Изучение структуры и метаболизма отдельных фракций неорганических полифосфатов у дрожжей Saccharomyces сerevisiae

Актуальность проблемы. Фосфор, входящий в состав многих важных клеточны компонентов, в том числе нуклеотидов, нуклеиновых кислот, фосфолипидов и других соединений, абсолютно необходим для жизнедеятельности клеток. Неорганически полифосфаты (полиР) — полимеры, состоящие из остатков ортофосфорной кислоты, соединенных между собой макроэргическими фосфоангидридными связями, при гидролиз которых высвобождается энергия примерно такая же, как и при отщеплении терминального фосфата от АТФ. Благодаря этому, полиР являются запасниками фосфора и энергии, а такж выполняют другие многочисленные функции: участвуют в связывании катионов, обеспечивая внутриклеточных ионный баланс (Oshumi and Anraku, 1981; Lichko et al., 1982), в формировании и функционировании клеточной оболочки (Вагабов и др., 1990; Иванов и др., 1996), в регуляции активности ряда ферментов (Wolska-Mitaszko, 1997; Кулаев и др., 1999), в преодолении осмотического и щелочного стрессов, температурного шока (Greenfield et al., 1987; Castro et al., 1997), в формировании специальных каналов, транспортирующих некоторые ионы, через клеточные мембраны (Рош, 2000) и др. Все это выдвигает исследования путей метаболизма неорганических полифосфатов в ряд актуальных задач биохимии и клеточной биологии.

В зависимости от компартментации и состояния в клетке полиР экстракцией можно разделить на несколько фракций, функции которых определяются компартментом, с которым связаны эти соединения. О динамике и структуре фракций полиР в процессе роста клеток в литературе имеются фрагментарные данные. Они касаются, в основном, общего содержания полиР в клетке или в отдельной органелле (Liss and Langen, 1962; Greenfield et al., 1987, Beauvoit et al., 1989). Количественное содержание фракций является результатом двух противоположных процессов — синтеза и деградации полиР. Пути синтеза полиР у дрожжей, в отличие от бактерий, до сих пор остаются неясными. Доказан только путь сопряженного синтеза фракции высокомолекулярных полиР, локализованной в клеточной оболочке, и маннопротеина клеточной стенки, который обеспечивает образование части общего пула полиР в клетке (Kulaev, Vagabov, and Shabalin, 1987). Одним из подходов к пониманию путей биосинтеза полиР может быть изучение влияния метаболических ингибиторов на биосинтез отдельных фракций этих полимеров. Имеющиеся сообщения касаются суммарного количества в целых клетках и содержания полиР в митохондриях дрожжей (Beauvoit et al., 199]- Loureiro-Dias and Santos 1989; Pestov et al., 2003).

Экзополифосфатазы, участвующие в деградации полиР, обнаружены почти во всех клеточных структурах дрожжей и имеют определенную специфичность по отношению к длине субстрата. (Lichko et al., 2003а). Однако, механизмы вовлечения полиР в метаболизм с участием этих ферментов пока не известны. Изучение структуры и метаболизма отдельных фракций полиР у дрожжей обусловлено необходимостью выяснения путей биосинтеза и функций полиР, локализованных, в клеточных органеллах, что позволит, в конечном итоге, более полно представить картину обмена этих необычных полианионов.

Цель и задачи исследования

Целью работы являлось изучение структуры и содержания отдельных фракций полифосфатов в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisicte в зависимости от фазы роста, условий культивирования, а также мутаций по основным генам полифосфатного обмена.

Исходя из поставленной цели, необходимо было решить следующие задачи:

1) подобрать оптимальный метод экстракции фракций полиР из дрожжей, позволяющий осуществлять более полное и дробное извлечение их из’клеггок, и определить структуру фракций методом «'Р-ЯМР-спектроскопии:

2) определить содержание и структуру фракций полиР на разных фазах роста культуры дрожжей, а также в процессе фосфорного голодания и последующего сверхсинтеза полиР;

3) определить длину цепи и содержание полиР в вакуолях в обычных условиях роста дрожжей и в условиях сверхсинтеза полиР;

4) изучить влияние ингибиторов различных биохимических процессов на синтез фракций полиР;

5) изучить содержание отдельных фракций полиР у мутантов ' S. cerevisicie с инактивированными генами экзополифосфатазы РРХ1 и эндополифосфатазы PPN1.

Научная новизна работы. Установлено, что в процессе роста S. cerevisicie ВКМ Y-] 173 каждая фракция полиР характеризуется своей динамикой накопления и потребления. Сочетанием химической экстракции полиР из клеток и метода 3, Р-ЯМР впервые показано, что средняя длина цепи разных фракций не является константной величиной, а изменяется в процессе роста и в зависимости от условий культивирования дрожжей.

Впервые выявлен ступенчатый характер синтеза щелочерастворимых полифосфатов, когда после фосфорного голодания на первом этапе происходит накопление полифосфатов, а на следующем — только. увеличение длины их цепи.

Обнаружено, что полифосфаты вакуолей и щелочерастворимой фракции полиР4, в отличие от других фракций этих соединений, не подвержены сверхнакоплению, что свидетельствует о существовании различных механизмов регуляции синтеза полиР в клетках дрожжей.

Установлено, что ингибиторы биохимических процессов по-разному влияют на уровень накопления отдельных фракций полифосфатов, в частности, ЦГИ и FCCP полностью подавляют накопление фракции полиР4, а 2-дезоксиглюкоза — фракции полиРЗ.

С помощью мутантов с инактивированными генами, кодирующими экзополифосфатазу цитозоля РРХ1 и эндополифосфатазу вакуолей PPN1, впервые выявлена метаболическая связь между содержанием кислоторастворимой фракции полиР 1 и уровнем экзополифосфатазной активности цитозоля у дрожжей.

Совокупность полученных данных дает основания выдвинуть гипотезу о множественности путей биосинтеза отдельных фракций полифосфатов у дрожжей S. cerevisicie.

Научно-практическое значение. Данная работа является фундаментальным, исследованием. Полученные результаты систематизируют и расширяют представления о структуре и метаболизме фракций полиР у дрожжей, в частности в условиях фосфорного голодания и последующей их гиперкомпенсации, при воздействии ингибиторов, а также влияние на их уровень мутаций по основным генам полифосфатного обмена. Материалы работы могут быть использованы в лекциях и практических занятиях студентов по биохимии микроорганизмов.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 114 страницах, содержит 15 таблиц и 14 рисунков. Библиографический указатель включает 211 источников литературы.

ВЫВОДЫ.

Впервые сочетанием методов химической экстракции и 31Р-ЯМР-спектроскопии выделены и охарактеризованы отдельные фракции полиР, различающиеся изменением степени полимерности и динамикой накопления и потребления в процессе роста Saccharomyces cerevisiae.

Выявлен ступенчатый характер синтеза щелочерастворимых полифосфатов, характеризующийся тем, что на первом этапе после фосфатного голодания происходит накопление этих соединений, а на следующем — только увеличение длины их цепи.

Обнаружено, что полифосфаты вакуолей и щелочерастворимой фракции полиР4, в отличие от основной массы этих соединений клетки, не подвержены гиперкомпенсации, что указывает на существование различных механизмов регуляции синтеза полиР у дрожжей.

Установлено, что ингибиторы биохимических процессов по-разному влияют на накопление отдельных фракций полифосфатов, в частности, процесс синтеза фракции полиР4 является более чувствительным к действию протонофора FCCP и циклогексимида, а фракции полиРЗ — к действию 2-дезоксиглюкозы.

С помощью мутантов с инактивированными генами экзополифосфатазы цитозоля РРХ1 и эндополифосфатазы PPN1, впервые выявлена метаболическая связь между содержанием кислоторастворимой фракции. полиР! и уровнем экзополифосфатазной активности цитозоля у дрожжей.

Совокупность полученных данных дает основание выдвинуть гипотезу о множественности путей биосинтеза и регуляции отдельных фракций полифосфатов у дрожжей S. cerevisiae.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

На начальном этапе экспериментальной работы нами был проведен сравнительный анализ различных химических методов выделения фракций полиР из клеток дрожжей. Исследование содержания отдельных фракций было впервые проведено в сочетании с 3|Р-ЯМР-спектроскопическим определением длины их цепи. Такой подход позволил с одной стороны оценить количественный вклад каждой фракции в общий пул полиР, с другойопределить среднюю степень полимерности каждой из них. Метод выделения фракций полиР, предложенный Лангеном и Лиссом в модификации И. С. Кулаева и др.(1960), позволил по сравнению с другими, во-первых, более полно экстрагировать эти соединения из клеток и, во-вторых, разделить общий пул полиР дрожжевой клетки на большее число фракций, различающихся степенью полимерности. Благодаря этому в дальнейших исследованиях удалось обнаружить особенности в поведении отдельных фракций полиР в различных условиях культивирования дрожжей.

В данной работе нами было прослежено изменение содержания отдельных фракций полиР в процессе роста дрожжей S. cerevisiae, начиная с посевного материала (0 ч) и заканчивая глубоким стационаром (24 ч). Большая часть полифосфатного пула клеток сосредоточена в двух фракциях — полиР! и полиРЗ. Часть кислоторастворимой фракции полиР1, около 30%, расположена в вакуолях. В процессе роста дрожжей каждая фракция полиР характеризуется при наличии глюкозы в среде своей динамикой накопления, а в ее отсутствии — своей динамикой потребления. Последнее указывает на использование полиР клетками в качестве источника энергии. Обнаруженные изменения степени полимерности отдельных фракций на разных фазах роста дрожжей позволили выделить несколько особенностей в поведении фракций в процессе роста культуры. Во-первых, как утверждалось и ранее (Langen and Liss, 1959), каждая фракция имеет свою степень полимерности, которая возрастает от полиР 1 до полиР4. Во-вторых, было обнаружено, что в процессе роста дрожжей степень полимерности фракций не постоянна, причем для каждой из фракций отмечен свой характер изменения длины цепи. Наиболее высокополимерные фракции полиРЗ и полиР4 имеют более высокую степень полимерности в стационарной фазе. Длина цепи фракции полиР2 подвержена значительным колебаниям в процессе всего развития культуры, в то же время длина цепи субфракций полиР1−1 и полиР1−2 практически не изменяется. В-третьих, на некоторых фазах роста разные фракции полиР могут иметь одинаковые длины цепей (рис. 8, полиР2 и полиРЗ). Эти факты свидетельствуют или о неодинаковом их состоянии в клетке, или о различной их компартментации.

В условиях дефицита экзогенного фосфата в среде дрожжи активно используют все фракции полиР в качестве внутриклеточного резерва этого элемента (табл.10). При этом, за исключением полиР2, происходит снижение степени полимерности фракций полиР, что безусловно связано с деградацией этих соединений в процессе их активного потребления. Перенос клеток на свежую фосфат содержащую среду вызывает быстрый рост содержания полифосфатных фракций (гиперкомпенсация), но больше всего их накапливается во фракциях полиР 1, полиР2 и особенно полиРЗ (рис. 11, точка С). Исключение составляет локализованная в клеточной оболочке фракция полиР4, первоначальный уровень которой восстанавливается только к 4 ч культивирования на среде с фосфатом. Аналогичный эффект наблюдается и в вакуолях, полиР которых, как и полиР других компартментов клетки, в условиях фосфорного голодания быстро потребляются, но в условиях гиперкомпенсации в них не происходит сверхнакопление этих соединений. Этот факт позволяет предполагать, что в разных компартментах имеются различные пути метаболизма полиР и их регуляции.

Измерение длины цепи отдельных фракций полиР показало, что она зависит не только от способа фракционирования, как считалось ранее (Langen and Liss, 1959, Кулаев, 1975), но и от условий роста дрожжей. Интересно, что длина цепи фракций полиРЗ и полир4 в течение первых 2 ч интенсивного синтеза в условиях гиперкомпенсации находится практически на том же уровне, что и в условиях фосфорного голодания (рис. 12а, точка С) и увеличивается только при продолжении роста культуры на фосфатной среде (рис. 12а, точка D). Это предполагает существование ступенчатого характера синтеза высокомолекулярных фракций полиР. В этом случае в них в условиях гиперкомпенсации вначале образуется сверхвысокое количество полиР, и только в процессе дальнейшего роста культуры происходит увеличение длины цепи этих соединений при неизменном их количестве во фракции.

Анализ результатов по накоплению фракций полиР в процессе роста и в условиях их интенсивного потребления и гиперкомпенсации (рис. 6 и П) показывает, что полиР щелочерастворимой при рН 9−10 фракции (полиРЗ), в отличие от фракций полиР 1, полиР2 и полиР4, способны более интенсивно накапливаться и более интенсивно потребляться. В условиях гиперкомпенсации ее содержание в клетках достигает 40% суммы всех полиР клетки. Высокая мобильность данной фракции позволяет предполагать, что ее основная роль в дрожжевой клетке заключается в создании резерва фосфора и энергии.

Суммируя полученные нами данные о влиянии ингибиторов на накопление фракций полиР, следует отметить следующее. Использованные ингибиторы в разной степени действуют на накопление отдельных фракций полиР. Так, накопление фракции полиР4 полностью подавляется ЦГИ. Это подтверждает представление о том, что данная фракция имеет особый путь биосинтеза, связанный с синтезом маннопротеинов клеточной стенки (Шабалин и др., 1979; Kulaev and Vagabov, 1983; Kulaev et al., 1987; Вагабов, 1988). Возможно, она и функционально также связана с этой органеллой (Вагабов и др., 1990; Иванов и др., 1996). Отсутствие или слабое влияние ЦГИ на накопление других фракций полиР указывает на то, что индукция синтеза соответствующих ферментных систем происходит еще на этапе фосфорного голодания.

Полное торможение синтеза фракции полиР4 и снижение уровня накопления остальных фракций, за исключением полиР2, под воздействием FCCP показывает, что наличие электрохимического потенциала ДрН* на мембранах клеточных органелл является важным фактором для накопления каждой из них, хотя и в разной степени. Наиболее вероятной причиной такого эффекта может быть низкое содержание Pi у дрожжей (табл.13). Известно, что поступление Pj в клетку зависит от уровня градиента электрохимического потенциала ДцН+ на цитоплазматической мембране (Persson et al., 2003), понижающегося в данном случае в присутствии FCCP.

Ингибирование Н'-АТРазы вакуолей бафиломицином А1, хотя и в значительно меньшей степени, чем FCCP, также приводит к уменьшению накопления фракций полиР, за исключением полиР 1, что подтверждает важное значение для биосинтеза полиР существования A|iH+ на мембранах.

2-Дезоксиглюкоза, снижая почти в 2 раза накопление общей суммы клеточных полиР, в разной степени тормозит синтез отдельных фракций и полностью подавляет накопление только фракции полиРЗ. Это свидетельствует о тесной связи их синтеза с углеводным обменом, а для полиРЗ — полной от него зависимости (Кулаев, 1975). Различное влияние ингибиторов на накопление отдельных фракций полиР подтверждает множественность путей биосинтеза полиР.

Использование ингибиторов позволило разграничить два процесса, протекающих в клетках после пересева дрожжей с фосфат-дефицитной на полноценную среду — накопление полиР и синтез de novo высокомолекулярной экзополифосфатазы (II) цитозоля (табл. 13). Так, ЦГИ, блокирующий синтез этого фермента, почти не влияет на содержании полиР, 2-дезоксиглюкоза, подавляющая практически в 2 раза накопление полиР, всего на 20% снижает биосинтез экзополифосфатазы, a FCCP, не снижающий уровень активности фермента, на 30% тормозит накопление полиР. Следовательно, экзополифосфатаза (И) цитозоля, по-видимому, не имеет отношения к синтезу полиР. Для выяснения роли этих ферментов потребовались дополнительные исследования.

При фосфорном голодании дрожжей вакуолярная экзополифосфатаза экзополифосфатазы сферопластов вели себя по-разному. В вакуолях происходило более чем четырех кратное увеличение активности фермента, которая после культивирования дрожжей в условиях гиперкомпенсации полиР, снижалась примерно в 7 раз, в то время как в сферопластах в этих условиях наблюдалось незначительное изменение активности. Т. е. в вакуолях регуляция синтеза фермента осуществляется экзогенным Р-, как это наблюдается у бактерий (Harold, 1964; Несмеянова и др., 1974) и отличается от таковой в сферопластах. Это позволяет считать, что в условиях фосфорного голодания полиР вакуолей используются для поддержания жизнедеятельности клетки именно при участии экзополифосфатазы. В то же время механизм мобилизации клеткой полиР, находящихся в других органеллах, в этих условиях роста, по-видимому, иной.

Изучение накопления фракций полиР у мутантов, имеющих инактивированные гены цитозольной экзополифосфатазы I и вакуолярной эндополифосфатазы, позволило уточнить связь между обменом отдельных фракций полиР и названными ферментами.

Наши исследования отдельных фракций у данных штаммов показали, что на изменения ферментного состава у мутантов реагирует наиболее представительная у данного штамма дрожжей кислоторастворимая фракция полиР1 (рис.15). Поскольку экзополифосфатаза Iцитозольный фермент, а эндополифосфатаза — вакуолярный, повышение уровня фракции полиР! у мутанта CRX на 40%, а у мутантов CRN и CNX более, чем в 2 раза по сравнению с родительским штаммом, подтверждает, что данная фракция имеет множественную клеточную локализацию. Часть ее находится в цитоплазме, а часть — в вакуолях. Это, в свою очередь, согласуется с полученными нами данными о содержании в вакуолях дрожжей S. cerevisiae штамм ВКМ Y-1173 до 30% кислоторастворимой фракции клеток.

В то же время у двойного мутанта CNX увеличивается не только фракция полиР 1, но и щелочерастворимая фракция полиРЗ. Видимо, только одновременное отсутствие полифосфатаз цитозоля и вакуолей приводит к торможению потребление клеткой полиР этой фракции. Практически одинаковый уровень солерастворимой фракции полиР2 у всех штаммов демонстрирует отсутствие функциональной связи вакуолярной эндополифосфатазы и цитоплазматических экзополифосфатаз I и II с данной фракцией полиР и говорит в пользу возможной локализации последней в ядре (Кулаев и др., 1970; Kulaev et al., 2004).

Полученные в работе данные четко показывают, что исследованные фракции полиР имеют разную компартментацию, как и предполагалось ранее (Kulaev and Vagabov, 1983), и разные пути метаболизма, и, следовательно, они могут выполнять специфические функции, связанные с особенностями конкретного компартмента.

В нашем исследовании использовано понятие «накопление», которое отражает сумму полифосфатов в клетке, получаемую в результате двух противоположных процессовсинтеза и потребления данных полимеров. Однако, использование методического приема, приводящего к интенсивному синтезу полиР после переноса клеток из среды без фосфата в фосфат содержащую среду и дополненного ингибиторным анализом, позволяет с большей определенностью судить о процессах синтеза этих соединений.

Представленные результаты, свидетельствующие о различной динамике накопления отдельных фракций полиР и изменяющейся при этом степени их полимерности как в процессе роста дрожжей, так и в условиях гиперкомпенсации полиР, а также различное влияние ингибиторов на накопление отдельных фракций полиР, дают основание выдвинуть гипотезу о множественности путей биосинтеза этих полимеров.

У дрожжей к настоящему времени достоверно показан путь синтеза полиР, сопряженный с синтезом важнейшего компонента клеточной стенки — маннопротеина (Kulaev et al., 1987; Kulaev et al., 2004). У некоторых грибов и ряда других микроорганизмов обнаружен путь синтеза полиР с участием 1,3 дифосфоглицерата (Кулаев и Бобык, 1971; Kulaev et al., 2004). Однако, такой путь синтеза пока не выявлен у дрожжей. Широко распространенный у бактерий синтез полиР за счет терминального фосфата АТФ при участии полифосфаткиназы, у дрожжей до настоящего времени не доказан. Незначительная активность фермента (Felter and Stahl, 1973) обнаружена только в вакуолях, при этом на порядок более активно протекала обратная реакция образования АТФ из полиР (Шабалин и др, 1977; Kulaev et al., 2004). Поэтому вопрос о путях синтеза полиР у дрожжей до сих пор остается одной из важнейших проблем биохимии полиР.