Изучение структуры и механизма действия ингибиторов сериновых протеиназ из актинии Radianthus macrodactylus

Поиск биологически активных природных соединений, специфически взаимодействующих с протеолитическими ферментами и регулирующих их активность, изучение взаимосвязи между их структурой и функцией является одной из интереснейших и важнейших задач биоорганической химии, так как протеолитические ферменты и процессы протеолиза играют ключевую роль в белковом обмене живых организмов. Известно, что одним из основных способов регуляции действия ферментов является ингибирование их активности. В связи с этим, исследование структурно-функциональных особенностей, специфичности и механизма действия ингибиторов протеиназ является фундаментальной задачей, выясняющей молекулярные основы белок-белковых взаимодействий. Решение этой задачи может служить основой для создания лекарственных препаратов направленного действия при лечении заболеваний, вызванных нарушением естественной регуляции активности протеолитических ферментов.

К настоящему времени накоплен огромный массив информации о структуре и функциональной активности ингибиторов сериновых протеиназ растительного и животного происхождения. В то же время ингибиторам протеиназ морских организмов, в частности, ядовитых кишечнополостных, актиний, посвящено несравнимо меньшее количество публикаций. Уже более двадцати лет известно, что в организме-продуценте ингибиторы протеиназ присутствуют совместно с нейрои цитотоксинами, выполняющими алломональную роль, но до сих пор отсутствует убедительное объяснение этого феномена. Это требует расширения знаний как о структуре и механизме действия ингибиторов, так и об их экологической роли в морском биоценозе.

Актуальность поиска и установления структуры новых представителей ингибиторов протеиназ актиний связана с обнаружением у ряда представителей этой группы полипептидов новых биологических функций. Так установлено, что некоторые ингибиторы протеиназ актиний способны блокировать потенциал-зависимые калиевые каналы, взаимодействовать с ваниллоидным рецептором TRPV1, проявлять антигистаминную активность, что свидетельствует об их полифункциональности.

Выделение новых ингибиторов из актиний, изучение их структурной организации и механизма действия с помощью современных биохимических, биофизических, молекулярно-биологических, а также методов компьютерного моделирования, позволит понять причины их структурно-функционального многообразия.

Настоящая работа является частью исследований, проводимых в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по изучению структуры и функции биологически активных полипептидов актиний. Данная диссертационная работа посвящена изучению физико-химических свойств ингибиторов, выделенных из тропической актинии Radianthus macrodactylus, установлению их аминокислотных последовательностей, исследованию пространственной организации, специфичности, а также изучению механизма действия и биологической активности этих полипептидов.

5. Выводы.

1. Из актинии R. macrodactylus выделены и охарактеризованы три новых ингибитора сериновых протеиназ (InhVJ, Rmln I и Rmln II). Установлено, что полипептиды относятся к семейству Кунитца.

2. Установлены аминокислотные последовательности N-концевых фрагментов ингибиторов Rmln I, Rmln II и полная аминокислотная последовательность ингибитора InhVJ. Обнаружена высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей ингибиторов, выделенных из таких эволюционно далеких типов организмов, как кишечнополостные, пресмыкающиеся и млекопитающие.

3. Выявлены различия в строении реактивных центров ингибиторов. Показано, что замена одного аминокислотного остатка в реактивном центре ингибиторов приводит к уменьшению их ингибирующей активности.

4. Исследована пространственная организация ингибитора InhVJ на уровне вторичной и третичной структуры. Показано, что InhVJ имеет упорядоченную вторичную, жесткую третичную структуру и относится к белкам со смешанной а+Р структурой.

5. Изучены специфичность ингибиторов и особенности их взаимодействия с протеиназами. Показано, что ингибиторы InhVJ, Rmln I и Rmln II являются высокоспецифичными полипептидами: ингибируют активность только двух сериновых протеиназ, трипсина и а-химотрипсина. Установлено, что ингибиторы образуют комплексы с протеиназами в стехиометрическом соотношении 1:1. Рассчитаны константы ингибирования, определены кинетические и термодинамические характеристики комплексов ингибитор-протеиназа.

6. Установлено, что ингибитор InhVJ взаимодействует с сериновыми протеиназами в области их активных центров. Количество и тип связей, стабилизирующих комплексы, вероятно, определяет ингибирующую способность полипептида.

7. Обнаружено, что ингибиторы Rmln I и Rmln II проявляют антигистаминную активность. Показано, что характер влияния ингибиторов на эффект торможения развития аллергической реакции является дозозависимым. Предсказана возможность взаимодействия InhVJ с потенциал-зависимым калиевым каналом. Таким образом, выделенные полипептиды могут быть отнесены к полифункциональным ингибиторам протеиназ.