Помощь в написании студенческих работ
Антистрессовый сервис

Изучение структуры и метаболизма отдельных фракций неорганических полифосфатов у дрожжей Saccharomyces сerevisiae

Диссертация: Изучение структуры и метаболизма отдельных фракций неорганических полифосфатов у дрожжей Saccharomyces сerevisiae
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

В зависимости от компартментации и состояния в клетке полиР экстракцией можно разделить на несколько фракций, функции которых определяются компартментом, с которым связаны эти соединения. О динамике и структуре фракций полиР в процессе роста клеток в литературе имеются фрагментарные данные. Они касаются, в основном, общего содержания полиР в клетке или в отдельной органелле (Liss and Langen… Читать ещё >

Изучение структуры и метаболизма отдельных фракций неорганических полифосфатов у дрожжей Saccharomyces сerevisiae (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Содержание

  • Введение 6 ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУ РЫ
  • Глава 1. Полифосфаты, их локализация в клетках дрожжей, метаболизм и функции
    • 1. 1. Содержание, локализация и длина цепи фракций полифосфатов в клетках дрожжей
      • 1. 1. 1. Содержание полифосфатов
      • 1. 1. 2. Фракции полифосфатов и их локализация в клетках дрожэ/сеу
      • 1. 1. 3. Длина iienu полифосфатов у дрожжей
    • 1. 2. Динамика содержания полифосфатов в клетках в процессе роста дрожжей
    • 1. 3. Явление гиперкомпенсации полифосфатов у микроорганизмов
      • 1. 3. 1. Прокариоты
      • 1. 3. 2. Эукариоты
    • 1. 4. Синтез и деградация полифосфатов в клетках дрожжей
      • 1. 4. 1. Пути синтеза
      • 1. 4. 2. Ферменты деградации
    • 1. 5. Функции полифосфатов в клетках дрожжей
  • Глава 2. Влияние ингибиторов на содержание полифосфатов в клетках дрожжей
  • Глава 3. Влияние инактивации генов полифосфатного метаболизма на уровень полиР в клетках мутантов S. cerevisiae 38 ЧАСТЬ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
    • 2. 1. Объект исследования
    • 2. 2. Условия культивирования
    • 2. 3. Получение биомассы клеток
    • 2. 4. Получение сферопластов из клеток дрожжей
    • 2. 5. Выделение вакуолей
    • 2. 6. Методы экстракции полифосфатов 44 2. б. 1. Метод Лангена и Лисса в модификации Кулаева и др
      • 2. 6. 2. Метод Лангена к Лисса в модификации Чернышевой и др
      • 2. 6. 3. Метод Кларк и др
    • 2. 7. Определение различных фосфорных соединений во фракциях
    • 2. В. Сорбция нуклеотидов на уголь
      • 2. 9. Подготовка образца полиР для 31Р-ЯМР-спектроскопии
      • 2. 10. Рабочие параметры прибора при снятии Э1Р-Я№Р-спектров полиР
    • 2. «J 1. Количественные методы определения фосфора. 49 2.11.1. Метод Беренблюма и Чейиа в модификации Вейль — Малеров и
  • Грина
    • 2. Л. 2. Метод Якке и др
      • 2. 12. Определение белка по методу Лоури в модификации Петерсона
      • 2. 13. Определение глюкозы 51 2.14 Разделение экзополифосфатаз I и II цитозоля
      • 2. 15. Определение ферментативных активностей
        • 2. 15. 1. Определение экзополифосфатазной активности цитозоля
        • 2. 15. 2. Определение экзополифосфатазной активности вакуолей
        • 2. 15. 3. Определение АТФазной активности вакуолей
        • 2. 15. 4. Определение о.-маннозидазы
        • 2. 14. 5. Определение а-глюкозидазы. '
      • 2. 16. Очистка полиР от примесей низкомолекулярных компонентов
      • 2. 17. Определение сухой биомассы клеток дрожжей. 53 ЧАСТЬ 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
      • 3. 1. Сравнительный анализ фракций полифосфатов, выделенных различными методами из клеток S. cerevisiae
      • 3. 2. Зависимость содержания и длины цепи фракций полифосфатов от фазы роста дрожжей S. cerevisiae
        • 3. 2. 1. Изменение содержания фракций полифосфатов в прогрессе роста дрожжей
        • 3. 2. 2. Изменение длины цепи отдельных фракций полифосфатов в процессе роста дрожжей
      • 3. 3. Влияние концентрации Р- в среде на накопление и степень полимерности различных фракций полифосфатов у дрожжей S. cerevisiae
        • 3. 3. 1. Подбор оптимальных условий культивирования дрожжей, обеспечивающих феномен гитркомпенсагии полифосфатов

        3.3.2. Динамика содержания полифосфатов в клетках дрожжей в условиях фосфорного голодания и гиперкомтнсагпт. 71 3.3.3. Изменение длины tie ни полифосфатов в клетках дрожжей в условиях фосфорного голодания и гиперкомпенсаиии.

        3.4. Полифосфатазная активность в дрожжевых сферопластах и вакуолях в условиях фосфорного голодания и гиперкомпенсации полиР.

        3.5. Влияние ингибиторов на накопление полифосфатов у S. cerevisiae в условиях интенсивного их синтеза.

        3.6. Влияние инактивации генов РРХ1 и PPN1 на уровень полифосфатов у

        S. cerevisiae.

Актуальность проблемы. Фосфор, входящий в состав многих важных клеточны компонентов, в том числе нуклеотидов, нуклеиновых кислот, фосфолипидов и других соединений, абсолютно необходим для жизнедеятельности клеток. Неорганически полифосфаты (полиР) — полимеры, состоящие из остатков ортофосфорной кислоты, соединенных между собой макроэргическими фосфоангидридными связями, при гидролиз которых высвобождается энергия примерно такая же, как и при отщеплении терминального фосфата от АТФ. Благодаря этому, полиР являются запасниками фосфора и энергии, а такж выполняют другие многочисленные функции: участвуют в связывании катионов, обеспечивая внутриклеточных ионный баланс (Oshumi and Anraku, 1981; Lichko et al., 1982), в формировании и функционировании клеточной оболочки (Вагабов и др., 1990; Иванов и др., 1996), в регуляции активности ряда ферментов (Wolska-Mitaszko, 1997; Кулаев и др., 1999), в преодолении осмотического и щелочного стрессов, температурного шока (Greenfield et al., 1987; Castro et al., 1997), в формировании специальных каналов, транспортирующих некоторые ионы, через клеточные мембраны (Рош, 2000) и др. Все это выдвигает исследования путей метаболизма неорганических полифосфатов в ряд актуальных задач биохимии и клеточной биологии.

В зависимости от компартментации и состояния в клетке полиР экстракцией можно разделить на несколько фракций, функции которых определяются компартментом, с которым связаны эти соединения. О динамике и структуре фракций полиР в процессе роста клеток в литературе имеются фрагментарные данные. Они касаются, в основном, общего содержания полиР в клетке или в отдельной органелле (Liss and Langen, 1962; Greenfield et al., 1987, Beauvoit et al., 1989). Количественное содержание фракций является результатом двух противоположных процессов — синтеза и деградации полиР. Пути синтеза полиР у дрожжей, в отличие от бактерий, до сих пор остаются неясными. Доказан только путь сопряженного синтеза фракции высокомолекулярных полиР, локализованной в клеточной оболочке, и маннопротеина клеточной стенки, который обеспечивает образование части общего пула полиР в клетке (Kulaev, Vagabov, and Shabalin, 1987). Одним из подходов к пониманию путей биосинтеза полиР может быть изучение влияния метаболических ингибиторов на биосинтез отдельных фракций этих полимеров. Имеющиеся сообщения касаются суммарного количества в целых клетках и содержания полиР в митохондриях дрожжей (Beauvoit et al., 199]- Loureiro-Dias and Santos 1989; Pestov et al., 2003).

Экзополифосфатазы, участвующие в деградации полиР, обнаружены почти во всех клеточных структурах дрожжей и имеют определенную специфичность по отношению к длине субстрата. (Lichko et al., 2003а). Однако, механизмы вовлечения полиР в метаболизм с участием этих ферментов пока не известны. Изучение структуры и метаболизма отдельных фракций полиР у дрожжей обусловлено необходимостью выяснения путей биосинтеза и функций полиР, локализованных, в клеточных органеллах, что позволит, в конечном итоге, более полно представить картину обмена этих необычных полианионов.

Цель и задачи исследования

Целью работы являлось изучение структуры и содержания отдельных фракций полифосфатов в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisicte в зависимости от фазы роста, условий культивирования, а также мутаций по основным генам полифосфатного обмена.

Исходя из поставленной цели, необходимо было решить следующие задачи:

1) подобрать оптимальный метод экстракции фракций полиР из дрожжей, позволяющий осуществлять более полное и дробное извлечение их из’клеггок, и определить структуру фракций методом «'Р-ЯМР-спектроскопии:

2) определить содержание и структуру фракций полиР на разных фазах роста культуры дрожжей, а также в процессе фосфорного голодания и последующего сверхсинтеза полиР;

3) определить длину цепи и содержание полиР в вакуолях в обычных условиях роста дрожжей и в условиях сверхсинтеза полиР;

4) изучить влияние ингибиторов различных биохимических процессов на синтез фракций полиР;

5) изучить содержание отдельных фракций полиР у мутантов ' S. cerevisicie с инактивированными генами экзополифосфатазы РРХ1 и эндополифосфатазы PPN1.

Научная новизна работы. Установлено, что в процессе роста S. cerevisicie ВКМ Y-] 173 каждая фракция полиР характеризуется своей динамикой накопления и потребления. Сочетанием химической экстракции полиР из клеток и метода 3, Р-ЯМР впервые показано, что средняя длина цепи разных фракций не является константной величиной, а изменяется в процессе роста и в зависимости от условий культивирования дрожжей.

Впервые выявлен ступенчатый характер синтеза щелочерастворимых полифосфатов, когда после фосфорного голодания на первом этапе происходит накопление полифосфатов, а на следующем — только. увеличение длины их цепи.

Обнаружено, что полифосфаты вакуолей и щелочерастворимой фракции полиР4, в отличие от других фракций этих соединений, не подвержены сверхнакоплению, что свидетельствует о существовании различных механизмов регуляции синтеза полиР в клетках дрожжей.

Установлено, что ингибиторы биохимических процессов по-разному влияют на уровень накопления отдельных фракций полифосфатов, в частности, ЦГИ и FCCP полностью подавляют накопление фракции полиР4, а 2-дезоксиглюкоза — фракции полиРЗ.

С помощью мутантов с инактивированными генами, кодирующими экзополифосфатазу цитозоля РРХ1 и эндополифосфатазу вакуолей PPN1, впервые выявлена метаболическая связь между содержанием кислоторастворимой фракции полиР 1 и уровнем экзополифосфатазной активности цитозоля у дрожжей.

Совокупность полученных данных дает основания выдвинуть гипотезу о множественности путей биосинтеза отдельных фракций полифосфатов у дрожжей S. cerevisicie.

Научно-практическое значение. Данная работа является фундаментальным, исследованием. Полученные результаты систематизируют и расширяют представления о структуре и метаболизме фракций полиР у дрожжей, в частности в условиях фосфорного голодания и последующей их гиперкомпенсации, при воздействии ингибиторов, а также влияние на их уровень мутаций по основным генам полифосфатного обмена. Материалы работы могут быть использованы в лекциях и практических занятиях студентов по биохимии микроорганизмов.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 114 страницах, содержит 15 таблиц и 14 рисунков. Библиографический указатель включает 211 источников литературы.

ВЫВОДЫ.

Впервые сочетанием методов химической экстракции и 31Р-ЯМР-спектроскопии выделены и охарактеризованы отдельные фракции полиР, различающиеся изменением степени полимерности и динамикой накопления и потребления в процессе роста Saccharomyces cerevisiae.

Выявлен ступенчатый характер синтеза щелочерастворимых полифосфатов, характеризующийся тем, что на первом этапе после фосфатного голодания происходит накопление этих соединений, а на следующем — только увеличение длины их цепи.

Обнаружено, что полифосфаты вакуолей и щелочерастворимой фракции полиР4, в отличие от основной массы этих соединений клетки, не подвержены гиперкомпенсации, что указывает на существование различных механизмов регуляции синтеза полиР у дрожжей.

Установлено, что ингибиторы биохимических процессов по-разному влияют на накопление отдельных фракций полифосфатов, в частности, процесс синтеза фракции полиР4 является более чувствительным к действию протонофора FCCP и циклогексимида, а фракции полиРЗ — к действию 2-дезоксиглюкозы.

С помощью мутантов с инактивированными генами экзополифосфатазы цитозоля РРХ1 и эндополифосфатазы PPN1, впервые выявлена метаболическая связь между содержанием кислоторастворимой фракции. полиР! и уровнем экзополифосфатазной активности цитозоля у дрожжей.

Совокупность полученных данных дает основание выдвинуть гипотезу о множественности путей биосинтеза и регуляции отдельных фракций полифосфатов у дрожжей S. cerevisiae.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

На начальном этапе экспериментальной работы нами был проведен сравнительный анализ различных химических методов выделения фракций полиР из клеток дрожжей. Исследование содержания отдельных фракций было впервые проведено в сочетании с 3|Р-ЯМР-спектроскопическим определением длины их цепи. Такой подход позволил с одной стороны оценить количественный вклад каждой фракции в общий пул полиР, с другойопределить среднюю степень полимерности каждой из них. Метод выделения фракций полиР, предложенный Лангеном и Лиссом в модификации И. С. Кулаева и др.(1960), позволил по сравнению с другими, во-первых, более полно экстрагировать эти соединения из клеток и, во-вторых, разделить общий пул полиР дрожжевой клетки на большее число фракций, различающихся степенью полимерности. Благодаря этому в дальнейших исследованиях удалось обнаружить особенности в поведении отдельных фракций полиР в различных условиях культивирования дрожжей.

В данной работе нами было прослежено изменение содержания отдельных фракций полиР в процессе роста дрожжей S. cerevisiae, начиная с посевного материала (0 ч) и заканчивая глубоким стационаром (24 ч). Большая часть полифосфатного пула клеток сосредоточена в двух фракциях — полиР! и полиРЗ. Часть кислоторастворимой фракции полиР1, около 30%, расположена в вакуолях. В процессе роста дрожжей каждая фракция полиР характеризуется при наличии глюкозы в среде своей динамикой накопления, а в ее отсутствии — своей динамикой потребления. Последнее указывает на использование полиР клетками в качестве источника энергии. Обнаруженные изменения степени полимерности отдельных фракций на разных фазах роста дрожжей позволили выделить несколько особенностей в поведении фракций в процессе роста культуры. Во-первых, как утверждалось и ранее (Langen and Liss, 1959), каждая фракция имеет свою степень полимерности, которая возрастает от полиР 1 до полиР4. Во-вторых, было обнаружено, что в процессе роста дрожжей степень полимерности фракций не постоянна, причем для каждой из фракций отмечен свой характер изменения длины цепи. Наиболее высокополимерные фракции полиРЗ и полиР4 имеют более высокую степень полимерности в стационарной фазе. Длина цепи фракции полиР2 подвержена значительным колебаниям в процессе всего развития культуры, в то же время длина цепи субфракций полиР1−1 и полиР1−2 практически не изменяется. В-третьих, на некоторых фазах роста разные фракции полиР могут иметь одинаковые длины цепей (рис. 8, полиР2 и полиРЗ). Эти факты свидетельствуют или о неодинаковом их состоянии в клетке, или о различной их компартментации.

В условиях дефицита экзогенного фосфата в среде дрожжи активно используют все фракции полиР в качестве внутриклеточного резерва этого элемента (табл.10). При этом, за исключением полиР2, происходит снижение степени полимерности фракций полиР, что безусловно связано с деградацией этих соединений в процессе их активного потребления. Перенос клеток на свежую фосфат содержащую среду вызывает быстрый рост содержания полифосфатных фракций (гиперкомпенсация), но больше всего их накапливается во фракциях полиР 1, полиР2 и особенно полиРЗ (рис. 11, точка С). Исключение составляет локализованная в клеточной оболочке фракция полиР4, первоначальный уровень которой восстанавливается только к 4 ч культивирования на среде с фосфатом. Аналогичный эффект наблюдается и в вакуолях, полиР которых, как и полиР других компартментов клетки, в условиях фосфорного голодания быстро потребляются, но в условиях гиперкомпенсации в них не происходит сверхнакопление этих соединений. Этот факт позволяет предполагать, что в разных компартментах имеются различные пути метаболизма полиР и их регуляции.

Измерение длины цепи отдельных фракций полиР показало, что она зависит не только от способа фракционирования, как считалось ранее (Langen and Liss, 1959, Кулаев, 1975), но и от условий роста дрожжей. Интересно, что длина цепи фракций полиРЗ и полир4 в течение первых 2 ч интенсивного синтеза в условиях гиперкомпенсации находится практически на том же уровне, что и в условиях фосфорного голодания (рис. 12а, точка С) и увеличивается только при продолжении роста культуры на фосфатной среде (рис. 12а, точка D). Это предполагает существование ступенчатого характера синтеза высокомолекулярных фракций полиР. В этом случае в них в условиях гиперкомпенсации вначале образуется сверхвысокое количество полиР, и только в процессе дальнейшего роста культуры происходит увеличение длины цепи этих соединений при неизменном их количестве во фракции.

Анализ результатов по накоплению фракций полиР в процессе роста и в условиях их интенсивного потребления и гиперкомпенсации (рис. 6 и П) показывает, что полиР щелочерастворимой при рН 9−10 фракции (полиРЗ), в отличие от фракций полиР 1, полиР2 и полиР4, способны более интенсивно накапливаться и более интенсивно потребляться. В условиях гиперкомпенсации ее содержание в клетках достигает 40% суммы всех полиР клетки. Высокая мобильность данной фракции позволяет предполагать, что ее основная роль в дрожжевой клетке заключается в создании резерва фосфора и энергии.

Суммируя полученные нами данные о влиянии ингибиторов на накопление фракций полиР, следует отметить следующее. Использованные ингибиторы в разной степени действуют на накопление отдельных фракций полиР. Так, накопление фракции полиР4 полностью подавляется ЦГИ. Это подтверждает представление о том, что данная фракция имеет особый путь биосинтеза, связанный с синтезом маннопротеинов клеточной стенки (Шабалин и др., 1979; Kulaev and Vagabov, 1983; Kulaev et al., 1987; Вагабов, 1988). Возможно, она и функционально также связана с этой органеллой (Вагабов и др., 1990; Иванов и др., 1996). Отсутствие или слабое влияние ЦГИ на накопление других фракций полиР указывает на то, что индукция синтеза соответствующих ферментных систем происходит еще на этапе фосфорного голодания.

Полное торможение синтеза фракции полиР4 и снижение уровня накопления остальных фракций, за исключением полиР2, под воздействием FCCP показывает, что наличие электрохимического потенциала ДрН* на мембранах клеточных органелл является важным фактором для накопления каждой из них, хотя и в разной степени. Наиболее вероятной причиной такого эффекта может быть низкое содержание Pi у дрожжей (табл.13). Известно, что поступление Pj в клетку зависит от уровня градиента электрохимического потенциала ДцН+ на цитоплазматической мембране (Persson et al., 2003), понижающегося в данном случае в присутствии FCCP.

Ингибирование Н'-АТРазы вакуолей бафиломицином А1, хотя и в значительно меньшей степени, чем FCCP, также приводит к уменьшению накопления фракций полиР, за исключением полиР 1, что подтверждает важное значение для биосинтеза полиР существования A|iH+ на мембранах.

2-Дезоксиглюкоза, снижая почти в 2 раза накопление общей суммы клеточных полиР, в разной степени тормозит синтез отдельных фракций и полностью подавляет накопление только фракции полиРЗ. Это свидетельствует о тесной связи их синтеза с углеводным обменом, а для полиРЗ — полной от него зависимости (Кулаев, 1975). Различное влияние ингибиторов на накопление отдельных фракций полиР подтверждает множественность путей биосинтеза полиР.

Использование ингибиторов позволило разграничить два процесса, протекающих в клетках после пересева дрожжей с фосфат-дефицитной на полноценную среду — накопление полиР и синтез de novo высокомолекулярной экзополифосфатазы (II) цитозоля (табл. 13). Так, ЦГИ, блокирующий синтез этого фермента, почти не влияет на содержании полиР, 2-дезоксиглюкоза, подавляющая практически в 2 раза накопление полиР, всего на 20% снижает биосинтез экзополифосфатазы, a FCCP, не снижающий уровень активности фермента, на 30% тормозит накопление полиР. Следовательно, экзополифосфатаза (И) цитозоля, по-видимому, не имеет отношения к синтезу полиР. Для выяснения роли этих ферментов потребовались дополнительные исследования.

При фосфорном голодании дрожжей вакуолярная экзополифосфатаза экзополифосфатазы сферопластов вели себя по-разному. В вакуолях происходило более чем четырех кратное увеличение активности фермента, которая после культивирования дрожжей в условиях гиперкомпенсации полиР, снижалась примерно в 7 раз, в то время как в сферопластах в этих условиях наблюдалось незначительное изменение активности. Т. е. в вакуолях регуляция синтеза фермента осуществляется экзогенным Р-, как это наблюдается у бактерий (Harold, 1964; Несмеянова и др., 1974) и отличается от таковой в сферопластах. Это позволяет считать, что в условиях фосфорного голодания полиР вакуолей используются для поддержания жизнедеятельности клетки именно при участии экзополифосфатазы. В то же время механизм мобилизации клеткой полиР, находящихся в других органеллах, в этих условиях роста, по-видимому, иной.

Изучение накопления фракций полиР у мутантов, имеющих инактивированные гены цитозольной экзополифосфатазы I и вакуолярной эндополифосфатазы, позволило уточнить связь между обменом отдельных фракций полиР и названными ферментами.

Наши исследования отдельных фракций у данных штаммов показали, что на изменения ферментного состава у мутантов реагирует наиболее представительная у данного штамма дрожжей кислоторастворимая фракция полиР1 (рис.15). Поскольку экзополифосфатаза Iцитозольный фермент, а эндополифосфатаза — вакуолярный, повышение уровня фракции полиР! у мутанта CRX на 40%, а у мутантов CRN и CNX более, чем в 2 раза по сравнению с родительским штаммом, подтверждает, что данная фракция имеет множественную клеточную локализацию. Часть ее находится в цитоплазме, а часть — в вакуолях. Это, в свою очередь, согласуется с полученными нами данными о содержании в вакуолях дрожжей S. cerevisiae штамм ВКМ Y-1173 до 30% кислоторастворимой фракции клеток.

В то же время у двойного мутанта CNX увеличивается не только фракция полиР 1, но и щелочерастворимая фракция полиРЗ. Видимо, только одновременное отсутствие полифосфатаз цитозоля и вакуолей приводит к торможению потребление клеткой полиР этой фракции. Практически одинаковый уровень солерастворимой фракции полиР2 у всех штаммов демонстрирует отсутствие функциональной связи вакуолярной эндополифосфатазы и цитоплазматических экзополифосфатаз I и II с данной фракцией полиР и говорит в пользу возможной локализации последней в ядре (Кулаев и др., 1970; Kulaev et al., 2004).

Полученные в работе данные четко показывают, что исследованные фракции полиР имеют разную компартментацию, как и предполагалось ранее (Kulaev and Vagabov, 1983), и разные пути метаболизма, и, следовательно, они могут выполнять специфические функции, связанные с особенностями конкретного компартмента.

В нашем исследовании использовано понятие «накопление», которое отражает сумму полифосфатов в клетке, получаемую в результате двух противоположных процессовсинтеза и потребления данных полимеров. Однако, использование методического приема, приводящего к интенсивному синтезу полиР после переноса клеток из среды без фосфата в фосфат содержащую среду и дополненного ингибиторным анализом, позволяет с большей определенностью судить о процессах синтеза этих соединений.

Представленные результаты, свидетельствующие о различной динамике накопления отдельных фракций полиР и изменяющейся при этом степени их полимерности как в процессе роста дрожжей, так и в условиях гиперкомпенсации полиР, а также различное влияние ингибиторов на накопление отдельных фракций полиР, дают основание выдвинуть гипотезу о множественности путей биосинтеза этих полимеров.

У дрожжей к настоящему времени достоверно показан путь синтеза полиР, сопряженный с синтезом важнейшего компонента клеточной стенки — маннопротеина (Kulaev et al., 1987; Kulaev et al., 2004). У некоторых грибов и ряда других микроорганизмов обнаружен путь синтеза полиР с участием 1,3 дифосфоглицерата (Кулаев и Бобык, 1971; Kulaev et al., 2004). Однако, такой путь синтеза пока не выявлен у дрожжей. Широко распространенный у бактерий синтез полиР за счет терминального фосфата АТФ при участии полифосфаткиназы, у дрожжей до настоящего времени не доказан. Незначительная активность фермента (Felter and Stahl, 1973) обнаружена только в вакуолях, при этом на порядок более активно протекала обратная реакция образования АТФ из полиР (Шабалин и др, 1977; Kulaev et al., 2004). Поэтому вопрос о путях синтеза полиР у дрожжей до сих пор остается одной из важнейших проблем биохимии полиР.

Показать весь текст

Список литературы

  1. Н.А., Личко Л. П., Кулаковская Т. В., Окороков Л. А. (1993). Характеристика полифосфатазной активности вакуолей дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Биохимия, 58, 1053−1 Об 1.
  2. Н.А., Кулаковская Т. В., Кулаев И. С. (1994). Характеристика полифосфатазной активности цитозоля дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Биохимия, 59, 1882−1892.
  3. Н.А., Кулаковская Т. В., Кулаев И. С. (1996). Очистка и характеристика полифосфатазы из цитозоля S. cerevisiae. Биохимия, 61, 1714−1724.
  4. Н. А., Кулаковская Т. В., Кулаев И. С. (2001). Две экзополифосфатазы цитозоля дрожжей S. cerevisiae: сравнительная характеристика. Биохимия, 66, 187 194.
  5. Н.А., Кулаковская Т. В., Кулаев И. С. (2004). Очистка и свойства экзополифосфатазы цитозоля Saccharomyces cerevisiae, не кодируемой геном PPXI. Биохимия, 69, 480−487.
  6. И.П., Ключарев Л. А. (1975). Ингибиторы синтеза белка. «Медицина», М., с. 206.
  7. М.А., Кулаев И. С. (1971). Обнаружение у Neurospora crassa нового фермента 1,3-дифосфоглицерат:полифосфатфосфотрансферазы. Биохимия, 36, 426−429.
  8. В.М., Циоменко А. Б., Шабалин Ю. А. (1973). Изучение взаимосвязи метаболизма полифосфатов и маннана у дрожжей. ОНТИ НЦБИ, Пущино, 144 155.
  9. В.М. (1988). Биосинтез углеводных компонентов клеточной стенки дрожжей. ОНТИ НЦБ, Пущино, с. 197.
  10. В.М., Чемоданова О. В., Кулаев И. С. (1990). Влияние неорганических полифосфатов на величину отрицательного заряда клеточной оболочки дрожжей. Докл. АН СССР, 313, 989−992.
  11. Ван Везер (1962) Фосфор и его соединения. М., ИЛ, с. 416
  12. С.В., Беккер З. Е. (1962). Природа волютиновых гранул у Penicillium chrysogemm. Цитология, 4, 691−695.
  13. М.С., Чернышева Е. К., Кулаев И. С. (1970). О корреляции накопления некоторых фракций неорганических полифосфатов и РНК у Neurospora crassa Ad 28−610. Докл. АН СССР, 192, 1166−1169.
  14. М.С., Чернышева Е. К., Кулаев И. С. (1972). Изучение полифосфат деполимеразной активности в клетках гриба Neurospora crassa. Биохимия, 37, 983 995.
  15. И.С., Белозерский А. Н., Крицкий М. С., Кокурина Н. А. (1960а). О полифосфатах плодовых тел шампиньонов и строчков. Докл. АН СССР, 130, 667 670.
  16. И.С., Крицкий М. С., Белозерский А. Н. (19 606). Обмен полифосфатов и некоторых других фосфорных соединений в процессе развития плодовых тел шампиньонов Agaricus bisporus L Биохимия, 25, 735−748.
  17. И.С., Белозерский A.BL (19 626). Конденсированные неорганические фосфаты в обмене веществ живых организмов. Изв. АН СССР, 3, 502−521
  18. И.С. и Вагабов В.М. (1967). Влияние условий выращивания на обмен неорганических полифосфатов и некоторых других фосфорных соединений у Scenedesmus obliquus. Биохимия, 32,253−260.
  19. И.С., Крашенинников И.А, Поляков В. Ю. (1970). Фосфорные соединения препаратов клеточных ядер Neurospora crassa. В сб. «Клеточное ядро и его ультраструктуры». Изд-во «Наука», М., с. 310−315.
  20. И.С., Коношенко Г. И. (1971). О локализации 1,3- дифосфоглицерат: полифосфатфосфотрансферазы в клетках Neurospora crassa. Докл. АН СССР, 200, 10−12.
  21. И.С., Вагабов В. М., Цноменко А. Б. (1972а). О корреляции накопления полисахаридов клеточной стенки и некоторых фракций высокомолекулярных полифосфатов у дрожжей. Докл. АН СССР, 204, 734−736.
  22. И.С., Коношенко Г. И., Чернышева Е. К., Крицкий М. С. (19 726). Локализация и возможная роль полифосфат деполимеразы в клектах Neurospora crassa. Докл. АН СССР, 206, 233−235.
  23. И.С., Крашенинников И. А., Тырснн Ю. А. (1973). Нуклеиновые кислоты, высокополимерные фосфаты и некоторые ферменты полифосфатного обмена в синхронизированной культуре Schizosaccharomyces pomhe. Микробиология, 42, 613−622.
  24. И.С., Рожанец В. В., Кобылянский А. Г., Филиппович Ю. Б. (1974). Обнаружение пирофосфата и других полифосфатов у некоторых насекомых. Жури. Эаол. биохим. фюиол., 10, 147−152.
  25. И.С. (1975). Биохимия неорганических полифосфатов. Москва. Изд. МГУ.
  26. И.С. (1995). Эволюционные аспекты биохимии неорганических полифосфатов. Молекулярная биология, 29, 1210−1217.
  27. И.С., Т.В. Куликовская, Н. А. Андреева, JI.П. Личко (1997). Эволюция функций неорганических полифосфатов на разных этапах филогенетического развития живых существ. Ж.Эвол.биохим.фюиол., 33, 74−82.
  28. А. И Отаке X (2000). Молекулярный анализ накопления полифосфатов у бактерий. Биохимия., 65, 362−367.
  29. Т.П., Гершкович В. Г., Лозинов А. Б. (1969). Некоторые особенности фосфорного метаболизма у дрожжей Candida при росте на «-алканах. Микробная. Спит., 7, 22−27.
  30. Л.П. (1981). Компартментация неорганических ионов и регуляция их уровня в цитоплазме эукариотических микроорганизмов. Канд. Дисс., Пущино.
  31. Л.П. (1994). Биоэнергетика вакуолярной мембраны дрожжей. ОНТИ НЦБИ, Пущино.
  32. Л.П., Кулаковская Т. В., Кулаев И. С. (1996). Характеристика ядерной полифосфатазной активности в Saccharomyces cerevisiae. Биохимия, 61, 361−366.
  33. Л. П., Кулаковская Т. В., Кулаев И. С. (2000). Очистка и характеристика растворимой полифосфатазы из митохондрий Saccharomyces cerevisiae. Биохимия, 65, 421−427.
  34. Л. П., Пестов Н. А., Кулаковская Т. В., Кулаев И. С. (2003). Инактивация гена, кодирующего экзополифосфатазу РРХ1, приводит к изменению спектра экзополифосфатаз цитозоля и митохондрий дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Биохимия, 68, 902−910.
  35. Л.П., Кулаковская Т. В., Кулаев И. С. (2004). Частичная очистка и характеристика экзополифосфатазы ядер штамма Saccharomyces cerevisiae с инактивированным геном PPXI, кодирующим основную экзополифосфатазу дрожжей. Биохимия, 69, 338−343.
  36. М.А., Дмитриев А. Д., Кулаев И. С. (1973). Высокомолекулярные полифосфаты и ферменты полифосфатного обмена в процессе роста культуры Escherichia coli. Микробиология, 42, 213−219.
  37. М.А., Дмитриев А. Д., Кулаев И. С. (1974). Регуляция экзогенным ортофосфатом ферментов фосфорного обмена и уровня полифосфатов у Escherichia coli К-12. Микробиология, 43, 227−234.
  38. М.А., Гонима С. А., Кулаев И. С. (1975а). Биосинтез полифосфатаз Escherichia coli под контролем общих с щелочной фосфатазой регуляторных генов. Докл. АН СССР, 224, 710−712.
  39. М.А., Мараева О. В., Северин А. И. и Кулаев И.С. (19 756). Локализация полифосфатазы в клетках Escherichia coli с репрессированным и дерепрессированным биосинтезом этого фермента. Докл.Акад.Наук СССР, 223, 1266−1268.
  40. Д.Н., Сепетов Н. Ф., Решетняк В. И., Сибельдииа JI.A. (1980). Изучение локализации полифосфатов в клетках микроорганизмов с помощью 31Р ЯМР с разрешением 78 Мгц. Биохимия, 45, 517−525.
  41. Н. А., Т. В. Кулаковская, И. С. Кулаев (2003). Полифосфаты и экзополифосфатазы митохондрий дрожжей Saccharomyces cerevisiae в условиях гиперкомпенсации по фосфату. Докл. Академии Наук, 389, 830−832.
  42. Рош Р. (2000). Транспорт ионов через мембрану посредством полифосфат- поли-(Р)-гидроксибутиратных комплексов. Биохимия, 65, 335−353.
  43. К.Г., Рубцов П. М., Вертелецкая HJL, Кулаев (1973). Обнаружение высокомолекулярных полифосфатов в ядрах гриба Ertdomyces magnusii. Докл. высш.школы.биол. пауки, 10, 84−89.
  44. JI.B., Вагабов В. М., Кулаев И. С. (1982). Изучение свойств полифосфатфосфогидролазы „leaky“ мутанта Neurospora crassa по данному ферменту. Биохимия, 47, 1963−1969.
  45. JI.B., Ильинская О. Н., Вагабов В. М., Кулаев И. С. (1985). Полифосфаты и полифосфатфосфогидролаза у мицелиальных штаммов и slime-вариантов Neurospora crassa. Биохимия, 50, 1120−1126.
  46. А.М., Стебляк А. Г., Умнова Н. С., Мансурова С. Э. и Кулаев И.С. (1975). О возможной физиологической роли системы „высокомолекулярные полифосфаты полифосфатфосфогидролаза“ у Neurospora crassa. Микробиология, 44, 414−421.
  47. А.Б. (1978). Исследование взаимосвязи обмена компонентов дрожжевой клеточной оболочки. Канд. Дисс., Пущино.
  48. Е.К., Крицкий М. С., Кулаев И. С. (1971). Определение степени полимеризации различных фракций неорганических полифосфатов из мицелия Neurospora crassa. Биохимия, 36, 138−142.
  49. Ю.А., Вагабов В. М., Циоменко А. Б., Землянухина О. А., Кулаев И.С.1977). Изучение полифосфаткиназной активности в вакуолях дрожжей. Биохимия, 42, 1642−1648.
  50. Ю.А., Вагабов В. М., Кулаев И. С. (1979). О механизме сопряжения биосинтеза высокомолекулярных полифосфатов и маннана у дрожжей Saccharomyces carlsbergensis. Докл. АН СССР, 249, 243−246.
  51. Ю.А. (1979).Изучение биосинтеза высокомолекулярных полифосфатов, сопряженного с биосинтезом маннана, у дрожжей Saccharomyces carlsbergensis. Канд.Дисс., Пущино.
  52. Ю.А., Наумов А. В., Вагабов В. М., Кулаев И. С. (1984). Обнаружение активности нового фермента долихилдифосфат: полифосфатфосфотрансферазы у дрожжей. Докл. АН СССР, 278,482−485.
  53. Ю.А., Кулаев И. С. (1989). Солюбилизация и свойства долихилдифосфат: полифосфатфосфотрансферазы дрожжей. Биохимия, 54, 68−75.
  54. , М., Е. Crooke, and A. Kornberg (1993). An exopolyphosphatase of Escherichia coli. The enzyme and its ppx gene in a polyphosphate operon. J. Biol. Chem., 268, 633−639.
  55. Andreeva, N. A., and L. A. Okorokov. (1993). Purification and characterization of highly active and stable polyphosphatase from Saccharomyces cerevisiae cell envelope. Yeast, 9, 127−139.
  56. , N. А., Т. V. Kulakovskaya, A. V. Karpov, I. A. Sidorov, and I. S. Kulaev .1998a). Purification and properties of polyphosphatase from Saccharomyces cerevisiae cytosol. Feast, 14, 383−390.
  57. , N. А., Т. V. Kulakovskaya, and I. S. Kulaev (1998b). Purification and properties of exopolyphosphatase isolated from Saccharomyces cerevisiae vacuoles. FEBS Lett., 429, 194−196.
  58. Ault-Rich6, D., and A. Kornberg. (1999). Definitive enzymatic assays in polyphosphate analysis. In H. C. Schroder and W. E. G. Miiller, eds. Inorganic Polyphosphates. Biochemistry, Biology, Biotechnology, Springer, ProgMol. Cell. Biol., 23,241−253.
  59. Beauvoit, В., M. Rigonlet, В. Guerin, and P. Canioni. (1989). Polyphosphates as a source of high energy phosphates in yeast mitochondria: a P-NMR study. FEBS Lett., 252, 17−22
  60. P., Kratky Z., Kovarik J., Bauer S. (1971). Effect of 2-deoxyglucose on cell wall formation in Saccharomyces cerevisiae and its relation to cell growth inhibition. J.Bacteriol., 107, 121−129.
  61. P., Kovarik Z., Bauer S. (1973). Lisis of Saccharomyces cerevisiae with 2-deoxy-2-fluoro-d-glucose, an inhibition of the cell wall glucan synthesis. J. Bacteriol., 115, 1108−1120.
  62. Booth, J.W., and G. Guidotti (1995). An alleged yeast polyphosphate kinase is actually diadenosine-5', 5"'-P1,P4-tetraphosphate a, P-phosphorylase. J. Biol. Chem270, 1 937 719 382.
  63. Bostian, K. A., J. M. Lemize, and H. OJHalvorson. (1983). Physiological control of repressible acid phosphatase gene transcripts in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol, 3, 839−853.
  64. Bowman E.J., Siebers A., and Altendorf K* (1988). Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells and plant cells. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 85, 7972−7976/
  65. Bun-ya, M., Nishimura, M., Narashima, S., and Oshima, Y. (1991). The PH084 gene of Saccharomyces cerevisiae encodes an inorganic phosphate transporter. Mol. Cell. Biol., 11, 3229−3238.
  66. , С. Т., Т. Glonek, and M. Barany (1977). Analysis of living tissues by phosphorus-31 magnetic resonance. Science, 195, 145−149.
  67. Cassone A., Carpinelli G., Angiolella L., MaddalunoG., Podo F. (1983). 31P nuclear magnetic resonance study of growth and dimorphic transition in Candida albicans. J Gen.Microbiol., 129, 1569−1575.
  68. Castro, С. D» A. P. Koretsky, and M. M. Domach (1999). NMR-Observed phosphate trafficking and polyphosphate dynamics in wild-type and vphl-1 mutant Saccharomyces cerevisae in response to stresses. Biotechnol. Prog,. 15, 65−73.
  69. Clark, J.E., H. Beegen, and H. G. Wood (1986). Isolation of intact chains of polyphosphate from Propionibacterium shermanii grown on glucose or lactate. J. Bacteriol., 168, 1212−1219.
  70. Clark, J. E., and H. G. Wood (1987). Preparation of standarts and detrmination of sizes of long-chain polyphosphates by gel electrophoresis. Anal. Biochem., 161, 280−290.
  71. Cramer, C. L., L. E. Vaught, and R. H. Davis (1980). Basic amino acids and inorganic polyphosphates in Neurospora crassa vacuoles: independent regulation of vacuolar pools. J. Bacteriol,. 142, 945−952.
  72. Dassa, E., and P. L. Boquet (1981). Is the acid phosphatase of Escherichia coli with pH optimum 2,5 a polyphoposhate depolymerase? FEBSLett., 135, 148−150.
  73. Den Hollander, J., A., K. Ugurbil, T. R. Brown, and R. G. Shulman (1981). Phosphorus-31 nuclear magnetic resonance studies on the effect of oxygen upon glycolysis in yeast. Biochemistry, 20, 5871−5880.
  74. , G. (1964). Recherches sur les phosphates condenses chez les microorganismes. Etude de leur nature et de quelques enzymes intervenants dans leur utilisation metabolique. These Doct. Sci. Phys., Strasbourg.
  75. Dubois M., Gilles R.A., Hamilton J, K., Rebers P.A., Smith F. (1956). Colorimetric method for determination of sugars and related substrates. AnaLChem., 28, .350−356.
  76. , Т., К. Gable, and T. Beeler (1994). Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles. J. Biol. Chem., 269, 7273−7278.
  77. Durr M., K. Urech, T. Boiler, A. Wiemken, J. Schwencke, and M. Nagy (1979) Sequestration of arginine by polyphosphate in vacuoles of yeast Saccharomyces cerevisiae. Arch. Microbiol., 121, 169−175.
  78. , J. P. (1952a). Recherches sur les polyphosphates contenus dans diverses cellules vivantes. II. Etude chromatographique et potentiometrique des polyphosphates de levure. Bull. Soc. Chim. Biol., 34, 330−335.84.
Заполнить форму текущей работой

Сессия? Спокойно!