Генные мутации в соматических клетках человека in vivo: радиобиологические закономерности

Достигнутые в прошлом веке успехи в изучении радиационно-индуцированного мутагенеза в соматических клетках человека in vivo были сделаны, главным образом, благодаря анализу структурных мутаций в лимфоцитах периферической крови. За более чем 40-летний период использования цитогенетических методов определения хромосомных аберраций накоплен огромный массив данных о закономерностях индукции этих мутаций в разнообразных радиационных ситуациях и их последующей элиминации. Генные мутации исследованы в этом отношении несравненно хуже, что было связано, прежде всего, с отсутствием надежных и удобных методов их определения. В то же время изучение генных мутаций представляется весьма актуальным для радиобиологии и радиационной медицины в силу, по крайней мере, нескольких причин.

Во-первых, существуют известные различия в механизмах формирования генных и структурных мутаций, о чем свидетельствуют многочисленные данные об индукции и репарации радиационно-индуцированных повреждений ДНК в клетках разнообразных биологических объектов in vivo и in vitro. Поэтому наши представления о соматическом мутагенезе вообще, и радиационном в частности, были бы неполны без знания радиобиологических закономерностей возникновения и элиминации генных мутаций.

Во-вторых, анализ генных мутаций делает возможными регистрацию и количественную оценку небольших по размеру изменений ДНК. Исследование именно таких мутаций приобретает в последнее время все большее значение в связи с обнаружением феномена нестабильности генома у потомков облученных клеток, которая характеризуется, главным образом, небольшими по размеру изменениями ДНК в отличие от мутаций, обусловленных непосредственным действием радиации. При этом следует отметить, что возможное проявление этого феномена на генном уровне при облучении человека практически не исследовано.

В-третьих, механизмы и уровень мутагенеза в клетках с разной степенью дифференцировки, вероятно, отличаются, как можно полагать на основании немногочисленных пока исследований процессов репарации радиационных повреждений ДНК и апоптотической гибели в клетках стволового типа. Существующие в настоящее время методы клеточной и молекулярной биологии позволяют провести раздельный анализ генных мутаций в высоко-и низко дифференцированных клетках и тем самым существенно расширить представления о соматическом мутагенезе.

В-четвертых, имеются основания полагать, что изучение соматического мутагенеза на уровне отдельных генных локусов имеет не только теоретическое, но и практическое значение. С одной стороны, как показано для хромосомных аберраций нестабильного типа, по количеству мутаций в клетках периферической крови можно судить о дозе радиационного воздействия в близкие сроки после его окончания. Однако из-за естественного обновления популяции лимфоцитов количество традиционных маркеров радиационного воздействия — дицентрических хромосомпостепенно снижается со временем после облучения, делая невозможным проведение биологической дозиметрии в отдаленные сроки. Одним из подходов к решению проблемы ретроспективной дозиметрии могло бы стать использование методов определения генных соматических мутаций в долгоживущих клетках стволового типа. Однако информативность таких методов изучена пока недостаточно, особенно для случаев пролонгированного действия радиации. С другой стороны, одним из основных отдаленных последствий действия ионизирующего излучения на соматические клетки является повышение канцерогенного риска. Как известно, спектр изменений генетического материала при злокачественной трансформации не исчерпывается структурными мутациями. Молекулярно-биологические исследования канцерогенеза показывают, что генные мутации имеют не меньшее, если не большее значение. Поэтому можно полагать, что изучение генных соматических мутаций у облученных лиц имеет важное значение для выяснения механизмов радиационного канцерогенеза, оценки канцерогенного риска (особенно при воздействии в малых дозах) и, наконец, для формирования группы повышенного риска возникновения онкологических заболеваний.

Таким образом, необходимость исследования соматического мутагенеза в отдельных генных локусах после радиационного воздействия не вызывает сомнений. Однако методические возможности изучения генных мутаций в соматических клетках человека были до недавнего времени сильно ограничены сложностью, трудоемкостью, недостаточной воспроизводимостью и неоднозначностью интерпретации результатов, что связано, главным образом, с низкой частотой мутаций по отдельным локусам. Эти проблемы удалось в значительной мере преодолеть с внедрением полуавтоматических методов проточной цитометрии, позволяющей анализировать сотни тысяч клеток за относительно небольшое время и, в конечном, счете обследовать значительные контингента людей. В настоящее время известно несколько методов, позволяющих при массовом обследовании определять частоту клеток с генными мутациями по отдельным локусам. Практически все методы основаны на иммунофлуоресцентном анализе белковых продуктов соответствующих генов, а не на исследовании самой ДНК. При этом по наличию или отсутствию нормального продукта немутировавшего гена оценивают частоту клеток с вариантным (мутантным) иммунофенотипом. В данной работе использованы методы оценки генных мутаций по двум локусамгликофорина A (glycophorin, А, GPA) и Т-клеточного рецептора (Т-се11 receptor, TCR}- в клетках периферической крови.

Несмотря на то, что оба метода разработаны более 10 лет тому назад, они интенсивно используются только в ограниченном числе лабораторий за пределами РФ. По всей видимости, это является главной причиной недостаточности данных об основных радиобиологических закономерностях в отношении указанных генных мутаций: о зависимости доза — эффект радиационного воздействия с разной мощностью, о влиянии возраста в момент облучения на количество мутантных клеток, о возможных эффектах малых доз и т. д. Результаты, полученные в данной диссертационной работе, в значительной мере восполняют указанные пробелы.

По современным представлениям о мутагенезе, частота мутантных клеток определяется как скоростью возникновения мутаций (которая зависит от дозы и мощности дозы генотоксического воздействия, эффективности репарации повреждений ДНК и т. д.), так и скоростью элиминации мутантных клеток различными способами, в том числе путем апоптоза. Несмотря на интенсивные исследования апоптоза, известны лишь единичные данные об индивидуальной вариабельности апоптотической гибели нормальных клеток человека (Crompton, 1998). Тем более неясно, существует ли корреляция между индивидуальным уровнем апоптоза в ответ на повреждение ДНК и частотой мутантных клеток у человека in vivo. Хотя отдельные данные, полученные при обследовании лиц с синдромом Ли-Фраумени, позволяют предполагать наличие такой корреляции. В связи с этим в данной диссертационной работе проведен анализ роли апоптотической элиминации клеток с поврежденной ДНК как одного из механизмов поддержания генетической стабильности клеточных популяций после радиационного воздействия на организм человека in vivo.

Таким образом, целью данной работы является исследование закономерностей и некоторых механизмов формирования генных мутаций в соматических клетках человека после радиационного воздействия in vivo.

При этом поставлены следующие задачи:

1. проанализировать зависимость частоты GPAмутантных клеток от дозы острого и пролонгированного радиационного воздействия;

2. определить зависимость частоты TCR-мутантных клеток от дозы пролонгированного и хронического облучения в ближайшие и отдаленные сроки после воздействия, а также возможные изменения этого показателя на индивидуальном уровне (по результатам повторных обследований);

3. оценить информативность GPAи TCRметодов для биологической дозиметрии радиационного воздействия в различных ситуациях;

4. провести сравнительное исследование частоты клеток с мутациями по 2-м указанным локусам у необлученных контрольных доноров и лиц, подвергшихся действию ионизирующего излучения в малых дозах, включая ликвидаторов аварии на ЧАЭС, облученных в дозах до 0,25 сГр, и жителей загрязненных радионуклидами территорий РФ;

5. исследовать влияние возраста в момент радиационного воздействия на частоту TCR-мутантных клеток у ликвидаторов аварии на ЧАЭС и жителей загрязненных радионуклидами территорий РФ;

6. оценить возможность использования показателей соматического мутагенеза (частоты GPAи TCR-мутантных клеток) в целях формирования группы лиц с повышенным риском возникновения злокачественных новообразований;

7. провести сравнительное исследование частоты TCR-мутантных клеток и индивидуального уровня апоптоза лимфоцитов после облучения in vitro у лиц, подвергшихся действию ионизирующего излучения в малых дозах.

Положения, выносимые на защиту:

1. Увеличение частоты клеток с генными мутациями на единицу дозы зависит от режима (острый/пролонгированный) радиационного воздействия на организм человека. Проведение биологической дозиметрии на основе анализа генных мутаций возможно после облучения в достаточно высоких дозах и более эффективно в случае острого воздействия;

2. Динамика проявления радиационно-индуцированных мутаций по разным локусам различается;

3. В отдаленные сроки после действия радиации в малых дозах отмечается высокая частота клеток с генными мутациями, что, вероятно, свидетельствует о нестабильности генома соматических клеток. Признаки генетической нестабильности наблюдаются не у всех облученных лиц и не во всех популяциях соматических клеток;

4. Повышение частоты клеток с генными мутациями у ликвидаторов аварии на ЧАЭС, облученных в дозах до 0,25 Гр, не связано с нарушением элиминации поврежденных клеток путем апоптоза;

5. Частота соматических клеток с генными мутациями, вероятно, может являться критерием для формирования группы лиц с повышенным канцерогенным риском.

Выводы:

1. Установлена прямая корреляция частоты ОРА (Ж))-мутантных эритроцитов и дозы радиационного воздействия. Выход мутантных клеток на единицу дозы зависит от мощности дозы облучения: при пролонгированном воздействии он примерно в три раза меньше, чем при остром.

2. Частота TCR-мутантных клеток статистически значимо коррелирует с дозой радиационного воздействия в течение не более 4-х лет после его окончания. При пролонгированном облучении выход TCR-мутантных клеток на единицу дозы зависит от длительности радиационного воздействия: с уменьшением длительности последнего, выход мутантных клеток увеличивается.

3. В близкие сроки после радиационного воздействия наблюдается прямая корреляция частоты TCR-и GPA (NO)-MyTaHTHbix клеток. Частоты N0- и NN-вариантных эритроцитов не коррелируют у лиц, подвергшихся облучению в достаточно высоких дозах, вследствие разных механизмов их формирования.

4. Подтверждена возможность использования GPA-метода в целях биологической дозиметрии острого облучения как в близкие, так и в отдаленные сроки после радиационного воздействия. Установлена низкая информативность этого метода при пролонгированном облучении, что обусловлено небольшим выходом NO-вариантных эритроцитов на единицу дозы при достаточно широкой индивидуальной вариабельности.

5. Частота ОРА (ТМО)-мутантных клеток у лиц, подвергшихся радиационному воздействию в малых дозах (до 0,25 Гр), соответствует контрольному уровню.

6. Во всех группах лиц, обследованных в отдаленные сроки после облучения в малых дозах, частота TCR-мутантных лимфоцитов статистически значимо выше таковой в группах соответствующего возрастного контроля. Имеющиеся данные позволяют расценивать этот факт как следствие радиационно-индуцированной генетической нестабильности лимфоцитов.

7. Феномен генетической нестабильности в отдаленные сроки после облучения в малых дозах характеризуется селективностью в отношении разных клеток организма, немонотонной зависимостью от дозы и мощности дозы воздействия, стабильностью количественных проявлений феномена в течение 9−17 лет после облучения, проявлением феномена только у части облученных лиц, зависимостью развития генетический нестабильности от возраста в момент облучения.

8. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли апоптоза поврежденных клеток как механизма поддержания генетической стабильности на уровне клеточных популяций. Повышение частоты TCR-мутантных клеток у ликвидаторов аварии на ЧАЭС, подвергшихся облучению в дозах до 0,25 Гр, в большинстве случаев не связано со снижением эффективности этого процесса.

9. Статистически значимое увеличение показателей соматического мутагенеза в группах лиц с злокачественными и доброкачественными новообразованиями различных локализаций (по сравнению с соответствующим контролем) указывает на возможность использования GPAи TCR-методов для формирования группы повышенного канцерогенного риска.

Заключение

.

Диссертационная работа посвящена исследованию радиационно-индуцированных изменений генетического материала в соматических клетках человека in vivo на уровне двух генных локусов: гликофорина, А (glycophorin, А — GPA) и Т-клеточного рецептора (T-cell receptor — TCR). Изучена частота мутантных клеток в различные сроки после радиационных воздействий разного типа: внешнего и внутреннегоострого, пролонгированного и хронического. Идентификация мутантных клеток осуществлялась с помощью проточной цитометрии на основе анализа иммунофенотипа клеток периферической крови в соответствии с ранее разработанными методиками (Kyoizumi et al., 1990; Langlois et al., 1990) с небольшими модификациями.

Полученные в работе результаты подтверждают существовавшее ранее представление о способности радиационно-индуцированных ОРА (Ж))-мутаций сохраняться в организме длительное время, сравнимое с продолжительностью жизни человека. Установлено, что при остром облучении частота GPA (NO)-BapnaHTHbix клеток линейно увеличивается с дозой на 33,4Т0″ 6/Гр. Сопоставление выхода NO-вариантных клеток на единицу дозы с данными литературы свидетельствует о высокой надежности, воспроизводимости GPA-метода и о возможности его использования для биодозиметрии острого облучения как в ближайшие, так и в отдаленные сроки после воздействия. По нашим оценкам порог чувствительности метода составляет около 0,5 Гр при остром облучении.

В работе впервые получены статистически достоверные данные о влиянии мощности дозы облучения на количество клеток с генными мутациями (при действии радиации на организм человека). Установлено, что при пролонгированном облучении частота NO-вариантных клеток увеличивается на 9,4' 10″ 6 клеток/Гр, что примерно в три раза меньше, чем при остром облучении. При наличии достаточно выраженной индивидуальной вариабельности, это приводит к снижению чувствительности метода. По всей видимости, он может быть использован при групповой дозиметрии пролонгированного облучения в дозах больше 1−1,5 Гр.

Частота TCR-мутантных клеток статистически значимо коррелировала с дозой радиационного воздействия (как и с частотой GPA (ЪЮ)-вариантных клеток) только в близкие сроки после облучения. Эти результаты подтверждают известный из литературы факт достаточно быстрой элиминации радиационно-индуцированных TCR-мутантных клеток. Впервые нами представлены данные о количестве таких клеток после тотального (пролонгированного) облучения людей. Показано, что выход TCR-мутантных клеток зависит от длительности радиационного воздействия. Учитывая полученные нами результаты и данные литературы, можно полагать, что наиболее целесообразным является использование TCRтеста для биодозиметрии острого облучения в близкие сроки — в течение не более 4-х лет с момента его окончания.

Таким образом, в работе изучены закономерности возникновения и элиминации соматических клеток с генными мутациями по отдельным локусам в зависимости от дозы и мощности дозы радиационного воздействия на организм человека. Полученные результаты, расширяя наши представления о мутагенезе в соматических клетках человека при облучении in vivo, имеют не только теоретическое, но и практическое значение. Проведенные исследования позволили оценить информативность двух методов определения генных мутаций для биологической дозиметрии радиационных воздействий. В частности, был выявлен ряд ограничений, связанных с возможным применением этих методов с целью дозиметрии: 1) установлена низкая информативность GPA-теста при пролонгированном облучении;

2)показаны сложности, связанные с использованием TCR-метода. Установленные ограничения имеют важное значение для корректного применения указанных методов для биодозиметрии в случае необходимости в дальнейшем.

Отдельному изучению подвергнуты возможные эффекты генотоксического действия ионизирующих излучений в малых дозах. Для этого проведено обследование ликвидаторов аварии на ЧАЭС через 9−17 лет после облучения и постоянных жителей ряда областей РФ, загрязненных радионуклидами. Полученные данные о частоте TCRи ОРА (ЫО)-вариантных клеток сравнивали с соответствующими показателями в группах контрольных лиц сходного возраста. Во всех обследованных группах обнаружено статистически значимое увеличение частоты TCR-мутантных клеток после радиационного воздействия в малых дозах по сравнению с контролем. В то же время частота GPA (ЫО)-вариантных клеток не отличалась от контрольного уровня (также во всех группах). Учитывая известные особенности формирования мутаций по указанным локусам, дозы и сроки облучения, имеются основания расценивать эти факты как проявление (на генном уровне) радиационно-индуцированной нестабильности генетического материала лимфоцитов. В работе выявлены следующие закономерности проявления этого феномена в отдаленные сроки после облучения в малых дозах:

— селективный характер в отношении разных клеток организма: повышение частоты мутантных лимфоцитов и сохранение на уровне контроля количества мутантных гемопоэтических клеток стволового типа, о котором судили по количеству NO-вариантных эритроцитов;

— отсутствие монотонной зависимости эффекта от дозы и мощности дозы радиационного воздействия;

— сохранение эффекта (повышенной частоты TCR-мутантных лимфоцитов) на стабильном уровне в течение 9−17 лет после радиационного воздействия;

— проявление этого феномена только у части облученных лиц;

— зависимость проявлений феномена генетической нестабильности от возраста в момент облучения.

Повышенная частота мутантных клеток в отдаленные сроки после облучения может быть обусловлена как высокой частотой мутаций вследствие нестабильности генома, возникшей у потомков облученных клеток, так и нарушением механизмов элиминации клеток с поврежденной ДНК. В данной диссертационной работе исследована также реальность второго объяснения. С этой целью частота TCR-мутантных клеток у ликвидаторов аварии на ЧАЭС была сопоставлена с уровнем апоптотической гибели лимфоцитов этих же лиц после облучения in vitro. В целом, наши результаты свидетельствуют о том, что низкий уровень апоптоза поврежденных клеток может являться фактором увеличения количества TCR-мутантных лимфоцитов у части ликвидаторов, что согласуется с представлениями о важной роли апоптоза как механизма поддержания генетической стабильности клеточных популяций. Однако у большинства ликвидаторов с высокой частотой TCR-мутантных клеток наблюдался нормальный уровень апоптотической элиминации поврежденных клеток. Таким образом, у большинства лиц повышение частоты лимфоцитов с генными мутациями не связано со снижением эффективности процесса апоптоза, а обусловлено другими причинами, что еще раз подтверждает сделанное нами заключение об индукции генетической нестабильности в этих клетках.

Имеющиеся в литературе данные о существовании причинно-следственных связей между процессами мутагенеза и канцерогенеза позволили предположить, что лица с высокой частотой TCRи GPAвариантных клеток могут иметь повышенный риск возникновения злокачественных новообразований. Для проверки этого предположения в настоящей работе был проведен анализ частоты клеток с мутациями по указанным локусам у лиц с злокачественными и доброкачественными новообразованиями. Установленное нами статистически значимое увеличение показателей соматического мутагенеза и в той и в другой группе (по сравнению с контролем) свидетельствует о потенциальной возможности использования GPAи TCR-методов для формирования группы повышенного канцерогенного риска.