D. R. (1986) Acetone-butanol fermentation revisited, Microbiol Rev 50, 484−524.
  25. Bahl, H., Gottwald, M., Kuhn, A., Rale, V., Andersch, W., and Gottschalk, G. (1986) Nutritional Factors Affecting the Ratio of Solvents Produced by Clostridium acetobutylicum, Appl Environ Microbiol 52, 169−172.
  26. Mermelstein, L. D., Welker, N. E., Bennett, G. N., and Papoutsakis, E. T. (1992) Expression of cloned homologous fermentative genes in Clostridium acetobutylicum ATCC 824, Biotechnology (N Y) 10, 190−195.
  27. Green, E. M., and Bennett, G. N. (1996) Inactivation of an aldehyde/alcohol dehydrogenase gene from Clostridium acetobutylicum ATCC 824, Appl Biochem Biotechnol 57−58, 213−221.
  28. Green, E. M., Boynton, Z. L., Harris, L. M., Rudolph, F. B., Papoutsakis, E. T., and Bennett, G. N. (1996) Genetic manipulation of acid formation pathways by gene inactivation in Clostridium acetobutylicum ATCC 824, Microbiology 142 (Pt 8), 2079−2086.
  29. Harris, L. M., Welker, N. E., and Papoutsakis, E. T. (2002) Northern, morphological, and fermentation analysis of spoOA inactivation and overexpression in Clostridium acetobutylicum ATCC 824, J Bacteriol 184, 3586−3597.
  30. Heap, J. T., Pennington, O. J., Cartman, S. T., Carter, G. P., and Minton, N. P. (2007) The ClosTron: a universal gene knock-out system for the genus Clostridium, J Microbiol Methods 70, 452−464.
  31. Feustel, L., Nakotte, S., and Durre, P. (2004) Characterization and development of two reporter gene systems for Clostridium acetobutylicum, Appl Environ Microbiol 70, 798−803.
  32. Quixley, K. W., and Reid, S. J. (2000) Construction of a reporter gene vector for Clostridium beijerinckii using a Clostridium endoglucanase gene, J Mol Microbiol Biotechnol 2, 53−57.
  33. Lee, S. Y., Park, J. H., Jang, S. H., Nielsen, L. K., Kim, J., and Jung, K. S. (2008) Fermentative butanol production by Clostridia, Biotechnol Bioeng 101, 209−228.
  34. Senger, R. S., and Papoutsakis, E. T. (2008) Genome-scale model for Clostridium acetobutylicum: Part I. Metabolic network resolution and analysis, Biotechnol Bioeng 101, 1036−1052.
  35. Tummala, S. B., Welker, N. E., and Papoutsakis, E. T. (2003) Design of antisense RNA constructs for downregulation of the acetone formation pathway of Clostridium acetobutylicum, J Bacteriol 185, 1923−1934.
  36. Jiang, Y., Xu, C., Dong, F., Yang, Y., Jiang, W., and Yang, S. (2009) Disruption of the acetoacetate decarboxylase gene in solvent-producing Clostridium acetobutylicum increases the butanol ratio, Metab Eng 11, 284 291.
  37. Baer, S. H., Bryant, D. L., and Blaschek, H. P. (1989) Electron Spin Resonance Analysis of the Effect of Butanol on the Membrane Fluidity of Intact Cells of Clostridium acetobutylicum, Appl Environ Microbiol 55, 2729−2731.
  38. Chen, C. K., and Blaschek, H. P. (1999) Acetate enhances solvent production and prevents degeneration in Clostridium beijerinckii BA101, Appl Microbiol Biotechnol 52, 170−173.
  39. Rao, G., and Mutharasan, R. (1987) Altered Electron Flow in Continuous Cultures of Clostridium acetobutylicum Induced by Viologen Dyes, Appl Environ Microbiol 53, 1232−1235.
  40. Yan, Y., and Liao, J. C. (2009) Engineering metabolic systems for production of advanced fuels, JInd Microbiol Biotechnol 36, 471−479.
  41. Atsumi, S., Hanai, T., and Liao, J. C. (2008) Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels, Nature 451, 86−89.
  42. Smith, K. M., Cho, K. M., and Liao, J. C. (2010) Engineering Corynebacterium glutamicum for isobutanol production, Appl Microbiol Biotechnol 87, 1045−1055.
  43. Chen, X., Nielsen, K. F., Borodina, I., Kielland-Brandt, M. C., and Karhumaa, K. (2011) Increased isobutanol production in Saccharomyces cerevisiae by overexpression of genes in valine metabolism, Biotechnol Biofuels 4, 21.
  44. Higashide, W., Li, Y., Yang, Y., and Liao, J. C. (2011) Metabolic engineering of Clostridium cellulolyticum for production of isobutanol from cellulose, Appl Environ Microbiol 77, 2727−2733.
  45. Atsumi, S., Higashide, W., and Liao, J. C. (2009) Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde, Nat Biotechnol 27, 11 771 180.
  46. Huo, Y. X., Cho, K. M., Rivera, J. G., Monte, E., Shen, C. R., Yan, Y., and Liao, J. C. (2011) Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux, Nat Biotechnol 29, 346−351.
  47. Li, H., Opgenorth, P. H., Wernick, D. G., Rogers, S., Wu, T. Y., Higashide, W., Malati, P., Huo, Y. X., Cho, K. M., and Liao, J. C. (2012) Integrated electromicrobial conversion of C02 to higher alcohols, Science 335, 1596.
  48. Atsumi, S., Cann, A. F., Connor, M. R., Shen, C. R., Smith, K. M., Brynildsen, M. P., Chou, K. J., Hanai, T., and Liao, J. C. (2008) Metabolic engineering of Escherichia coli for 1-butanol production, Metab Eng 10, 305−311.
  49. Steen, E. J., Chan, R., Prasad, N., Myers, S., Petzold, C. J., Redding, A., Ouellet, M., and Keasling, J. D. (2008) Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol, Microb Cell Fact 7,36.
  50. Nielsen, D. R., Leonard, E., Yoon, S. H., Tseng, H. C., Yuan, C., and Prather, K. L. (2009) Engineering alternative butanol production platforms in heterologous bacteria, Metab Eng 11, 262−273.
  51. Berezina, O. V., Zakharova, N. V., Brandt, A., Yarotsky, S. V., Schwarz, W. H., and Zverlov, V. V. (2010) Reconstructing the clostridial n-butanolmetabolic pathway in Lactobacillus brevis, Appl Microbiol Biotechno I 87, 635−646.
  52. Lan, E. I., and Liao, J. C. (2012) ATP drives direct photosynthetic production of 1-butanol in cyanobacteria, Proc Natl Acad Sei USA 109, 6018−6023.
  53. Clark, D. P., and Rod, M. L. (1987) Regulatory mutations that allow the growth of Escherichia coli on butanol as carbon source, J Mol Evol 25, 151 158.
  54. Clark, D. P., and Cronan, J. E., Jr. (1981) Bacterial mutants for the study of lipid metabolism, Methods Enzymol 72, 693−707.
  55. Overath, P., Pauli, G., and Schairer, H. U. (1969) Fatty acid degradation in Escherichia coli. An inducible acyl-CoA synthetase, the mapping of old-mutations, and the isolation of regulatory mutants, Eur J Biochem 7, 559 574.
  56. Overath, P., and Raufuss, E. M. (1967) The induction of the enzymes of fatty acid degradation in Escherichia coli, Biochem Biophys Res Commun 29, 28−33.
  57. Pauli, G., and Overath, P. (1972) ato Operon: a highly inducible system for acetoacetate and butyrate degradation in Escherichia coli, Eur J Biochem 29, 553−562.
  58. Binstock, J. F., Pramanik, A., and Schulz, H. (1977) Isolation of a multienzyme complex of fatty acid oxidation from Escherichia coli, Proc Natl Acad Sei USA 74, 492−495.
  59. O’Brien, W. J., and Frerman, F. E. (1977) Evidence for a complex of three beta-oxidation enzymes in Escherichia coli: induction and localization, J Bacteriol 132, 532−540.
  60. Pawar, S., and Schulz, H. (1981) The structure of the multienzyme complex of fatty acid oxidation from Escherichia coli, J Biol Chem 256, 3894−3899.
  61. Pramanik, A., Pawar, S., Antonian, E., and Schulz, H. (1979) Five different enzymatic activities are associated with the multienzyme complex of fatty acid oxidation from Escherichia coli, JBacteriol 137, 469−473.
  62. Klein, K., Steinberg, R., Fiethen, B., and Overath, P. (1971) Fatty acid degradation in Escherichia coli. An inducible system for the uptake of fatty acids and further characterization of old mutants, Eur J Biochem 19, 442 450.
  63. Clark, D., and Cronan, J. E., Jr. (1980) Escherichia coli mutants with altered control of alcohol dehydrogenase and nitrate reductase, J Bacteriol 141, 177−183.
  64. Baer, S. H., Blaschek, H. P., and Smith, T. L. (1987) Effect of Butanol Challenge and Temperature on Lipid Composition and Membrane Fluidity of Butanol-Tolerant Clostridium acetobutylicum, Appl Environ Microbiol 53, 2854−2861.
  65. Borden, J. R., and Papoutsakis, E. T. (2007) Dynamics of genomic-library enrichment and identification of solvent tolerance genes for Clostridium acetobutylicum, Appl Environ Microbiol 73, 3061−3068.
  66. Vollherbst-Schneck, K., Sands, J. A., and Montenecourt, B. S. (1984) Effect of butanol on lipid composition and fluidity of Clostridium acetobutylicum ATCC 824, Appl Environ Microbiol 47, 193−194.
  67. Knoshaug, E. P., and Zhang, M. (2009) Butanol tolerance in a selection of microorganisms, Appl Biochem Biotechnol 153, 13−20.
  68. Desmond, C., Fitzgerald, G. F., Stanton, C., and Ross, R. P. (2004) Improved stress tolerance of GroESL-overproducing Lactococcus lactis and probiotic Lactobacillus paracasei NFBC 338, Appl Environ Microbiol 70, 5929−5936.
  69. Fiocco, D., Capozzi, V., Goffin, P., Hols, P., and Spano, G. (2007) Improved adaptation to heat, cold, and solvent tolerance in Lactobacillus plantarum, Appl Microbiol Biotechnol 77, 909−915.
  70. Matsumoto, M., Mochiduki, K., and Kondo, K. (2004) Toxicity of ionic liquids and organic solvents to lactic acid-producing bacteria, J Biosci Bioeng 98, 344−347.
  71. Tomas, C. A., Beamish, J., and Papoutsakis, E. T. (2004) Transcriptional analysis of butanol stress and tolerance in Clostridium acetobutylicum, J Bacteriol 186, 2006−2018.
  72. Ingram, L. O., and Buttke, T. M. (1984) Effects of alcohols on microorganisms, Adv Microb Physiol 25, 253−300.
  73. Kabelitz, N., Santos, P. M., and Heipieper, H. J. (2003) Effect of aliphatic alcohols on growth and degree of saturation of membrane lipids in Acinetobacter calcoaceticus, FEMS Microbiol Lett 220, 223−227.
  74. Bowles, L. K., and Ellefson, W. L. (1985) Effects of butanol on Clostridium acetobutylicum, Appl Environ Microbiol 50, 1165−1170.
  75. , L. O. (1990) Ethanol tolerance in bacteria, Crit Rev Biotechnol 9, 305−319.
  76. Sikkema, J., de Bont, J. A., and Poolman, B. (1995) Mechanisms of membrane toxicity of hydrocarbons, Microbiol Rev 59, 201−222.
  77. Doremus, M. G., Linden, J. C., and Moreira, A. R. (1985) Agitation and pressure effects on acetone-butanol fermentation, Biotechnol Bioeng 27, 852−860.
  78. Liyanage, H., Young, M., and Kashket, E. R. (2000) Butanol tolerance of Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 associated with down-regulation of gldA by antisense RNA, J Mol Microbiol Biotechnol 2, 87−93.
  79. Alsaker, K. V., Spitzer, T. R., and Papoutsakis, E. T. (2004) Transcriptional analysis of spoOA overexpression in Clostridium acetobutylicum and its effect on the cell’s response to butanol stress, J Bacteriol 186, 1959−1971.
  80. Narberhaus, F., Giebeler, K., and Bahl, H. (1992) Molecular characterization of the dnaK gene region of Clostridium acetobutylicum, including grpE, dnaJ, and a new heat shock gene, JBacteriol 174, 3290−3299.
  81. Hermann, M., Fayolle, F., Marchal, R., Podvin, L., Sebald, M., and Vandecasteele, J. P. (1985) Isolation and characterization of butanol-resistant mutants of Clostridium acetobutylicum, Appl Environ Microbiol 50, 1238−1243.
  82. Aono, R., Tsukagoshi, N., and Yamamoto, M. (1998) Involvement of outer membrane protein TolC, a possible member of the mar-sox regulon, in maintenance and improvement of organic solvent tolerance of Escherichia coli K-12, J Bacteriol 180, 938−944.
  83. Aono, R., and Kobayashi, H. (1997) Cell surface properties of organic solvent-tolerant mutants of Escherichia coli K-12, Appl Environ Microbiol 63, 3637−3642.
  84. Bae, W., Xia, B., Inouye, M., and Severinov, K. (2000) Escherichia coli CspA-family RNA chaperones are transcription antiterminators, Proc Natl AcadSci USA 97, 7784−7789.
  85. Zingaro, К. A., and Terry Papoutsakis, E. (2012) GroESL overexpression imparts Escherichia coli tolerance to i-, n-, and 2-butanol, 1,2,4-butanetriol and ethanol with complex and unpredictable patterns, Metab Eng.
  86. Atsumi, S., Wu, T. Y., Machado, I. M., Huang, W. C., Chen, P. Y., Pellegrini, M., and Liao, J. C. (2010) Evolution, genomic analysis, and reconstruction of isobutanol tolerance in Escherichia coli, Mol Syst Biol 6, 449.
  87. Reyes, L. H., Almario, M. P., and Kao, К. C. (2011) Genomic library screens for genes involved in n-butanol tolerance in Escherichia coli, PLoS One 6, el7678.
  88. , Д. (1979) Эксперименты в молекулярной генетике, Мир.
  89. Osipov, G. A., Parfenov, A. I., and Bogomolov, Р. О. (2001) Comparative study of chromatography-mass spectrography of microorganism’s chemical markers in blood and intestinal mucosa bioptats., Ross Gastroenterol Zh, 5469.
  90. Sambrook, J., E.F., F., and Т., M. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual 2nd ed ed., Cold Spring Harbor Lab, New York.
  91. Datsenko, K. A., and Wanner, B. L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Proc Natl AcadSci USA 97, 6640−6645.
  92. Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A. R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors, Proc Natl Acad Sci USA 74, 5463−5467.
  93. Horton, С. E., and Bennett, G. N. (2006) Ester production in E. coli and C. acetobutylicum, Enzyme and Microbial Technology 38, 368−376.
  94. Nunn, W. D., Giffin, K., Clark, D., and Cronan, J. E., Jr. (1983) Role for fadR in unsaturated fatty acid biosynthesis in Escherichia coli, J Bacteriol 154, 554−560.
  95. Salanitro, J. P., and Wegener, W. S. (1971) Growth of Escherichia coli on short-chain fatty acids: nature of the uptake system, J Bacteriol 108, 893 901.
  96. Vanderwinkel, E., Furmanski, P., Reeves, H. C., and Ajl, S. J. (1968) Growth of Escherichia coli on fatty acids: requirement for coenzyme A transferase activity, Biochem Biophys Res Commun 33, 902−908.
  97. Kaga, N., Umitsuki, G., Clark, D. P., Nagai, K., and Wachi, M. (2002) Extensive overproduction of the AdhE protein by rng mutations depends on mutations in the era gene or in the Cra-box of the adhE promoter, Biochem Biophys Res Commun 295, 92−97.
  98. Lutz, R., and Bujard, H. (1997) Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/Il-I2 regulatory elements, Nucleic Acids Res 25, 1203−1210.
  99. Causey, T. B., Shanmugam, K. T., Yomano, L. P., and Ingram, L. O. (2004) Engineering Escherichia coli for efficient conversion of glucose to pyruvate, Proc Natl Acad Sei USA 101, 2235−2240.
  100. Eiteman, M. A., and Altman, E. (2006) Overcoming acetate in Escherichia coli recombinant protein fermentations, Trends Biotechnol 24, 530−536.
  101. Hiraoka, S., Matsuzaki, H., and Shibuya, I. (1993) Active increase in cardiolipin synthesis in the stationary growth phase and its physiological significance in Escherichia coli, FEBS Lett 336, 221−224.
  102. Asako, H., Nakajima, H., Kobayashi, K., Kobayashi, M., and Aono, R. (1997) Organic solvent tolerance and antibiotic resistance increased by overexpression of marA in Escherichia coli, Appl Environ Microbiol 63, 1428−1433.
  103. Hayashi, S., Aono, R., Hanai, T., Mori, H., Kobayashi, T., and Honda, H. (2003) Analysis of organic solvent tolerance in Escherichia coli using gene expression profiles from DNA microarrays, J Biosci Bioeng 95, 379−383.
  104. , H. (2003) Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited, Microbiol Mol Biol Rev 67, 593−656.
  105. Farr, S. B., and Kogoma, T. (1991) Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Microbiol Rev 55, 561−585.
  106. , M. S. (2004) Biosynthesis, transport, and modification of lipid A, Biochem Cell Biol 82, 71−86.
  107. Zhu, K., Zhang, Y. M., and Rock, C. O. (2009) Transcriptional regulation of membrane lipid homeostasis in Escherichia coli, J Biol Chem 284, 3 488 034 888.
  108. Ames, G. F., Spudich, E. N., and Nikaido, H. (1974) Protein composition of the outer membrane of Salmonella typhimurium: effect of lipopolysaccharide mutations, JBacteriol 117, 406−416.
  109. Koplow, J., and Goldfine, H. (1974) Alterations in the outer membrane of the cell envelope of heptose-deficient mutants of Escherichia coli, J Bacteriol 117, 527−543.
  110. Schnaitman, C. A., and Klena, J. D. (1993) Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis in enteric bacteria, Microbiol Rev 57, 655−682.
  111. Lugtenberg, B., Peters, R., Bernheimer, H., and Berendsen, W. (1976) Influence of cultural conditions and mutations on the composition of the outer membrane proteins of Escherichia coli, Mol Gen Genet 147, 251−262.
  112. , S. A. (2006) Revisiting the glyoxylate cycle: alternate pathways for microbial acetate assimilation, Mol Microbiol 61, 274−276.
  113. Kim, Y., Ingram, L. O., and Shanmugam, K. T. (2007) Construction of an Escherichia coli K-12 mutant for homoethanologenic fermentation of glucose or xylose without foreign genes, Appl Environ Microbiol 73, 17 661 771.
  114. Bermejo, L. L., Welker, N. E., and Papoutsakis, E. T. (1998) Expression of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 genes in Escherichia coli for acetone production and acetate detoxification, Appl Environ Microbiol 64, 10 791 085.
  115. Kidwell, J., Valentin, H. E., and Dennis, D. (1995) Regulated expression of the Alcaligenes eutrophus pha biosynthesis genes in Escherichia coli, Appl Environ Microbiol 61, 1391−1398.
  116. Sato, S., Nomura, C. T., Abe, H., Doi, Y., and Tsuge, T. (2007) Poly®-3-hydroxybutyrate. formation in Escherichia coli from glucose through an enoyl-CoA hydratase-mediated pathway, JBiosci Bioeng 103, 38−44.
  117. Dellomonaco, C., Clomburg, J. M., Miller, E. N., and Gonzalez, R. (2011) Engineered reversal of the beta-oxidation cycle for the synthesis of fuels and chemicals, Nature 476, 355−359.
  118. Bond-Watts, B. B., Bellerose, R. J., and Chang, M. C. (2011) Enzyme mechanism as a kinetic control element for designing synthetic biofuel pathways, Nat Chem Biol 7, 222−227.
  119. Forst, S., and Inouye, M. (1988) Environmentally regulated gene expression for membrane proteins in Escherichia coli, Annu Rev Cell Biol 4, 21−42.
Заполнить форму текущей работой

Сессия? Спокойно!