Исследование влияния антропогенного загрязнения нерестовых водоемов на постэмбриональное развитие трех видов бесхвостых амфибий

Мегаполисы как крайне урбанизированные системы формируют сложные комплексы различных факторов отрицательно влияющих как на биоценозы в целом, так и на популяции видов, составляющих эти биоценозы. По-видимому, именно мегаполисам принадлежит наиболее сложный комплекс шумовых, световых, тепловых и химических загрязнений. Разрастаясь, мегаполисы захватывают новые территории, оказывая необратимое воздействие на популяции животных и растений, оказавшихся в черте мегаполиса.

Химическое загрязнение мегаполисов включает бытовые отходы, отходы различных промышленных предприятий, нефтепродукты, химические реагенты, как например, антигололедные. И если органические поллютанты со временем разлагаются, то большинство неорганических, как например сплавы разных металлов, подвергаются коррозии, но надолго остаются в почве. О степени загрязнения и его вредности для людей, чаще всего судят оценивая Предельно Допустимые Концентрации (ПДК) тех или иных веществ. Вредность веществ определяют по тому, во сколько раз концентрация вещества превышает ПДК (см. обзор литературы). Однако, на людей, животных и на растения, обитающих на территории мегаполисов, оказывает воздействие не отдельные поллютанты, а их комплексы.

Химические и физические методы оценки состава и уровня загрязнения — аналитические. Они направлены на определение концентрации отдельных поллютантов и не дают оценки комплекса загрязнителей. Вредность тех или иных поллютантов оценивают методами биотестирования. Различия в методиках основаны как на выборе тест-системы (того или иного организма, той или иной стадии онтогенеза), так и стадии онтогенеза и/или физиологического состояния. Сложность интерпретации этих данных заключается в том, что в природе, в отличие от эксперимента, на организм действует не тот или иной отдельный поллютант, а сложная смесь органических и неорганических веществ. Однако, для того, чтобы выяснить, как действуют комплексы поллютантов необходимо сначала разобраться в том, как действуют отдельные компоненты этих комплексов.

Выше сказано, что реакция разных компонентов тест-объектов, т. е. представителей разных видов животных зависит от их видовой принадлежности, стадии онтогенеза и физиологического состояния. Зависит она и от экологических особенностей того или иного вида. В этом отношении удобным и перспективным объектом являются бесхвостые амфибии. Жизненный цикл этих животных включает две экологически своеобразные фазы. Эмбриональное и личиночное развитие проходят в воде, после метаморфоза взрослые особи живут на суше, возвращаясь в воду только для размножения и зимовки.

Объекты данного исследования: травяная лягушка, остромордая лягушка и серая жаба не являются синантропными видами. На территории города Москвы и других крупных городов они оказываются 5 по мере того, как разрастаются города и их пригороды, ранее заселенные этим видами (Банников, 1967; Шарыгин, Ушаков, 1979). Популяции бесхвостых амфибий сохраняются на урбанизированных территориях, пока сохраняются водоемы, в которых происходит размножение и есть места, где взрослые особи могут кормиться и зимовать. Обычно, биотопами в которых сохраняются амфибии, являются либо облесенные, либо луговые и кустарниковые пустыри с мелкими прудами и лужами, поймы мелких речек. Подобные биотопы быстро захламляются металлоломом, пластиковыми емкостями, нефтепродуктами и т. п. Поллютанты приводят к увеличению смертности и тератогенезу на эмбриональных и личиночных стадиях. Поэтому амфибии, при сравнении их онтогенеза, проходящего на урбанизированных и не урбанизированных территориях, служат хорошим тестом на весь комплекс загрязнений.

Каждому поллютанту свойственно специфическое действие на организм, а каждый организм сопротивляется токсикозу в силу своих физиологических и онтогенетических возможностей. Поэтому, прежде чем изучать механизм действия комплексов поллютантов целесообразно выяснить действие каждого из них в отдельности. Выяснить пути проникновения токсического поллютанта в организм, его органы и ткани, в которых они накапливается. Изучить влияние на жизнеспособность и развитие тест объекта.

В экспериментальной части данной работы в качестве поллютантов были выбраны тяжелые металлы: железо и свинец. Оба металла являются типичными для урбанизированных территорий, б способны накапливаться в донных отложениях водоемов и частично, в виде окислов, способны растворяться в воде. Поэтому возможны два пути проникновения этих поллютантов в организм: диффузией через покровы и алиментарным путем. В качестве тест объектов были взяты головастики двух видов бурых лягушек и одного вида жаб на стадиях, когда они свободно перемещаются по водоему и активно питаются. Эти стадии представляют собой этап онтогенеза перехода к активному питанию, формированию новых экологических взаимоотношений с окружающей средой и тем самым увеличение возможностей контактов с поллютантами, по сравнению с предыдущим этапом развития.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Антропогенное загрязнение Земли и методы его оценки.

Более половины территории Земли кардинально преобразованы человеком, что привело к разрушению функциональных связей в экосистемах, сокращению разнообразия видов живой природы, изменению качества генофонда и возрастанию скорости исчезновения видов (Макаеева и др., 2011). Прежде всего, антропогенное влияние выражается в химическом воздействии на окружающую природную среду различными солями металлов, нефтепродуктами, пестицидами, гербицидами, инсектицидами и другими химическими веществами (Сурков и др., 2004). Загрязняющие вещества могут распространяться через водные системы в отдаленные, относительно ненарушенные области, где даже низкие уровни концентрации поллютантов могут быть вредны для биоты. К физическим загрязнителям относят тепловое загрязнение вплоть до глобального потепления климата, а так же разнообразные световые и шумовые загрязнения.

Многообразие антропогенных воздействий обусловило многообразие подходов к классификации загрязнений. По силе воздействия на экосистемы выделяют: чрезвычайно опасные, высоко опасные, умеренно опасные и малоопасные (Ходяков и др., 2004). Химические вещества с точки их происхождения могут быть подразделены на: 1. Металлы и металлоиды — элементы, существующие в природе, оказывающие токсичное действие на живые организмы. 2. Стойкие органические соединения, синтезированные человеком или являющиеся побочным продуктам тех или иных технологических процессов с природными веществами. К этой группе относятся гербициды, инсектициды и другие вещества. 3. Природные токсины, которые являются часто вторичными эффектами влияния человеческой деятельности на природные объекты, например токсины сине-зеленых водорослей при загрязнении водоемов (Моисеенко, 2009). По продолжительности действия поллютанты делят на не разлагающиеся или очень медленно разлагающиеся в природной среде вещества, в том числе ионы металлов, минеральные соли и углеводороды нефти. 2. Водорастворимые вещества, не вовлекаемые в биологический круговорот, в том числе токсичные. 3. Легкоусвояемые органические соединения (биогенные вещества) (Николайкин и др., 2009).

Вредоносность поллютантов оценивают с применением разных критериев. Наиболее распространенной является Система ПДК (Предельно Допустимая Концентрация). Загрязнение водного объекта оценивается на основе установления кратности превышения измеренных концентраций отдельных элементов и веществ, к их ПДК или числа случаев с превышением ПДК. Эта система устанавливаются на основе экспериментальных работ с тест-организмами. ПДК достаточно условны и существенно различаются в различных странах, несмотря на унифицированные методы по их установлению. Кроме того, данная система не учитывает природных условий водного объекта, в водах которого действуют загрязняющие вещества. Известно, что токсичные свойства элементов зависят не только от их концентрации в воде, но от форм их нахождения, содержания кальция в воде, гуминовых кислот, рН, температуры и комбинаций с другими металлами. ПДК не учитывают взаимодействия между элементами при комплексном загрязнении вод, в условиях которого токсичные свойства ряда элементов могут взаимно усиливаться или нивелироваться. Например, предельно допустимая концентрация для некоторых загрязняющих веществ рыбо-хозяйственного назначения составляет: Железо (Fe3+) 0.5 мг/лМедь (Си2+) 0.001 мг/лЦинк (Zn2+) 0.01 мг/лХром (Сг2+) 0.5 мг/лХром (Сг6+) 0.001 мг/лНикель (Ni2+) 0.01 мг/лКобальт (Со2+) 0.01 мг/лСвинец (РЬ2+) 0.03 мг/лМышьяк (As3+) 0.055 мг/лРтуть (Hg2+) 0.0005 мг/лКадмий (Cd2+) 0.005 мг/лМарганец (Мп24) 0.01 мг/лМагний (катион) (Mg2+) 40 мг/л. (Мелехова, Сарапульцева, 2008).

Близкий к предыдущему метод Биотестирования основан на оценке потенциальной опасности поступающих в водоем загрязняющих веществ на живые организмы в лабораторных условиях. В качестве биотестов используются такие организмы как бактерии, водоросли, беспозвоночные (насекомые, моллюски) и позвоночные (рыбы, амфибии, мыши) (Lanza Espino et al., 2000). Примером использования методов биотестирования могут быть многочисленные работы по системе FETAX — Frog Embryo Teratogenesis Asay — Xenopus (Dawson et al., 1985; FETAX, 1991). Примером российской методики биотестирования могут быть работы О. П. Мелеховой и Е. И.

Сарапульцевой (2008), основанные на экспериментальном воздействии различных поллютантов на критические периоды в развитии бесхвостых амфибий. В ходе эксперимента проводилась оценка смертности и до возникающих уродств, как показатели токсичности воздействия.

К достоинствам биотестирования можно отнести сравнительно быстрое получение информации о токсичности отдельных веществ или сточных вод в целом. Информация, полученная на основе биотестирования и отраженная в нормативах ПДК, позволяет определить относительный вклад различных веществ в формирование экотоксикологической ситуации в водоеме. Однако не ясно, насколько правомерен перенос полученных результатов экспериментов в лабораторных условиях на природные объекты. Поведение загрязняющих веществ в природных водоемах и их токсикологические свойства могут значительно отличаться от их действия в аквариумахмогут проявляться комбинирование как синергетические, так и антагонистические эффекты. В лабораторных условиях сложно определить поступление ядов по пищевым цепям и их кумулятивные эффекты. К тому же отдельные организмы, используемые в эксперименте, имеют мало общего с природными популяциями и сообществами.

Биоиндикация — оценка качества вод природных водоемов по состоянию индикаторных видов или сообществ организмов (Кренева, 1984; Абакумов, Свирская, 1985; Love, 1980). Каждая группа организмов как биологический индикатор имеет свой преимущества и недостатки, которые определяют границы ее использования при решении тех или иных задач. Наиболее существенным системным показателем изменения состояния пресноводных экосистем под воздействием антропогенных факторов является изменение структурно-функциональной организации сообществ. В соответствии с состоянием водных сообществ Моисеенко (2009) дает следующая градация оценки, качества вод соответственно: чистая, слабо загрязненная, умеренно загрязненная и грязная. Однако, индексы и показатели, зависит от однородности биотопа и сезона года. К тому же популяции различных видов различаются по степени своей полифункциональности. На практике чаще всего используют в качестве биоиндикаторов икру амфибий или рыб. Достаточно простой подсчет аномальных или погибших эмбрионов позволяет определить степень благоприятности данного водоема и в частности оценить степень его загрязнения (Мелехова, 2005). Однако, как показывает практика оценить характер загрязнения и, тем более его специфичность, не представляется возможным (Северцова, 2002).

Частично эту проблему пытается решить Экотоксикологическая диагностика, основывающаяся на комплексном мониторинге характера загрязнения водоемов. При этом подход может быть как локальным (Lanza Espino и др. 2000; Моисеенко 2009), так и глобальным, когда в задачу мониторинга включено получение информации об изменениях биологических, геохимических и геофизических параметров природной среды (Ковда, Керженцев, 1983).

Присутствие загрязнителей в водоемах.

Наиболее часто в качестве загрязнителей водоемов рассматривают пестициды, инсектициды и тяжелые металлы. Эти поллютанты могут иметь долговременные последствия. Органические вещества способны накапливаться в водоемах в результате антропогенного влияния, в основном сельского хозяйства, промышленности и автомобильного транспорта. Так же сильно влияют такие воздействия, как сведение лесов, распашка, и мелиорация (Росолимо 1977, Драбкова, Стравихнская 1989; Федоров, Яблоков, 1999).

В случае металлов, только за счет жизнедеятельности человека каждый год в озера попадает около 119 000 тонн свинца, 31 925 000 тонн железа, 2 903 000 тонн марганца, 693 000 тонн цинка, 229 000 т. меда, 161 000 т. никеля, 92 000 т. молибденна, 63 000 т. хром, 43 000 т. кадмии, 22 200 т. сурьмы и 3900 т. серебра (Моисеенко, 2009). Иногда, тяжелые металлы взаимодействуют. Например, цинк и медь более чем в десять раз токсичнее синергично, нежели по отдельности (Alexander et al., 1992). Отравление тяжелыми металлами может наблюдаться не только в непосредственном очаге загрязнения, но и посредством пищевых цепей (Одум, 1986), как это наблюдалось при отравлении ртутью в 1950 г. около залива Минамата в Японии (Moran и др. 1986). Длительный мониторинг показал, что микроорганизмы в воде преобразовали хлорид ртути, сброшенной в залив одной химической фирмой, на еще более токсичнее вещество, — метил ртуть, что это сильно повлияло на более высокие трофические уровни, в частности на птиц, поедавших рыбу и моллюсков. Птицы падали в полете, двигались рывками, у них наблюдалась дрожь, нарушения зрения, онемение. М. Е. Sanchez и G. Garcia (1994) сообщают, что в водоемах района «La laguna» штатов Коагуила и Дуранго в Мексике, есть отмечены высокие концентрации мышьяка (As), свинца (РЬ) и цинка (Zn). Этот район имеет площадь 54,967 км, что показывает, что площадь загрязнения может иметь колоссальные размеры. В России отработанные автомобильные аккумуляторы приносят ежегодно в окружающую среду 180−200 тыс. тонн свинца (Государственный доклад., 1998). Радиус влияния автотранспорта на окружающую среду, при использовании этилированного бензина составляет 150−200 метров от магистрали (Природно-ресурсные ведомости, 2000).

Загрязнение Волжского бассейна из-за его географический положения в экономически развитом регионе России осуществляется в огромных масштабах. Среди веществ неорганической природы выявлен высокий уровень загрязнения вод ванадии (V), медь (Си) и марганец (Мп). Исследования состояния рыб выявили морфофункциональные нарушения и патологические изменения органов и тканей у рыб, свидетельствующие об интоксикации их организма (Моисеенко, 2009). Уровень загрязнения волжской воды превышает ПДК по железу в 6 раз, меди — в 5, цинку — 3 (Новиков и др. 2004). Поскольку Волга протекает через ряд промышленных городов миллионников, в нижнем течении Волги концентрации тяжелых металлов чрезвычайно высоки. Это связано с процессом вымывания тяжелых металлов из почв водозаборных площадей при высоком стоянии вод или с талыми водами. Превышали нормативы соединения меди, цинка и железа. Соединение свинца и кадмия 2 раза больше чем на остальных территориях России (Пенькова и др. 2004). Однако не всегда уровень загрязнения растет с увеличением численности населения. В случае Азовского моря, Клёнкин и др. (2004) отметили снижение содержания тяжелых металлов в частности железа, марганца, цинка, хрома, меди, свинца, ванадия, мышьяка и кадмия. Концентрации этих металлов относительно невысоки. Обнаружено уменьшение содержания этих металлов в мышцах, жабрах, печени и гонадах рыб.

Таким образом, концентрация тяжелых металлов может служить индикатором качества воды и степени антропогенного загрязнения. Как правило, к числу наиболее тестируемых металлов относят такие элементы как Fe, Pb, Ni, Zn и Со (Forstner, Wittman, 1981).

Биологические особенности травяной (Rana temporaria L.) и остромордой (Rana arvalis Nills.) лягушки и серой жабы [Bufo bufo L.), как объектов данного исследования.

Два вида бурых лягушек семейства Ranidae: травяная и остромордая лягушки и представитель семейства Bufonidae, серая жаба, являются традиционными объектами биологических исследований.

У травяной лягушки {Rana temporaria L.) спаривание начинается ранней весной, иногда даже в воде со льдом (Дунаев, Орлова 2012).

Кладка содержит от 670 до 4000 яиц. На Звенигородской биологической.

15 станции МГУ, где выполнялась полевая часть данного исследования, плодовитость травяной лягушки 700−6700 икринок в кладке (Северцов, 2008). Развитие икринок длится 5−25 суток, а личиночный период длится около трех месяцев. Зимовка происходит в воде или на суше. Зимовка длится с августа — ноября по март — начало июня в зависимости от географической широты. Сеголетки уходят на зимовку позже взрослых. Половой зрелости особи этого вида достигают в 2−3 года, в природных условиях доживают до 17 лет.

Остромордая лягушка {Rana arvalis Nills.), как и травяная, появляется в водоемах в апреле, когда еще лежит снег и не растаял лед. По наблюдениям, выполненным на территории Звенигородской биологической станции икрометание остромордой лягушки начинается примерно на 7−10 дней позже, чем у травяной (Северцов, 2008). Нерест начинается при 10−15°С. В кладке может содержаться от 200 до 3080 яиц. Развитие икринок длится 2−21 суток, личинок — 1−3 месяца в зависимости от температурных факторов среды обитания и плотности населения головастиков. Зимовка начинается с конца сентября, проходит в норах грызунов, пнях, подвалах зданий, куда они могут отправляться и в ноябре по снегу. Продолжительность жизни колеблется от пяти до девяти лет, в зависимости от географической широты (Дунаев, Орлова, 2012).

Икрометание серой жабы (Bufo bufo L.) начинается примерно в те же сроки, что и икрометание остромордой лягушки (Пикулик, 1985). В брачный период одну самку окружает до 20 самцов. Процесс откладки икры длится 6−24 часов, а период размножения — 3−15 суток. Кладка представляет собой шнур до 10 м, в котором в 2−4 ряда упаковано от 1200 до 7200 икринок. Развитие яйца зависит от температурных условий и может длиться от 2 до 20 суток. Личинки развиваются 1.5−3 месяца. На зимовку жабы уходят в конце сентября и зимуют в норах грызунов, под валежником, в трухлявых деревьях и погребах. Половой зрелость достигают на третьем (самцы) или четвертом (самки) году жизни. В природе жабы живут до 15 лет.

Стадии развития всех трех видов детально описаны в так называемых таблицах нормального развития (Дабагян, Слепцова, 1975; ОоБпег, 1960). Развитие травяной и остромордой лягушек настолько сходно, что таблицы нормального развития травяной лягушки вполне применимы для остромордой. Развитие же серой жабы, не смотря на существенные морфологические и экологические различия, в целом, проходит те же этапы, что и развитие бурых лягушек. Это позволяет использовать в исследованиях однотипные стадии развития. В онтогенезе травяной и остромордой лягушек выделяются пять практически дискретных и экологически своеобразных этапов развития. Эмбриогенез — от оплодотворения до вылупления, проходящий под защитой оболочек. Постэмбриональное развитие, когда вылупившаяся личинка находится на галлертах, питаясь ими. В этот период происходят процессы морфологической дифференцировки и подготовки личинки к свободноплавающему этапу развития. Следующий этап, этап головастика, так же характеризуется существенными морфологическими преобразованиями. Прежде всего, развивается ротовой аппарат — ротовая воронка и роговой клюв, формируется длинный кишечник, который в несколько раз длиннее тела головастика. Жаберный аппарат головастика так же приобретает иное строение — он покрывается кожной складкой и становится функционально внутренним органом, резорбируются присоски, которыми головастик прикрепляется к галлертам. На стадии почки задней конечности, стадии 39 для травяной и остромордой лягушек (Дабагян, Слепцова, 1975) или стадии 26 для серой жабы (Оовпег, 1960) головастики покидают места нереста и расплываются по водоему. Собственно стадия головастика у бурых лягушек длится около месяца, головастики растут, а морфогенетические изменения сводятся в основном к дифференцировке конечностей и подготовке к следующему этапу — метаморфозу. Метаморфоз очень не продолжительный, но крайне важный процесс, приводящий к морфологическому преобразованию всего организма. Перестраивается вся пищеварительная система, от челюстей, языка, глотки до упрощения и существенного укорочения пищеварительного тракта. Резорбируется хвостовая пластина, развивается скелет и мускулатура парных конечностей, меняются покровы и формируются лимфатические полости. Все эти преобразования приводят к формированию сеголетка, который покидает водоем. Следующий этап — от окончания метаморфоза до наступления половозрелости, зависит от продолжительности теплого сезона года.

Важной экологической особенностью личиночноо развития является «эффект группы» — термин С. С. Шварца (Шварц и др., 1976). Этот эффект состоит в том, что сразу после вылупления и до окончания метаморфоза головастики выделяют в окружающую среду экзометаболиты — белковые вещества (Poye, Роус, 1961), структура которых не установлена. Экзометаболиты подавляют рост и развитие головастиков. На более крупные особи они действуют слабее, чем на более мелкие. Чем выше плотность населения головастиков, тем сильнее действие экзометаболитов, вплоть до полной остановки роста и развития. В естественных водоемах и в аквариумных экспериментах эффект группы выражается в дифференциации генерации головастиков по темпам онтогенеза. В прудах, при высокой численности, стадия развития головастиков может варьировать от 39 до 50 стадий. Головастики остромордой лягушки более чувствительны к повышению плотности, чем головастики травяной (Северцов, 2008). Эффект группы у серой жабы не изучен. В отличие от бурых лягушек метаморфоз генерации серой жабы происходит в сжатые сроки — дни, вместо месяца. Это, по-видимому, указывает на отсутствие эффекта группы или на иные, чем у травяной и остромордой лягушек, формы его проявления.

Травяная (Rana temporaria L.) и остромордая {Rana arvalis Nilss.) лягушки являются близкими видами, постэмбриональное развитие которых имеет много общих черт. Тем не менее, более раннее икрометание травяной лягушки, характерное для центральной части России, определяет, при прочих равных условиях, и более ранний метаморфоз по сравнению со сроками развития остромордой лягушки. Наблюдаются и различия в размерах головастиков: у травяной лягушки икринки и головастики в среднем крупнее, чем у остромордой, особенно это заметно по размерам хвостовой пластины. Так же есть отличия в формировании практически всех структур ротового аппарата, например, образование сосочков и роговых челюстей и редукция зубчиков начинается раньше у R. temporaria, чем у R. arvalis (Писанец, Ткаченко, 2005). Ротовой аппарат серой жабы отличается от такового бурых лягушек. Возможно, это связано с иным распределением времени отводящегося на кормление и времени, которое головастики жабы проводят в толще воды. При этом и головастики лягушек и жабы являются эврифагами, способными поедать и бактериальную пленку с поверхности воды, зоопланктон в толще воды, обрастания и эпидермис водных растений и даже трупы других головастиков. Для всех них характерно соскребывание бактериальных налетов на разнообразных подводных поверхностях.

Хорошая изученность данных объектов позволяет, опираясь на литературные данные, сравнивать реакцию представителей этих видов на разнообразные, в том числе и экстремальные, воздействия окружающей среды. влияние загрязнения металлами на водные стадии онтогенеза амфибий.

Влияние тяжелых металлов на раннее развитие амфибий в настоящее время изучается довольно широко. Связано это как с доступностью личиночных стадий амфибий для статистически достоверного исследования, так и с аккумуляцией поллютантов различной природы именно в водной среде. Наше исследование было сосредоточено на изучении влияния тяжелых металлов. Как отмечают многие авторы, именно высокие концентрации таких ионов металлов как алюминий (Al), свинец (РЬ), цинк (Zn), кадмий (Cd), ртуть (Hg), серебро (Ag), медь (Си), мышьяк (As), марганец (Мп), молибден (Мо) и сурьма (Sb), оказывают существенное влияние на ход развития амфибий (State of the Environment Advisory Council 1996).

Такие тяжелые металлы как алюминий, могут быть летальным и/или вызывать замедление роста и развития, приводить к изменениям в морфологии (Clark, LaZerte, 1985; Freda et al., 1990; Blaustein et al., 2003; Crawshaw, 2003). Так же могут наблюдаться и физиологические изменения, как, например, повышение уровня метаболизма у личинок, живущих в водоемах, около которых проходило сжигание угля (Rowe et al., 1998). Именно повышение концентрации некоторых металлов, происходившее в результате сжигания угля и рассматривалось авторами как причина высокой смертности у личинок Bufo terrestris (Rowe et al., 2001). Мышьяк поглощается через кожу, накапливается в печени, а при длительном воздействии откладывается в костной ткани. Кадмий, как и ртуть, всасывается через кишечник и распространяется с кровеносным руслом в печень, почки и селезенку. Кобальт также накапливается в печени (Humphreys, 1990). Накопление этих металлов может приводить как к явным аномалиям развития, так и влиянию на системы органов, например на репродуктивную систему лягушек, как было показано для Rana pipiens, приводя к формированию икры содержащей уже повышенные концентрации металлов (Kaplan et al., 1967; Plowman и др., 1994; Wall 1999). Кроме того, воздействие высоких концентраций металлов способно нарушать функционирование эндокринной системы и вызывают подавление иммунитета (Blaustein, Kiesecker, 2002). Даже влияние на поведенческие реакции, как пищевое поведение или поведение избегания хищников, может меняться под действием повышенных концентраций металлов (Wright, Vails Badia, 2005).

Надо отметить, что такое влияние на развитие амфибий могут оказывать и другие стрессирующие факторы. Например слабые электромагнитные излучения (Падалка, 2006), повышение плотности головастиков в результате пересыхания водоемов (Шварц и др, 1976), гипоксии (Северцов, 2008), температурные изменения и показатели освещенности (Ручин, 2004) и воздействия хищников.

И все-таки воздействие тяжелых металлов на развитие амфибий оказывается многогранным и пока еще слабо изученным. Согласно разным авторам, некоторые металлы могут снижать токсическое действие других металлов. Показано, что Mg может снизить токсическое воздействие Pb2+, Cd2+, Мп4+ и ряда других ионов. Аналогичным образом, отсутствие Mg увеличивает токсическое и тератогенное воздействие Ni, Со, Zn и Cd. Пока же, основные исследования, сосредоточены на изучении воздействия отдельных металлов, и в частности, на изучении свинца и железа, как наиболее распространенных антропогенных поллютантов.

Воздействие свинца.

Свинец относится к наиболее распространенным поллютантам во всем мире. Более чем на 4 млн. тонн свинца используются каждый год в батареях, пигментах красителей, сплавах и боеприпасах (Humphreys, 1990). Свинец гораздо более распространен в литосфере, чем в других оболочках земной коры. Средние концентрации в почве составляют около 16 мг / кгв донных отложениях 47 мг / кгподземных водах 36 мкг / л, и пресной воде около 2 мкг / л (Sparling, 2006). Антропогенная деятельность на протяжении последних 40 лет привела к значительному увеличению распределения свинца, поскольку этот элемент может передаваться через многие трофические цепи и накапливаться в тканях живых организмов, постепенно влияя на поведение, кровообращение, работу нервной, выделительной и репродуктивной систем. В животных поглощенный свинец транспортируется эритроцитами и распространяется на мягкие ткани, особенно почек, а также печени, легких, селезенки, мозга и сердца (Humphreys, 1990).

Показано, что свинец оказывает глубокое влияние на развитие скелета головастиков на преди постметаморфозных стадиях (Sparling et а]., 2006). При концентрации свинца выше 75 мг / кг в осадке, некоторые скелетные дефекты были очевидны. Среди них небольшое искривление бедренных костей, укорочение на обоих передних и задних конечностях пальцев (брахидактилия). При концентрации более 540 мг / кг свинца наиболее распространенной аномалией была деформация осевого комплекса, пальцы были скручены (клинодактилия) и существенно недоразвиты. Бедра и другие трубчатые кости были изогнуты и усеченны (брахимелия). При концентрации 2360 мг / кг свинца, все головастики, которые дожили до метаморфоза показали, очень существенные скелетные отклонения. Один сеголеток при этой концентрации метаморфизованных без внешних отделов или задних или передних конечностей (эктромелия). Пороки развития конечностей были двусторонними и по существу симметричными.

Между тем, сублетальное воздействие свинца вызывает изменения в поведении (№хск^ е1 а1., 1997). Лягушки и головастики, подвергшиеся обработке свинцом в концентрации 1 мг/л в течение 7 дней, показывают ухудшение эффективности поведения избегания нападения хищника. У взрослых особей отравление свинцом вызывает неврологические патологии (ТерБОП, 2011).

Воздействие железа.

В отличие от свинца, железо — важнейший компонент нормального метаболизма позвоночных животных, в том числе и амфибий. Концентрации его в организме не велики и составляют примерно 0,01% от массы тела животного. Железо незаменимо в процессах кроветворения и внутриклеточного обмена. Примерно 55% железа входит в состав гемоглобина эритроцитов, около 24% участвует в формирование миоглобина и примерно 21% депонируется в печени и селезенке. Ионы трехвалентного железа в организме переносятся с помощью сложного белка трансферрина (обнаружен в плазме крови, молоке, яичном белке). Железо играет важную роль в процессах выделения энергии, в ферментативных реакциях, в обеспечении иммунных функции, в обмене холестерина (Шапошникова, Болгова, 2010). Тем не менее, высокие концентрации железа могут вызывать угнетение пищеварительных ферментов, нарушать проницаемость биологических мембран и снижать содержание растворимых ферментов (Щербакова, 2004). На развитие амфибий высокие концентрации железа так же оказывают негативное воздействие, хотя для разных стадий разных видов уровень концентрации железа может быть различным. Так при концентрации в воде ионов железа от 20 до 30 мг/л наблюдается 100% смертность головастиков Bufo boreas (Porter, Hakanson, 1976). В меньших концентрациях железо может приводить к замедлению развития, что, например, показано для зародышей шпорцевой лягушки (Dawson et al., 1985).

Таким образом, два металла, свинец и железо, представляют собой достаточно обычные поллютанты урбанизированных территорий. Они, несомненно, вносят свой вклад в нарушение нормального развития амфибий, обитающих на территории городов, которое может выражаться как в увеличении смертности, так и в возникновении разных типов и с разной частотой аномалий развития.

Следует отметить, что в литературе есть указания на концентрацию тяжелых металлов главным образом в печени, селезенке, костном мозге. Нам не удалось найти данных о путях проникновения этих металлов в организм головастика.

Аномалии бесхвостых амфибий.

Индукционное исследование аномалий развития амфибий проводится не так давно. В 1956 году С. H. Waddington и M. М. Perry использовали трипановый синий чтобы вызывать тератогенные эффекты в зародышей хвостатых и бесхвостых амфибий. Среди полученных аномалии были водянка, микроцефалия, формирование больших масс хорды на заднем конце туловища, аномалии эпидермиса, вакуолярные дегенерации нервной ткани и мезодермы, подавление гаструляции и мезодермализация нотохорда. В 1958 году J. Rostand провоцировал у лягушек аномалии эктродактилии и синдактилии при взаимодействии их зародышей с трипофлавином. Согласно разным авторам (Blaustein et al., 1994, 1996, 1997, 1998, 1999, 2003, 2005; Blaustein и Beiden 2003; Hatch и Blaustein 2000, 2003; Garcia et al., 2006; Blaustein и Bancroft 2007; Macias et al., 2007; Bancroft et al., 2008; Romansic et al., 2009), экспозиция эмбрионов в ультрафиолетовом свете (УФ-В, 280−315 нм.), приводит к появлению аномалии и к значительной эмбриональной смертности у некоторых земноводных. Эти аномалии были представлены боковым изгибом хвостовой пластины, формированием кожных пузырей и отеков.

Частота встречаемости аномалий в развитии амфибий из природных популяциях обычно не превышает 2%. Однако исследования последних лет показали, что доля аномальных диких лягушек увеличились в последние годы. Аномалий у головастиков могут быть вызваны химическим составом воды или пищи и другими факторами окружающей среды (Rostand, Tetry, 1972; Reeves, 2010). Большинство аномалий взрослых амфибий связаны с нарушениями развития задних конечностей и характеризуются отсутствием конечностей или их полным или частичным дублированием. В некоторых случаях эти деформации были отнести к воздействию химических веществ, таких как пестициды, ретиноиды, а в других причины не были выявлены (Сгаш811а? 2003).

Личинки с тяжелыми аномалиями, возможно, не смогут эффективно добывать пищу или избегать хищников. У земноводных, аномалии могут сохраняться на протяжении всей личиночной стадии, и после метаморфоза, потенциально препятствуя выживанию. Однако некоторые особи могут достичь взрослого состояния (В1аш1ет и др., 1997). Тем не менее, остается не ясным являются аномалии постметаморфозных стадий новообразованиями или их возникновение тесно связано с накоплением поллютантов на личиночных стадиях развития. Этот вопрос становится более актуальным на фоне установленного факта возрастания доли аномалий позвоночника от загородных популяций к городским (Вершинин, 2006; Неустроева, 2012).

Таким образом, анализ литературы показывает, что различные стадии предметаморфозного развития бесхвостых амфибий являются удобными и информативными тест-объектами для изучения действия поллютантов на организм животного. Однако разная направленность таких исследований приводит к тестированию различных поллютантов и в меньшей степени к изучению их воздействия на поведение, физиологию и онтогенез головастиков. Имеются данные о накоплении некоторых металлов в определенных органах и тканях, хотя пути проникновения этих металлов в организм — не изучены. Между тем, от того, как металл проникает в организм, зависит и его концентрация в тех или иных органах. С другой стороны само нахождение металла в организме головастиков свидетельствует о его присутствии в нерестовых водоемах. Анализ изменчивости и частота аномалий свидетельствуют о степени загрязнения водоема и об отрицательном влиянии на морфогенез исследуемых видов.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ.

Данное исследование было предпринято с двумя целями:

1. Сравнительный анализ аномалий личиночного развития бесхвостых амфибий, обитающих в городских и загородных популяциях.

2. Изучение особенностей влияния антропогенного загрязнения нерестовых водоемов железои свинец-содержащими сплавами на постэмбриональное развитие некоторых видов бесхвостых амфибий.

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать спектр аномалий и сравнить частоту их встречаемости у личинок травяной лягушки {Rana temporaria L. 1758) и остромордой лягушки {Rana arvalis Nilsson 1852), развивающихся в водоемах г. Москвы и Подмосковья.

2. Выполнить гистологический анализ одной из наиболее типичных аномалий развития.

3. Разработать экспериментальную модель, имитирующую загрязнение нерестового водоема железои свинецсодержащими сплавами.

4. Методами морфометрии и статистического анализа охарактеризовать влияние загрязнения водоемов железои свинецсодержащими сплавами на развитие головастиков травяной и остромордой лягушек, а также серой жабы {Bufo bufo L. 1758),.

5. С помощью спектрохимического и гистохимического анализа исследовать локализацию накопления железа и свинца в организме личинок амфибий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Полевая часть.

Исследования проводились в весенний период 2010 года. В качестве объекта были выбраны головастики следующих видов бесхвостых амфибий: травяной лягушки {Rana temporaria L. 1758) и остромордой лягушки (Rana arvalis Nilsson 1852) на стадиях развития с 39й стадии по 52ю, согласно таблицам Дабагян и Слепцовой, 1975.

Сбор полевого материала осуществлялся в черте г. Москвы, в двух районах: Востряково и Бутово (рис. 1). В районе Востряково (Западный административный округ), водоем находится рядом с МКАД и в нем наблюдается большое количество бытового мусора с расположенного по соседству Востряковского кладбища (рис. 2). В этом водоеме проходило размножение остромордой лягушки. В районе Бутово (Юго-Западный административный округ) расположен небольшой пересыхающий водоем, загрязненный большим количеством металлсодержащих конструкций и автомобильных шин. В этом водоеме наблюдалось икрометание травяной лягушки (рис. 3). На территории Звенигородской Биологической Станции им. С. Н. Скадовского (ЗБС) при МГУ им. М. В. Ломоносова, (50 километров к западу от Москвы) собран материал из двух водоемов: «Красная горка», находящийся на берегу реки Москвы (рис. 4), где наблюдалось икрометание травяной Результаты химического анализа воды исследованных водоемов в сравнении сданными для подмосковных водоемов.

Район Востряково*.

N 55.655 578-Е 37.446 271 свинец в 1.86 раз цинк в 4,87 раз железо в 2,73 раза алюминий в 1,4 раза.

Район Бутово*.

N 55.563 945. Е 37 554 903 свинец в 0,96 раз железо в 1,34 раза.

Рисунок 1. Схема юго-западной часть г. Москвы с обозначением точек сбора материала.

Рисунок 2. Водоем в районе Востряково (Западный административный округ), в котором происходил нерест остромордой лягушки (Rana arvalis).

Рисунок 3. Небольшой пересыхающий водоем В районе Бутово (Юго-Западный административный округ), в котором наблюдалось икрометание травяной лягушки (Rana temporaria).

Рисунок 4. Водоем Красная горка, находящийся на территории Звенигородской Биологической Станции МГУ им. М. В. Ломоносова, где наблюдалось икрометание травяной лягушки. лягушки и водоем «Карьер», расположенный примерно в 2 км от ЗБС (рис. 5), где наблюдалось икрометание остромордой лягушки.

В каждый водоем в Москве и на территории ЗБС были помещены «садки в виде клеток» (рис 6) с икрой травяной (Rana temporaria) и остромордой (Rana arvalis) лягушек на стадии ранней бластулы. Садки, сделанные из мелкоячеистой сетки, помещали для свободного движения воды и ограничения расплывания головастиков. Были взяты пробы от шести кладок каждого вида. По достижении стадий 38−39, 42−43, 47−48 и 52, головастиков фиксировали в 7% растворе формальдегида.

Кроме того, были добавлены данные по полевым фиксациям, выполненным Северцовой Е. А. из тех же водоемов в течении с 2004 по 2007 годы, на более ранней стадии развития травяной и остромордой лягушек — с 32 по 34 стадию.

При разборе фиксированного материала выявляли личинок с явными аномалиями развития. Определяли частоту встречаемости отмеченных аномалий. Значимость различий в частотах определяли при помощи х2.

Рисунок 5. Водоем Карьер, расположенный примерно в 2 км от территории Звенигородской Биологической Станции МГУ им. М. В. Ломоносова, где наблюдалось икрометание остромордой лягушки.

Рисунок 6. Садки, сделанные из мелкоячеистой сетки, в которые помещалась икра травяной (Rana temporaria) и остромордой (Rana arvalis) лягушек на стадии ранней бластулы.

Гистологический анализ.

Для наиболее типичной аномалии «деформация осевого комплекса» был проведен гистологический анализ по стандартной методике с окрашиванием по Маллори. Сагиттальные срезы были выполнены для 14 аномальных головастиков R. arvalis и Зх головастиков R. temporaria на 32−34 стадии развития. Контрольных головастиков было порезано по 3 штуки каждого вида.

Экспериментальная часть.

На стадии ранней бластулы из водоемов, расположенных на территории Звенигородской биологической станции были собраны по 5 кладок травяной лягушки (Rana temporaria L.), остромордой лягушки {Rana arvalis Nilss.) и серой жабы {Bufo bufo L.). Каждая кладка была разделена на три части. Одна часть была помещена в аквариум, в который было добавлено по 30 гр шариков свинцовой охотничьей дроби. Вторая часть — в аквариум, куда было добавлено по 10 штук железных гвоздей. Третья часть каждой кладки развивалась в аквариуме, который использовался в качестве контроля. Вода во всех водоемах была взята из нативного водоема. Количество зародышей в каждый группе было приблизительно одинаково. С 39ой стадия развития головастиков кормили отваренной крапивой ad libitum. По достижении стадии почки задней конечности проводилась первая серия фиксаций. Вторая и третья серии фиксаций осуществлялись по прошествии пяти стадий развития, определяемых согласно таблицам нормального развития. Стадии развития бурых лягушек определяли согласно таблицам Дабагян и Слепцовой (1975), а серой жабы, по таблицам нормального развития, разработанным Gosner (1960). При последующем разборе фиксированного материала выявляли видимые аномалии развития и определяли частоту их встречаемости.

Спектрохимический анализ.

Для определения концентрации накопленных ионов железа и свинца в Институте Проблем Технологии Микроэлектроники и Особо Чистых Материалов Российской Академии Наук (ИПТМ) РАН (г. Черноголовка, Московская область) был проведен спектрохимический анализ тканей головастиков. На 39й стадии развития у головастиков травяной и остромордой лягушек, а у серой жабы на 26 стадии развития, удаляли кишечник и анализировали отдельно ткани тела головастика и ткани и содержимое кишечника. На 43 стадии развития травяной лягушки и на 34 стадии развития серой жабы помимо отдельного анализа тканей тела и тканей кишечника, в ряде случаев, был проведен анализ тканей печени и жабр.

Гистохимический анализ.

Для гистохимического анализа использовались головастики двух видов: травяной лягушки Rana temporaria L. и серой жабы Bufo bufo L.

38 из экспериментальных и контрольных групп. Головастики, фиксированные 7% раствором формальдегида на 43 стадии развития, препарировались под бинокулярном. В анализ были включены: печень, жабры, кишечник и вторичные почки головастиков. Извлеченные органы промывали в дистиллированной воде в течение ночи и обезвоживали в растворе ISOPREP — среде для гистологической обработки на основе изопропанола (BioVitrum), проводя до 5 последовательных смен по часу каждая. После чего образцы помещали в среду H1STOMIX EXTRA (BioVitrum) на 4 часа, делая одну смену среды. После проводки материал заливали в HISTOMIX и получали срезы толщиной 4−5 микрон при помощи микротома ротационного типа Leica RM2245. Полученные среды депарафинировали, регидратировали и окрашивали по Перслу (Меркулов, 1969) с целью выявления трехвалентного железа в тканевых образцах. Соединения трехвалентного железа окрашивается в синий цвет. Препараты заключали в монтирующую среду HISTOMOUNT (BioVitrum) и анализировали с помощью микроскопа Axio Score Al (Carl Zeiss).

Морфометрический анализ.

Морфометрический анализ головастиков травяной {Rana temporaria) и остромордой {Rana arvalis) лягушек проводили с 39 по 43 а стадии развития. Морфометрию серой жабы {Bufo bufo) осуществляли с 26 по 34 стадию. Анализ был выполнен с использованием бинокуляра.

Carl Zeiss и программы AxioVision. Измеряли следующие признаки (рис.7):

38 стадия.

Рисунок 7. Морфометрические признаки на примере 38 стадии развития травяной лягушки (Rana temporaria). Аналогичные признаки измерялись для остромордой лягушки (Rana arvalis) и серой жабы (Bufo bufo) на соответствующих стадиях развития. Обозначения признаков и пояснения см. в тексте.

Lo — общая длина головастика: от крайней точки морды до кончика хвостовой пластины.

Lb — длина туловища: от кончика морды до анального отверстия Lx — длина хвостовой пластины: от анального отверстия до кончика хвостовой пластины.

Wx — максимальная ширина хвостовой пластины.

Wg — ширина головы: расстояние измеренное по линии жаберных щелей Dlg — длина головы: расстояние от линии жаберных щелей до наиболее выступающей точки морды.

R — ширина ротового отверстия: расстояние между уголками ротового отверстия.

Полученные данные обрабатывали при помощи программ Excel и STATISTIKA 6.0. Значимость различий в средних значениях оценивали при помощи t-критерия Стъюдента. Рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена и на их основе строились корреляционные графы.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ОБСУЖДЕНИЕ.

Полевая часть: Исследования частоты встречаемости и характера аномалий головастиков трех видов бесхвостых амфибий.

Тип и количество аномалии головастиков из водоемов города Москвы и из Подмосковья.

Данное исследование основывается на фиксациях головастиков Rana temporaria и R. arvalis, выполненных Северцовой Е. А. в период с 2004 по 2007 годы на стадиях развития с 32 по 34, и на фиксациях автора данной работы, собранных в 2010 году для этих же видов, но на 39 и несколько более старших стадиях развития. Фиксации проводились в полевых условиях с последующим разбором в лаборатории. В результате анализа полевого материала были выделены аномальные головастики.

Под аномалиями развития мы понимали любые морфологические отклонения, отличающие данную особь от зафиксированной в таблицах нормального развития на соответствующих стадиях. На основании такого подхода нами были выделены следующие аномалии развития:

Деформация осевого комплекса" - туловище изогнуто дорсально или вентрально по продольной оси тела, при котором расстояние от кончика морды до кончика хвостовой пластины меньше, чем общая длина туловища (рис. 8).

Водянки" - водянистые «опухоли», встречающиеся только на хвостовой пластине просмотренных головастиков.

Темпы развития" (рис. 9) — головастики 27 и более ранних стадий (сбор материала проводился в то время, когда основная масса головастиков достигала 28−32 стадий развития).

Нарушения пигментации" - нарушение равномерного распределения меланофоров, наличие более светлых и бедных пигментом участков.

Нарушения покровов" - повреждения покровов: раны, слезающая «лохмотьями» кожа, не являющиеся следствиями фиксации или неаккуратного обращения с материалом (рис. 9).

Аномалии жабр" - асимметричное развитие жаберных лепестков, недоразвитие или полное отсутствие жабр.

Тотальные уродства" - наличие более двух из вышеперечисленных аномалий у одного зародыша или крайне искривленный и деформированный зародыш (рис. 9).

Кроме того, при анализе материала было обнаружено наличие сочетаний вышеперечисленных аномалий: два типа аномалий у одного зародыша. «Темпы развития + Деформация осевого комплекса», «Деформация осевого комплекса + деформации туловища», «нарушения покровов + аномалии хвостовой пластины»,.

Рисунок 8. Аномалия «деформация осевого комплекса» у головастиков травянойц лягушки. 32 — 34 стадии развития.

Рисунок 9. Примеры аномалий, обнаруженных у головастиков травянойц лягушки на 32 — 34 стадии развития. нарушения покровов + темпы развития", «деформация осевого комплекса + водянки», «деформация осевого комплекса + нарушения пигментации» (в данном случае месторасположение обедненного пигментом участка не имеет значения, по причине редкости данного сочетания) и «нарушения покровов + деформация осевого комплекса», «пигментации тела + водянки», «деформация осевого комплекса + пигментация хвоста», «нарушения покровов + аномалии хвостовой пластины», «темпы развития + нарушения покровов», «нарушения покровов + пигментация хвостовой пластины», «нарушения покровов + темпы развития», «нарушения покровов + деформации».

Частота встречаемости аномалий развития у травяной и остромордой лягушек на 32−34 стадиях развития в городе и за его пределами не высока и составляет около 3,8−5,83% (рис.10). На 39 же стадии доля аномалий еще ниже: от 0,9 до 2,8%. Интересно отметить, что вне зависимости от стадии и анализированного вида доля аномалий была ниже в подмосковных пробах, по сравнению с московскими.

R. temporaria и.

R. arvalis деформации осевого комплекса (ДОК) «темпы развития нарушения покровов деформации тела.

Док + темпы развития тотальные.

УР°Дства темпы развития + нарушения пок водянка нарушения покровов деформации тела пигментация + нарушения покровов док + нарушения покровов док + деформации тела темпы развития + водянка аномалии жабр

R. temporaria.

R. arvalis.

76 476.

Рисунок 10. Частота встречаемости разных типов аномалий у головастиков травяной и остромордой лягушек 32 — 34 стадий развития, обитающих в водоемах Москвы и Подмосковья.

Среди аномалий наибольшую долю на 32−34 стадиях развития составляют «деформация осевого комплекса». Для травяной лягушки доля таких аномалий, относительно всех других — около 50%. У остромордой лягушки, напротив, доля с личинок с деформацией осевого комплекса ниже, а на первый план выступают аномалии связанные с замедлением развития и нарушениями покровов.

На 39 стадии развития травяной лягушки доля личинок с деформацией осевого комплекса, по-прежнему, наиболее многочисленная аномалия (рис. 11). Среди личинок остромордой лягушки доля отстающих в развитии сокращается и возрастает число личинок с искривлениями осевого скелета. Стоит отметить, что разнообразие встречаемых аномалий по мере развития сокращается: если на стадии 32−34 было отмечено около 14 типов аномалий, то на 39й стадии — только восемь. Наиболее типичные аномалии представлены на рис. 12.

R. temporaria m.

R. arvalis деформация осевого комплекса темпы развития нарушения покровов деформации тела аномалии хвоста аномалии кишечники отсутствие задней конечности отсутствие передней конечности.

R. temporaria.

Рисунок 11. Частота встречаемости разных типов аномалий у головастиков травяной и остромордой лягушек 39 и старше стадиях развития, обитающих в водоемах Москвы и Подмосковья.

Рисунок 12. Аномалии головастиков на 39 и более старших стадиях развития. А — отсутствие конечностей, Б — аномалии кишечника, В — аномалии хвоста, Г — деформации осевого комплекса.

Гистологический анализ аномальных головастиков.

Наиболее типичной аномалией развития личинок, отмеченной как для городских популяций, так и для загородных и травяной и остромордой лягушек было «деформация осевого комплекса» (рис. 13). Внешне эта аномалия выражается в изгибе хвостовой пластины вниз или вверх в сагиттальной плоскости. Однако возможные внутренние причины приводящие к этой аномалии не изучены. Среди возможных причин могут быть нарушения сомитогенеза, приводящие к деформацию осевого комплекса, смещение сомитов относительно друг друга или иные причины, для выяснения которых и был проведен гистологический анализ. Анализ сагиттальных срезов личинок на 32 стадии развития в области сомитов показал редукцию сомитной ткани, при этом такие нарушения могут быть последствиями либо нарушением поворота сомитов, либо результатом нарушения межклеточных контактов (рис. 14).

Причины возникновения такой аномалии могут быть крайне разнообразны. Показано, что даже тепловой шок влияет на сегментацию сомитов и вызывает уродства, аналогичные тем, что были встречены нами среди личинок (Elsdale et al., 1976; Cooke, Elsdale 1980). Ультрафиолетовое облучение может вызывать даже полное не развитие хорды, хотя в меньших дозах не наблюдается формирование нормального контакта между дорсальной и вентральной сторонами сомитов (Woo Youn, Malacinski, 1981). А.

Контроль.

Рисунок 13. Гистологическон исследование аномалии «деформация осевого комплекса. А — общий вид нормального головастика травяной лягушки на стадии 38, Б — общий вид аномального головастика, стрелка указывает на деформированную область, В — сагиттальный срез аномального головастика.

Рисунок 14. Результаты гистологического исследования деформации осевого комплекса. А — сагиттальный срез контрольного головастика на стадии 38, Б — срезы аномальных особей, демонстрирующие нарушения формирования сомитов.

По-видимому, эти дефекты можно рассматривать как показатели нарушения общей устойчивости развития, поскольку факторы, вызывающие их чрезвычайно разнообразны. В гистопатологических анализах личинок корейского тритона (Hynobius leechii) показаны аналогичные нарушения в формировании осевого скелета (Yong-Uk et al., 2010). У бесхвостых амфибий оно может отражать проблемы в гаструляции и в механизме удлинения задней части эмбриона на стадии нейрулы (Woo Youn et al., 1980).

Повышение частоты аномалий развития у головастиков в водоемах г. Москвы по сравнению с головастиками из подмосковного водоема означает увеличение тератогенного действия поллютантов по мере загрязнения нерестилищ. Разнообразие резких отклонений от нормального развития указывает на индивидуальные различия головастиков, подвергшихся действию поллютантов. Вместе с тем, ограниченный спектр морфологических уродств, свидетельствует о дифференциальной чувствительности органов и их систем к действию поллютантов. Нарушения покровов тела следует объяснить тем, что эпидермис подвергается непосредственному воздействию поллютантов. Другая группа отклонений включает уродства, обусловленные изменениями развития скелета: Деформация осевого комплекса, недоразвитие или переразвитие конечностей. По-видимому, эти аномалии возникают, как следствие действия поллютантов на морфогенетические процессы, обусловленные ростом головастиков и подготовкой к метаморфозу. Результаты анализа гистологической картины одной из наиболее часто встречаемых аномалий — Деформация осевого комплекса, косвенно подтверждаются высказанное предположение. Особое место занимает резкое торможение развития без морфологических уродств. Можно предположить, что у таких особей не хватает энергетических возможностей для обеспечения нормальных темпов развития. Сокращение частоты уродств по мере развития указывает на гибель головастиков с резким отклонением развития, т. е. на стабилизирующий отбор, выраженный в сохранении нормы даже в условиях резко отличающихся от нормальных.

Экспериментальная часть: Исследование влияния имитации загрязнения водоемов железои свинец-содержащими сплавами на головастиков трех видов бесхвостых амфибий.

Эксперимент по исследованию влияния имитации загрязнения водоема железо и свинец содержащими сплавами проводился в лабораторных условиях для выравнивания основных показателей, влияющих на развитие головастиков бесхвостых амфибий. Различия между сериями эксперимента наблюдались только в характере загрязнения аквариумной воды: в серии «контроль» головастики развивались в воде из нативного водоема, в серии «железо» — в воде из нативного водоема с добавлением ржавых гвоздей и в серии «свинец» -в воде из нативного водоема с добавлением свинцовой охотничьей дроби.

Всего по результатам эксперимента в анализ было включено 8245 головастиков на двух стадиях развития — 39 и 43 й для травяной и остромордой лягушек, и 26 и 32−34 для серой жабы. Морфологически эти стадии были идентичны для всех трех видов. Другие стадии в анализ данной работы мы не включали по причине их малочисленности и разрозненности. Некоторые результаты по ним носят информативный характер.

Control Fe Pb.

R. temporaria ст. 39 660 660 720 ст. 43 770 810 740.

R. arvalis ст. 39 980 980 980.

В. bufo ст. 26 180 100 260 ст. 33 180 80 145.

Таблица 1. Количество головастиков включенных в анализ результатов эксперимента.

Проведение эксперимента по имитации загрязнения водоема железосодержащими сплавами и содержащими свинец сплавами показало, что наличие металлических соединений в воде практически не меняет концентрацию ионов этих металлов в водной среде. Вода для проведенного эксперимента бралась из нативного водоема, чтобы минимизировать негативные последствия для развивающейся икры. В воде водоема содержание ионов железа составляло 320 мкг/л, а свинцав концентрации 0,2 мкг/л в воде. В этих условиях проходило развитие контрольной группы. В водах, куда соответственно добавляли ржавые гвозди для имитации загрязнения железом и свинцовую дробь, для имитации загрязнения свинцом, концентрация этих элементов была минимально выше — 340 мкг/л железа и 0,3 мкг/л свинца. Такое незначительное увеличение концентраций, измеренное по окончании эксперимента, позволяет судить о фактическом отсутствии растворения этих элементов. Тем не менее, следует учитывать, что добавление железо и свинецсодержащих сплавов в экспериментальные аквариумы не меняет общих условий развития, по сравнению с контрольной группой. Оно увеличивало только доступность этих поллютантов для головастиков. Дело в том, что в естественных водоемах головастики обычно поедают обрастания и эпидермис макрофитов и детрит со дна водоемов. Поэтому, говорить об отсутствии влияния железа и свинца на развитие головастиков ни в коей мере нельзя. Уже на 39й стадии развития (для жабы — на 26 стадии) головастики имели явные признаки присутствия в своих кишечниках железа и свинца: через покровные ткани просвечивало ярко-рыжее заполнение кишечника частичками ржавчины у головастиков из серии эксперимента по загрязнению железо-содержащими сплавами. У головастиков второй части эксперимента — с имитацией загрязнения свинцом, через покровные ткани были видны серебристого цвета частички свинца. Это позволило предположить о значительном влиянии на характер развития исследуемых головастиков бесхвостых амфибий.

Частота встречаемости аномалий развития в эксперименте по имитации загрязнения водоема сплавами железа и свинца.

Прежде всего, развитие в условиях имитации загрязнения металлами сказалось на увеличении доли аномальных и погибших головастиков (рис. 15).

В. bufo.

Рисунок 15. Частота встречаемости и типы аномалий в эксперименте.

У травяной и остромордой лягушек в контрольной серии доля таких головастиков была мала — около 1%. В условиях же имитации загрязнения железом — она выросла до значений 6,3 — 6,4%, а в условиях загрязнения свинцом — от 5,2% для остромордой лягушки до 6,6% для травяной. У серой жабы уже в контроле смертность была несколько выше — около 2,9%, что объясняется чувствительностью икры жабы к каким бы то ни было манипуляциям. И в эксперименте доля аномальных головастиков превышала таковую для бурых лягушек. Развитие в аквариуме с железосодержащим сплавом привело к 8,1% доле аномалий, а с свинецсодержащим — к 6,3% доле аномалий.

Анализ характера аномалий показал, что наиболее типичной является замедление темпов развития отдельных головастиков. К числу головастиков с такой аномалией относились особи, чья стадия развития была минимум на две стадии младше, чем особи, завершающие континиум темпов онтогенеза, обусловленный эффектом группы. Из всего количества аномалий, доля, приходящаяся на замедливших свой рост головастиков, составляет от 10 до 84%. Особенно велико число головастиков отстающих в развитии в серии эксперимента «свинец». Аномалии хвостовой пластины и Деформация осевого комплекса так же являются типичными. Однако не во всех группах их возникновение можно объяснить загрязнением воды аквариумов железо или свинец содержащими сплавами. У серой жабы эти аномалии наиболее многочисленны, а вот у остромордой лягушки, наоборот, их доля не высока. Аномалия «нарушение покровов» была более характерна для развивавшихся в железо содержащих аквариумах головастиков.

Тип аномалии R. temporaria R. arvalis В. bufo.

Контроль РЬ Fe Контроль РЬ Fe Контроль РЬ Fe.

Темпы 42,8 84,7 51 80 53,8 46,6 36,8 10 развития.

Аномалии 14,2 10,8 29,5 33,3 42,1 70 хвоста.

Деформация 23,8 2,1 4 50 10 23,1 20 21 15 осевого комплекса.

Нарушение 12,2 50 15,4 покровов.

Аномалии 19 2Д 3 10 7,7 кишечники.

Тотальные 5 аномалии.

Таблица 2. Частота встречаемости разных типов аномалий у головастиков травяной и остромордой лягушек и серой жабы.

Таким образом, специфичность возникновения аномалий четко выделить не представляется возможным. На общем фоне можно только предположить, что загрязнение свинцом чаще приводит к замедлению развития, что выражается в присутствии в пробах головастиков, отставших на 2 и более стадии развития, по сравнению с основной массой развивающихся зародышей. Эти данные вполне соотносятся с результатами других исследований. В частности известно, что накопление в тканях развивающегося головастика ионов свинца затрагивает развитие скелета, что нередко приводит к серьезным аномалиям у метаморфизирующих головастиков (Sparling et al., 2006). Загрязнение железом приводит к формированию головастиков с проблемами покровов.

Морфометрический анализ.

Визуальные наблюдения за характером развития зародышей всех трех видов бесхвостых амфибий выявили различия в размерах головастиков рис.16), что подтверждается и статистическим анализом морфометрии головастиков. На 39й стадии развития общие размеры головастиков травяной лягушки не сильно, хотя и значимо (р<0,05), отличались друг от друга. У травяной лягушки крупными оказываются головастики, развивавшиеся в аквариумах с содержащими свинец сплавами, а из серии «железо» — мелкими. К 43 стадии развития картина меняется: головастики контрольной группы существенно увеличивают свой рост, тогда как развитие в аквариумах со свинцом резко тормозит. У серой жабы различия в размерах головастиков на 26й стадии развития наблюдаются только между контролем и серией «железо» (р<0.05). К.

43й стадии присутствие в аквариуме железо-содержащих сплавов, как и у травяной лягушки, приводит к существенному увеличению в размерах головастиков. Свинец-содержащие сплавы вызывают торможение общего роста головастиков. Сказать о динамике роста головастиков.

59 остромордой лягушки не представляется возможным, поскольку эксперимент был прекращен на 39й стадии развития. Однако, уже на стадии почки задней конечности наблюдается значимое уменьшение размеров головастиков развивавшихся в присутствии свинцовых сплавов по сравнению с контрольными или железосодержащими аквариумами (р<0.05). Анализ других признаков, характеризующих линейные размеры головастика: длины туловища (ЬЬ), длины хвостовой пластины (Ьх) и ширина хвостовой пластины (ИЪс) покзал, что на 39й стадии головастики травяной лягушки, развивавшиеся в воде с имитацией загрязнения свинцом были значимо крупнее контрольных (р<0.05). Разница в их размерах была не столь заметна, как при сравнении с головастиками из железосодержащих аквариумов. К 43й стадии развития и туловище и хвостовая пластина замедляют свой рост в условиях свинцового загрязнения, и продолжают расти со скоростью, характерной для контрольных головастиков, выросших в условиях имитации загрязнения железосодержащими сплавами.

С№Ь=13,63 С/сошг=14,81.

СИч-10,93 СУсотг=7, 85.-^ С1/РЬ=9,81 I СЛ=е=6,29.

Си=е=12,95 С^сошг=7,98 * ^ С/РЬ=13,40 ЩГ.

С/соп1г=10,63 Си=е=5,28.

Осотг=8,17 Орв=15,86.

СУРЬ=16,73 СУРЬ= 10,93.

1Ь.

Ст,=14,83 С1/сошг=15,91 Сусоп|Г=9.96 ОРЬ=11,36 А/ С1^е=13,14 * С№е=9,19.

С^е=18,41 В С^соШг=8,87 С№Ь=15,77 Сл=е=6,22.

Сусоп1г=9,93 Сусогиг=9,78.

Сурь=10,91 Си=е=14,07 1Сизь=15,97.

39 стадия.

43 стадия.

39 стадия.

43 стадия.

Орь=13,99.

Осоп)г=15,87″ .

С№е=10,71 С1/сошг=8,89.

СУРЬ=9,36 * С^е=7,51.

С^е=12,05 В ' С/сомг=8.72 Си>ь= 13,58^.

С (/соп1г=11,28.

С^о=5,42 С^е=16,37 С^соп (г=7,9 Си=ь=16,92.

Сурь=11,52.

3,8 3,4 3,0 2,6 2,2 1,.

Си=>ь=15,49 СЛотг=21,85.

Сл=е=17,39.

Си=е=13,3″ Осотг= 14,29' Си=ь=13,7б'.

С1л=е=18,28|^>'.

С^сошг=18,8.

Сурь=18,28®-" .

Осошг=17,12.

С№в=23,32 Сусомг=19,07.

Си=ь= 19,35 Си=е=24,54 Сурь=15,69.

39 стадия.

43 стадия.

39 стадия.

43 стадия.

Рисунок 16. Результаты статистического анализа морфометрических признаков. Динамика изменения средних значений признаков головастиков травяной лягушки (я), остромордой лягушки (•) и серой жабы (¦<) в условиях имитации загрязнения свинец и железосодержащих сплавов. По оси X — стадии развития головастиков (39 стадия развития для серой жабы соответствует 26 стадии, а 43 стадия — 34 стадии (по воБпег, 1960) — по оси У — средние значения признаков. Рядом указаны соответствующие значения коэффициентов вариации.

1Ы1о.

0 44.

0 42.

0 38.

Осошг=6 32*^ С№е=21 22 ^ Ст=6 57*" .

С№Ь=4 17 —.

Осотг=5 43.

Си=в=7 46 м С№Ь=5 59 Осошг=8 78.

С№е=5 31 гСкте=2 75 С№Ь=3 15. С (/соп1г=4 07.

Ст>=12 51 СЛ=е=5 35 Осотг=6 52.

39 стадия.

0 36.

0 34.

0 32.

С1/соп"=12 53 -С№е=10 01*.

Сурь=9 31 — 0>=11 24 *.

— Осо|Лг=13 61.

С№Ь=11 61 Ски*=11 26 Си>ь=12 83 ~Си=е=12 67* N.

43 стадия.

ZVxZLx.

0 28 ¦

0 26.

Суш>1Г=15 67.

А С№>=21 32.

• С№ь=13 14.

Ос0П (Г=16 16.

СУРЬ=16 02.

С|л=в=17 88.

39 стадия.

МдМ/д.

43 стадия С№е=1225.

15.

СУ"*=10 61 С№е=7 59 Омг=841.

С№Ь=11 83 4 Г.

С№а=13 27 *. С№ь=10.

Ст=837 «Смишгв 89.

Ое=9 61 •.

-> Сии"-8 68 Ст-993.

Сиа*=832.

Си*=742 * 0−8 95.

0 62.

0 58.

Си=е=3 03 С^соп!Г-8 55.

С№Ь=3 54.

Осопи=4 34 С№е=10 55 Ст>=3 28 С/соп1г=4 94 — Сиге=5 32 Си=ь=5 03.

1х//о.

С№ь=13 32 с^е=3 5 СУсоп1г=3 76.

Сисошг=3 53 Ст=2 29 С№"=2 08.

39 стадия.

43 стадия.

19 601 940 192 019 020 251 136 1 840 182 018 0178.

СТе=13 76 Ст>=8 58 X.

0/д/1о.

Ое=7 54 ш яС^е=8 3.

Си>ь=7 37 —————, Сич>=14 18.

Олхл=11 77 «-Оссл=7 95.

Сия*=1053*.

С№е=13 93 Осопг=6 84 * Оь=7 95.

С№е=9 03 Оь=7 74 Сйил=9 39.

39 стадия.

43 стадия.

0470 430 39 023 019.

С№=12 68.

Си>ь=9 58.

Шд.

СиошгИО 56*.

Стг8 11 С№е=10 49 С^сотг=10 73 С№ь=8 11 ->Осо*=6 94.

• Орь=8 45 А 0№е=9 58 Си=е=8 62 0<я≅11 43.

С№е=20 93 С№ь=18 40 V' Осоп"=12 84.

39 стадия 43 стадия.

39 стадия 43 стадия.

Рисунок 16 Продолжение Результаты статистического анализа морфометрических признаков Динамика изменения средних значений признаков головастиков травяной лягушки (я), остромордой лягушки (•) и серой жабы (Л) в условиях имитации загрязнения свинец и железосодержащих сплавов По оси X — стадии развития головастиков (39 стадия развития для серой жабы соответствует 26 стадии, а 43 стадия — 34 стадии (по возпег, 1960), по оси У — средние значения признаков Рядом указаны соответствующие значения коэффициентов вариации.

0/д.

Сл>ь=13,99 С^сошг=14,89.

Суре=14,41 С№е=12,93 Ст>=10,58 С/соп1г=12,6.

Сусошг= 10,34 С№е=13,18.

СУсотг=11.41 С^в= 15,25.

Си>ь=15,27 С|/рь=9,93.

Си=в= 14,07 С^соп1г=9,37.

Си=ь=13,2 5.

См=в=14,41.

С1/сотг=11,99 Суспшг=15,4 Си"ь=14,12 Си=е=9,96 С№Ь=14,52 ¦ Си=е=12,62.

С^сотг=8,37 Сисоп (г=10,49.

С№Ь=10,59 Сю>ь=15,12 С№е=16,86.

ОРв=17,47 Осотг=Ю, 5Е С№Ь=16,47.

39 стадия.

43 стадия.

39 стадия.

43 стадия.

С№е=19,03.

Сл"п1г=11.78 С|/рь=14,44.

Осо-«г= 19,26.

С^отг=9,96.

Сурь=11,47 С1/сошг=14,94 Си=е=18,98 «СУРЬ=14,79.

Си=е=13,59 1.

0,5.

С№в=23,27, С^соп1г=13,74″ Орь=21,2б'.

39 стадия 43 стадия.

Рисунок 16. Продолжение. Результаты статистического анализа морфометрических признаков. Динамика изменения средних значений признаков головастиков травяной лягушки (я), остромордой лягушки (•) и серой жабы (<) в условиях имитации загрязнения свинец и железосодержащих сплавов. По оси X — стадии развития головастиков (39 стадия развития для серой жабы соответствует 26 стадии, а 43 стадия — 34 стадии (по воэпег, 1960) — по оси У — средние значения признаков. Рядом указаны соответствующие значения коэффициентов вариации.

Общей закономерности влияния загрязнения водоема свинец или железосодержащими сплавами на пропорциональность ростовых процессов у головастиков не удалось выявить (рис. 16, продолжение). К 39й стадии развития относительный размер тела (Lb/Lo) головастиков травяной лягушки контроля и группы «свинец» оказываются близкими (р>0.05). У остромордой лягушки различия значимы между всеми парами групп, а у серой жабы — железосодержащими и контрольными аквариумами (р<0.05) значимы, но не существенны. Относительная длина хвостовой пластины (Lx/Lo) у травяной лягушки из контрольных аквариумов и аквариумов содержащих железо одинакова как на 39й, так и на 43й стадиях (р>0.05). У головастиков, чье развитие проходило в аквариумах содержащих свинец, хвостовая пластина оказывается короче относительно общей длины тела на 39й стадии и длиннее на 43й (р<0.05). У Bufo bufo развитие в воде с имитацией свинцового загрязнения не сказалось на формирование относительной длины хвостовой пластины по сравнению с контрольной группой (р>0.05), тогда как развитие в железосодержащем аквариуме приводит к значимому уменьшению длины хвостовой пластины, по сравнению с контролем (р<0.05).

Структуры переднего отдела тела у головастиков травяной лягушки в разных условиях развития различаются хотя и значимо, но значения средних близки. Интересно отметить, что и длина головы (Dig) и ее ширина (Wg), и ширина ротовой присоски ® у головастиков травяной лягушки из контрольной группы и на 39й и на 43 стадиях развития крупнее, чем у головастиков из железосодержащих аквариумов (р<0.05) (рис. 16, продолжение). Головастики же из аквариумов с имитацией свинцового загрязнения на 39й стадии были значимо крупнее, чем в контроле. К 43 й стадии, напротив, размеры головы были значимо меньше (р<0.05). У серой жабы развитие в свинецсодержащих аквариумах так же приводит к общему уменьшению размеров головы по сравнению с головастиками из контрольных кладок. А вот развитие в условиях имитации загрязнения железом, напротив, увеличивает размеры головы головастиков к 43й стадии до значимо превосходящих контрольные размеры (р<0.05). У остромордой лягушки различия в средних значениях размеров головных структур на 39й стадии наблюдаются не везде: очень близкими оказываются значения для контрольной группы и группы «железо». Условия развития практически не сказываются на пропорциональности развития головных структур. У травяной лягушки относительная длина головы (И^/Ьо) и относительные размеры ротовой присоски (Я/^) во всех сериях эксперимента одинаковы (р>0.05). Только развитие в условиях имитации загрязнения железом значимо влияет на пропорциональность развития головы {DlglWg)•. на 39й стадии это значение меньше, хотя к 43й стадии оно уже близко к значениям, характерным для контрольной группы (р>0.05). У остромордой лягушки к 39й стадии развития влияние железа на развитие оказывается не значимым (р>0.05), а действие свинцового загрязнения приводит к формированию головы меньшего размера, чем в контрольных группах (р<0.05). При этом на пропорциональность развития, так же как и у травяной лягушки, условия развития остромордой не оказывает влияния. Влияние условий на развитие головных структур головастиков серой жабы становится заметным только к 43й стадии развития. На 39й стадии и для длины {Dig) и ширины (Wg) головы и для ширины ротового отверстия {R) различия оказываются не значимыми (р>0.05) и только головастики, чье развития проходило в воде содержащей источник загрязнения железом ширина головы была значимо меньше, чем в контрольной группе (р<0.05). Влияние условий развития на пропорциональность головных структур головастиков серой жабы оказывается более заметным, чем для травяной и остромордой лягушек. Не меняющиеся в ходе развития контрольной группы относительная длина головы {Dlg/Lo) у головастиков развивавшихся в условиях имитации загрязнения металлами к 43 й стадии развития снижается со значимо высокого уровня до уровня, характерного для контрольной группы. Пропорциональность развития головы {Dlg/Wg) и относительные размеры ротовой присоски {R/Wg) у головастиков контрольной и свинец-содержащей группы близки на всем протяжении проведения эксперимента. Развитие же в условиях имитации загрязнения железом приводит к увеличению признака Dlg/Wg и уменьшению RfWg (р<0.05) (рис. 16, продолжение).

Более ожидаемо было бы влияние имитации загрязнения воды металлсодержащими сплавами на изменчивость постэмбрионального развития головастиков (рис. 17). Тем не менее, у травяной лягушки на 39й стадии развития наблюдаются наибольшие значения коэффициентов вариации у головастиков из контрольной группы, тогда как головастики, развивавшиеся в аквариумах с имитацией загрязнения свинцом, имели наименьшее значение Су практически по всем признакам. К 43й стадии развития картина меняется с точностью до наоборот: наиболее вариабельно развитие в аквариумах с загрязнением металлами, а в контрольных — значимо меньше. У остромордой лягушки к 39 стадии наиболее вариабельно развитие происходит в аквариумах с железосодержащими сплавами. У серой жабы и на 39й стадии и на 43й наибольший уровень изменчивости наблюдался у головастиков развивавшихся в свинецсодержащих аквариумах, а наименьшийжелезосодержащих аквариумах.

Рисунок 17. Зависимости изменения общего коэффициента вариации (ось У), рассматриваемого как показатель вариабельности развития зародышей при том или ином типе загрязнения на определенной стадии развития, от коэффициента детерминации (ось X), показателя общей коррелированности признаков развивающегося организма. Сплошная линия — контроль, длинный пунктир — группа «железо», короткий пунктир — группа «свинец». Черным цветом показана 39-я стадия развития, красным — 43-я.

Взаимодействие развивающихся структур зародыша может быть тем самым регуляторным механизмом, который обеспечивает целостность развития, сохраняя пропорциональность развивающихся частей тела головастиков (Северцова, 2007). Наиболее наглядно эту закономерность позволяет продемонстрировать анализ зависимости изменения общего коэффициента вариации, рассматриваемого как показатель вариабельности развития зародышей при том или ином типе загрязнения на определенной стадии развития, от коэффициента детерминации, показателя общей коррелированности развивающегося организма. У травяной лягушки и на 39й и на 43й стадиях развития контрольной группы при незначительном увеличении изменчивости коррелированность развития так же незначительно возрастает (рис. 17). Иная картина наблюдается, когда развитие происходит на 39й стадии в условиях имитации загрязнения: при загрязнении свинцом существенное увеличение вариабельности ведет к увеличению коррелированности развития, а при загрязнении железом, наоборот, по мере возрастания изменчивости коррелированность падает. К 43 й стадии эта закономерность нивелируется и только в условиях имитации загрязнения железом демонстрирует пропорциональную зависимость: чем выше изменчивость — тем выше коррелированность. Развитие же в условиях имитации загрязнения свинцом более или менее напоминает контрольную группу. У остромордой лягушки характер зависимости коррелированности от изменчивости в условиях имитации загрязнения близок к контрольной группе. Развитие жабы на 39й стадии в нормальных условиях демонстрирует незначительное возрастание коррелированности развития по мере незначительного повышения вариабельности развития. В условиях же имитации загрязнения наблюдается обратная зависимость: увеличение коррелированности развития ведет к уменьшению ее вариабельности. К 43й стадии развития такая закономерность сохраняется только для головастиков, чье развитие проходило под воздействием ионов свинца. Развитие же в аквариумах с имитацией загрязнения железом не показало зависимости вариабельности развития от ее коррелированности.

Таким образом, для всех исследованных видов амфибий развитие в условиях имитации загрязнения водоемов металлами не оказывает существенного влияния ни на пропорциональность, ни на коррелированность, ни на вариабельность развития. Влияние на общие размеры головастиков, напротив, оказывается значимым. При этом воздействие имитации загрязнения свинцом замедляет развитие: головастики всех исследованных видов характеризуются меньшими размерами. Развитие в условиях загрязнения железом приводит к формированию крупных головастиков серой жабы, тогда как у травяной лягушки, так же как и свинец, железо замедляет ростовые процессы, что приводит к формированию не крупных особей. Однозначной зависимости для остромордой лягушки не удалось выявить, поскольку не было проанализировано достаточного количества стадий развития. Однако по имеющимся результатам можно предположить, что влияние загрязнения металлами на развитие головастиков Rana arvalis более существенно: уже к 39й стадии головастики, развивающиеся в условиях имитации загрязнения железом крупнее, а развивающиеся в условиях имитации загрязнения свинцом — значимо мельче. Наблюдаемые межвидовые различия стоит рассматривать вне связи с характером загрязнения. Скорее всего, причиной их возникновения являются видовые различия и различия в условиях проведения эксперимента.

Аналогичные результаты воздействия железа и свинца на размерные характеристики головастиков подтверждаются некоторыми исследованиями, проведенными на растворах солей. По сравнению с контрольной группой, головастики, развивающиеся под воздействием оксида железа II в виде нанопорошка и влияние сульфата железа имели большие размеры, хотя сроки развития головастиков совпадали с контрольной группой (Пескова 2003; Шиян, 2011). При воздействии ионов свинца показан результат аналогичный нашему: снижение веса и отставание в развитии у головастиков X. laevis (Berzins, Bundy, 2002), Rana catesbeiana (Rice, 1998) и Bufo fowleri (Barrett et al., 2010).

Спектрохимический анализ тканей головастиков.

Формирование проб для проведения спектрохимического анализа методически не позволяло проанализировать каждого головастика в отдельности. Поэтому в каждую пробу отбиралось по 7−12 головастиков из одной повторности для каждой серии эксперимента. Поскольку эти данные статистически нерепрезентативны, было выполнено качественное сравнение полученных результатов.

Прежде всего, следует отметить, что количество и железа и свинца у головастиков, содержавшихся в воде нативного водоема в целом меньше, чем у головастиков развивавшихся в экспериментальных аквариумах (табл. 3). Так, двукратные различия в уровне содержания ионов железа в тканях тела головастиков травяной лягушки контроля и эксперимента наблюдаются на 39й стадии. У остромордой лягушки и у серой жабы аналогичные различия выражены еще сильнее: разница между содержанием железа в эксперименте и контроле составляет около 6 и 8 раз, соответственно.

В тоже время, анализ других тканей головастиков показал неравномерное накопление анализируемых элементов в разных системах организма. И железо, и свинец наиболее интенсивно накапливаются в кишечнике. При этом, концентрация и железа и свинца в кишечнике, может превышать таковую в теле головастика от 5,6 раз для 39й стадии остромордой лягушки до 19,37 раз для 34 стадии развития головастиков серой жабы. Не менее существенны накопления ионов и железа и свинца в тканях печени, анализ которой проведен только для 43 стадии у травяной лягушки и 34 стадии серой жабы. Пробы «тело» и «хвост» содержат меньшие концентрации этих элементов во всех сериях и на обеих анализируемых стадиях. Этот факт является интересным, поскольку в этих пробах повышение концентрации исследуемых элементов возможно только либо через пищеварительный тракт с последующим разносом кровью, либо через жабры, являющиеся, как и кожа, основным диффузионным органом головастика. Тем не менее, анализ тканей жабр, для головастиков бурых лягушек на 43 стадии развития и для жабы на 32−34 стадии показал еще меньше содержание этих элементов.

Сравнение 39 и 43 стадий развития травяной лягушки, и 26 и 32−34 стадий, соответственно, для серой жабы, продемонстрировало накопление исследуемых металлов по мере онтогенеза. Это свидетельствует об отсутствии или не совершенстве механизмов выведения их из организма. Хотя и может быть причиной недостаточно репрезентативной выборки для спектрохимического анализа. Однако, в отличие от жабы, у травяной лягушки наблюдается не столь интенсивное накопление металлов по мере онтогенеза. Напротив, в ряде случаев концентрация железа в «теле» и в кишечнике снизилась на более поздней стадии развития. Понижение концентрации железа позволяет предположить наличие некоего механизма выведения из организма избытка этого элемента. Ограниченное количество анализов по остромордой лягушке позволяет только отметить, что и у этого вида к 39й стадии развития преимущественное накопление и железа и свинца происходит в кишечнике.

Кроме вышеизложенных результатов спектрохимического анализа, проведенного на головастиках не имевших видимых уродств, анализ накопления ионов железа и свинца проводились и для головастиков, для которых были отмечены явные аномалии развития (табл. 4). Для проб были отобраны головастики травяной лягушки и серой жабы на 43 и 34 стадиях, соответственно, а для остромордой лягушки — только на 39 стадии. Спектрохимический анализ тканей тела таких головастиков (при удаленном кишечнике) показал, что концентрация и железа и свинца очень высока.

R arvalis ст. 39 R temp, ст. 39 R temporaria ст. 43 В bufo ст. 26 В bufo ст. 33 Вода.

Тело мкг/г Киш-к мкг/г Тело мкг/г Тело мкг/г Киш-к мкг/г Хвост мкг/г Печень мкг/г Жабры мкг/г Тело мкг/г Киш-к мкг/г Тело мкг/г Киш-к мкг/г Хвост мкг/г Печень мкг/г Жабры мкг / г мкг/л.

Fe-Контроль 334 1969 3390 1994 24 633 2499 11 191 1947 3772 73 069 340.

Fe (группа he) 2625 47 170 6862 4261 84 297 5772 43 299 7586 7379 115 305 370.

Pb-Контроль 14.1 12.5 8.1 1.7 28 4 23 5.5 4.8 3.1 13.3 2.3 31.5 3,1 7.6 4.8 0,2.

РЬ (группа РЬ) 1010 242.0 30.9 322 4235 325 745 139 35 182 277 2609 168 509 1056 0.3.

Таблица 3. результаты спектрохимического анализа тканей головастиков .

СП.

Rana temporaria Rana arvalis Bufo bufo.

АНОМАЛИЯ АНОМАЛИЯ АНОМАЛИЯ.

Тело 1ело 1ело мкг/г мкг/г мкг/г.

Fe — контроль 4208 883.

Feэксперимент 19 232 25 775.

РЬконтроль 14,4 15 10.

РЬ-эксперимент 68,3 7155,4 414,2.

Таблица 4. Результаты спектрохимического анализа аномальных головастиков на 39 стадии развития, развивавшихся в условиях имитации загрязнения железо или свинец содержащими сплавами в сравнении с контролем.

В ряде случаев она превышает даже концентрацию этих элементов в тканях тела нормальных головастиков, развивавшихся в условиях имитации загрязнения водоема. Можно предположить, что одной из причин формирования аномалий в экспериментальных группах было именно крайне высокое содержание в их тканях ионов этих металлов. Тем не менее, это предположение требует дальнейших исследований.

Приведенные результаты свидетельствуют о преимущественно пероральном поступлении металлов в организм головастиков. Это подтверждается и исследования других авторов (Миссюра, Марченковская, 2002), показавшими высокие концентрации некоторых металлов в разных отделах пищеварительного тракта озерной лягушки и зеленой жабы. Однако, незначительное количество металлов в тканях жабр свидетельствует о том, что это далеко не единственный путь поступления ионов металлов в организм личинок бесхвостых амфибий. Некоторое их количество может попадать вместе с водой, которую головастики постоянно фильтруют, отцеживая пищевые частички и пропуская воду через жабры. Тем не менее, концентрация металлов в тканях жабр настолько не велика, что рассматривать этот путь проникновения ионов в организм не целесообразно. Как отмечалось выше (см. обзор литературы) головастики являются эврифагами. В естественных условиях они часто питаются детритом и донными отложениями (Северцов, 2008), а основное депо металлов в водоемахдонные осадки. Косвенно высказанное положение подтверждается.

При экстраполяции результатов данного эксперимента на природные условия надо учитывать, что распространение металлов депонированных в теле головастиков по пищевой цепи ограниченно.

Основные хищники, уничтожающие головастиков — это личинки.

ОШБйёае и АезКшёае, которые метаморфизируют и следовательно, выносят какую-то часть металлов из водоемов. Выносят свою часть и метаморфизировавшие головастики. Однако едва ли этот вынос играет заметную роль в круговороте веществ. Можно считать, что головастики не окончательное депо металлических поллютантов в антропогенных биоценозах.

Гистохимический анализ.

Целью проведения гистохимического анализа была идентификация мест локализации ионов железа и свинца в тканях головастиков. К сожалению, подобрать методику гистохимического анализа на ионы свинца нам не удалось. Поэтому анализ был выполнен только для ионов железа. О правильности выбора нами методики для идентификации мест накопления экзогенного железа свидетельствует положительная реакция красителя с содержимым кишечника (рис. 18). Следовательно, качественная реакция в других тканях организма будет демонстрировать наличие ионов железа, попавших в организм головастиков в результате контакта с загрязнителем — ржавыми гвоздями.

В стенке кишечника положительная реакция на железо выявляется в области апикальной, обращенной к содержимому кишечника, поверхности энтероцитов (рис. 19). Положительное окрашивание демонстрируют отдельные участки тонкого кишечника. Продолжительность окрашивания может быть различной. В ряде случаев можно различить непрерывные линии включений железа в стенке кишечника. Наличие визуально различимых полос окрашивания, свидетельствует об интенсивном всасывании железа стенкой кишечника. Помимо выявленных сплошных полос поглощения железа стенкой кишечника, положительную реакцию на железо могут иметь отдельные клетки. В этом случае клетка окрашивается целиком и содержит гранулы темного пигмента (рис. 19). Вероятно, эти клетки являются макрофагами присутствующими в норме в стенке кишечника.

Rana temporaria Bufo bufo.

Контроль Эксперимент Контроль Эксперимент.

43 стадия 43 стадия 34 стадия 32 стадия.

Кишечник + + +.

Печень + + + +.

Вторичные почки — - ;

Жабры —.

Таблица 5. Результаты гистохимического анализа.

Не менее четкая качественная реакция на трехвалентное железо выявлена в клетках печени (рис. 20). Полученный результат согласуется с данными по стереохимическому анализу тканей печени и является биологически значимым, поскольку печень функционально связана с метаболизмом железа и является органом его естественного депонирования. Депозиты железа в печени головастиков выявляются в ассоциации с клетками, содержащими пигмент черного-бурого цвета. Это позволяет рассматривать наиболее вероятным кандидатом на роль аккумулирующих трехвалентное железо клеток можно рассматривать меланин-содержащие макрофаги или купферовы клетки печени (рис. 21). Данные клетки крупнее обычных гепатоцитов. В печени они функционируют как макрофаги и способны к аккумуляции железа в составе гемоседерина и ферритина. Депозиты железа зачастую образуют скопления.

Во вторичных почках накопление соединений трехваленного железа обнаружено не было, как и в клетках кожи (рис. 22). Это не тривиальный результат. Почки связаны с выведением железа из организма и факт обнаружения его в секрете мог бы указывать на избыток железа в организме.

Таким образом, положительная реакция с трехвалентным железом обнаруживается в кишечнике, в тканях, образующих эпителиальную выстилку кишечника и в печени. Кроме того, гистохимическое исследование различных органов головастиков было направлено на обнаружение отличий в аккумуляции железа в тканях животных, чье развитие проходило в аквариумах с имитацией загрязнения железосодержащими сплавами в сравнении с контрольной группой. Предполагалось. Что уровень железа в тканях опытных животных должен быть выше за счет увеличения поступления в организм экзогенного железа. Сравнение интенсивности окрашивания содержимого кишечника при выявлении соединений трехвалентного железа указывает на превышение их концентрации в кишечниках опытных животных. Однако характерные полосы всасывания железа обнаруживаются и в контрольной и в опытной группах, что говорит о высоком содержании железа в пищевых массах у обеих групп. Возможно, кормление головастиков проводилось отваренной крапивой с повышенным содержанием железа. Специальных исследований на этот счет не проводилось. * Не смотря на это, интенсивность окрашивания в препаратах опытных животных выше и всасывание железа в других органах головастиков контрольной группы не наблюдается.

Таким образом, гистохимический анализ тканей головастиков на содержание в них ионов трехвалентного железа подтвердил результаты, полученные на основе спектрохимического анализа: основной путь поступления в организм головастика ионов металлов, в данном случае железа, — алиментарный. У личинок бесхвостых амфибий нет эффективного механизма выведения металлов, тем не менее, есть механизм смягчающих токсическое действие переизбытка железа. В качестве такого механизма выступает процесс поглощения ионов металлов макрофагами и депонирование в печени.

Рисунок 18. Результаты гистохимического анализа. Положительная реакция красителя с содержимым кишечника в контроле (А) и в опыте (Б), ск — содержимое кишечника, стк — стенка кишечника.

Рисунок 19. Результаты гистохимического анализа. А — Аккумуляция ионов железа меланин-содержащими клетками кишечника головастика травяной лягушки, предположительно макрофагамиБ — Аккумуляция ионов железа клетками стенки кишечника головастика серой жабы (контроль) — В, Г — аккумуляция ионов железа клетками стенки кишечника головастика серой жабы (группа «железо»). Депозиты железа показаны желтыми стрелками, пигентная гранула макрофага — зеленой стрелкой. (Х1000).

Рисунок 20. Результаты гистохимического анализа. Головастик ИЛетрогапа из контрольной группы, срез через печень. Положительная реакция на железо ассоциирована с пигментсодержащим клетками (желтые стрелки), Х400.

•Г* «г.

Г ^ % «V'» т+ ш.".

Ш9 щ: л.

• # # * мь чРшм — т. ф.

Рисунок 21. Результаты гистохимического анализа. Аккумулирующие трехвалентное железо меланин-содержащие макрофаги или купферовы клетки печени (увеличенный фрагмент рис. 20). ч л л / а 4 7.

— Ч-* К Г Г г/ «<

•%".

• <, ."Л.

Ш.

Г:

9 |*К 1.

I ^ «у»" л/ Г.

• м к у г- 4 ч 1 «И > •.

Рисунок 2 2. ИЛетрогапа, срез в трансверзальной плоскости через почку. Окрашивание по Перлсу, реакция на трехвалентное железо негативная. Х400.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Целью данной работы было изучение аномалий развития головастиков в условиях загрязнения нерестовых водоемов в г. Москве и влияния на их развитие тяжелых металлов, свинца и железа. Были изучены головастики трех аборигенных видов: травяной лягушки (Rana temporaria L.), остромордой лягушки (Rana arvalis Nills.) и серой жабы (Bufo bufo L.). Объектом изучения были выбраны стадии, в течении которых головастики спокойно перемещаются в водоеме, активно питаются, но еще не достигли предметаморфозных стадий развития. Выбор этих стадий был обусловлен тем, что в этот период онтогенеза нет крупных морфологических изменений, снижающих устойчивость к повреждающим воздействиям среды.

Увеличение частоты аномалий развития в московских водоемах по сравнению с подмосковными указывает на более сильную загрязненность их. Сокращение частоты уродств по мере онтогенеза свидетельствует о гибели головастиков с резкими уклонениями развития и, тем самым, о стабилизирующем отборе нормальных головастиков. Важно отметить ограниченный набор аномалий развития не коррелирующий с частотой их возникновения. Часть аномалий, таких как «Деформация осевого комплекса» и «нарушения развития конечностей» возникают в результате повышенной чувствительности морфогенетических процессов к повреждающему действию поллютантов. Нарушения покровов и строения кишечника объясняются тем, что эти структуры подвергаются наиболее сильному воздействию поллютантов. Загрязненная вода омывает головастиков, а в кишечник поллютанты попадают с пищей. Сильное отставание в развитии без видимых отклонений в строении тела, по-видимому, обусловлено общим подавлением метаболизма.

Вместе с тем, эпигеномные процессы развития устойчивы к отравлению тяжелыми металлами, в данном случае железом и свинцом. Повышенная концентрация их ионов в организмах всех трех исследованных видов не оказывает существенного влияния на вариабельность развития, изменчивость и коррелирован ность пропорций тел головастиков. Значимо только влияние на размеры тела. Свинец ингибирует рост головастиков всех трех видов. Реакция на повышение концентрацию железа видоспецифична: рост и развитие головастиков травяной лягушки замедляется, так же как под действием свинца. У серой жабы, напротив, ускоряется. Недостаток материала по действию свинца и железа на головастиков остромордой лягушки не позволяет дать однозначную оценку их влияния на рост и развитие головастиков этого вида. На стадии 39 головастики, развивавшиеся в условиях имитации загрязнения железосодержащими сплавами были крупнее, чем головастики в «контроле» и при развитии в условия имитации загрязнения свинецсодержащими сплавами.

Тяжелые металлы неравномерно распределены в теле головастиков. Согласно спектрохимическим анализам основное их количество накапливается в кишечнике и в печени, в других частях тела головастиков — меньше. Эти данные свидетельствуют о том, что основная масса поллютантов, по-видимому, не только исследованных в данной работе, но и других, попадает в организм головастиков вместе с пищей, а не путем диффузии через жабры или покровы тела. Низкие концентрации ионов металлов в жабрах — органе, наиболее проницаемом для любых растворенных в воде солей и окислов, подтверждают алиментарный способ поглощения поллютантов. Об этом же свидетельствуют наблюдения за скоблением головастиками ржавых гвоздей и свинцовой дроби. Скобление предметов на дне водоемов и захватывание пищи со дна — форма пищевого поведения головастиков исследованных видов. Спектрохимический анализ головастиков с тератогеными нарушениями развития показал очень высокое накопление в них ионов и железа и свинца. Это позволяет предположить, что тератогенез может быть обусловлен индивидуальной реакцией головастиков, а не концентрацией металлов в окружающей среде.

Гистохимический анализ распределения ионов железа в организмах головастиков подтвердил и уточнил данные о распределении этого металла в тканях. Основной путь поступления метала в организмы личинок травяной лягушки и серой жабы — алиментарный. У головастиков нет эффективного механизма выведения ионов металлов из организма. Метанефрос головастиков не участвует в этом процессе. Тем не менее, существуют механизмы, смягчающие вредное действие переизбытка железа. Макрофаги поглощают и накапливают ионы этого металла. В печени железо накапливают меланин-содержащие макрофаги, депонирующие трехвалентное железо.

Таким образом, можно выделить три тесно взаимосвязанных аспекта полученных результатов: физиологический, онтогенетический и экологический. Физиологическое действие переизбытка концентрации железа и любой концентрации свинца в организмах головастиков состоит в нарушениях обмена веществ, отрицательно сказывающихся на росте и развитии выживших особей. Физиологическое действие железа видоспецифично. Индивидуальные особенности головастиков проявляются повышением уровня тератогенеза, возможно, вследствие индивидуального повышения уровня поллютанта в организме. Однако существуют и механизмы смягчающие вредные эффекты переизбытка железа в организмах головастиков — поглощение ионов этого металла макрофагами и депонирование его в печени.

Онтогенетический аспект включает зависимость реакции головастиков на физиологическое действие металлов от стадии онтогенеза, и дифференциальную реакцию разных органов и тканей на повреждающее действие этих металлов. Степенью развития подсистем организма обусловлены специфичность проявления уродств на соответствующих стадиях онтогенеза. Этим же обусловлено отсутствие эффективного выведения избытка металлов из организма головастиков. Мезонефрос (вторичная почка), в отличие от метанефроса, не выполняет эту функцию. Наиболее устойчивым к воздействию поллютантов оказался внешний облик головастиков. Отделы их тела по мере онтогенеза развиваются коррелированно. А действие поллютантов проявляется лишь в изменениях размеров всего организма. По-видимому, эта устойчивость объясняется высокой эпигенетичностью процессов роста подсистем организма.

Экологический аспект обусловлен прежде всего приспособленностью головастиков к развитию в определенном типе водных биоценозов, в частности способом добывания корма. Соскребывание с поверхности подводных предметов и потребление детрита приводит к поступлению существенно больших количеств металлов, чем их могло бы проникнуть в организм из воды нерестовых водоемов. Способом питания обусловлено преимущественное накопление металлов в кишечнике и в печени. Количество металла, попавшее в процессе питания в организм определяло ингибирование процессов роста, вызывало тератогенез или являлось причиной смертности. К сожалению, этот тезис лишь частично подтвержден в данной работе и требует дальнейших многоплановых исследований.

Все три аспекта представляют собой важные компоненты адаптивного реагирования развивающегося организма на неспецифическое воздействие окружающей среды. выводы.

1. Частота встречаемости аномалий развития головастиков травяной и остромордой лягушек развивающихся в черте города Москвы и за ее пределами на стадии вылупления примерно одинаковы. Разнообразие типов аномалий по мере развития сокращается.

2. Наиболее распространенными аномалиями являются «деформации осевого комплекса» и «темпы развития». Гистологический анализ аномалии «деформации осевого комплекса» выявил нарушения сомитогенеза.

3. Экспериментальные исследования по имитации загрязнения водоема железои свинецсодержащими сплавами показали, что тяжелые металлы поступают в организм с пищей и, проникая через стенку кишечника, накапливаются в печени. Гистохимический анализ не выявил возможный путь выведения ионов железа через выделительную систему.

4. Влияние исследованных металлов сказывается только на линейных размерах головастиков: накопление железа приводит к увеличению их значений, а свинца — к уменьшению. При этом поступление в организм ионов железа и свинца не оказывает влияния на пропорциональность частей тела развивающихся зародышей, и слабо влияет на изменчивость и коррелированность морфометрических признаков.

5. Пероральное накопление ионов металлов в теле головастиков указывает на необходимость учитывать при разработке ПДК для водоемов, особенно рыбохозяйственного назначения, концентрацию поллютантов как в воде, так и в донных отложениях.

1- Абакумов В. А., Свирская Н. Л., 1985. Экологические модификации зоопланктонных сообществ в условиях антропогенных воздействий // Информационный бюллетень по проблеме III «Охрана экосистем (биоценозов) в ландшафтах». Братислава. Вып. 4. С. 69−72.

2- Банников А. Г., Исаков ю.А., 1967. О земноводных в г. Москве II Животное население Москвы и Подмосковья, его изучение, охрана и направленное преобразование. М. из-во МОИП. С. 92−96.

3- Беляков В. В., Романов Ю. М., Никитина Р. Е., Романова А. М. 1983. Редкие виды наземных позвоночных животных Калининградской области. И В: Зиновьев В. И., Иноземцев А. А., Томашевский К. Е., Сорокин М. Г. Влияние антропогенных факторов на структуру и функционирование экосистем. Калинин.

4- Вершинин В. Л. 2006. Амфибии и рептилии городской агломерации Екатеринбурга II Экология города. Екатеринбург: УрГУ, С.108−119.

5- Голдь 3. Г., Глушенко Л. А., Морозова И. И., Шулепина С. П., Шадрин И. А. 2005. Биологические примеры оценки качества вод в разработах нормативов предельно допустимых вредных воздействий. В: биотехнология, экология, охрана окружающей среды. МОИП.

6- Государственный доклад «О состоянии окружающей природной среды РФ в 1998 г» //официальный сайт Госкомэкологии России http//www.ecocom.ru.

7- Дабагян Н. В., Слепцова JI.A., 1975. Травяная лягушка Rana temporaria L.// Объекты биологии развития. М.: Наука. С. 442−462.

8- Даревский И. С., Орлов Н. JI. 1988. Редкие и исчезающие животные — земноводных и пресмыкающиеся II Высшая школа.

9- Драбкова В. Г., Стравихнская Е. А. Трансформация органического и биогенных веществ при антропогенном эвтрофировании озер. 1989.

10- Дунаев Е. А., Орлова В. Ф. Земноводные и пресмыкающиеся России. Атлас-определитель. Фитон+. 2012.

11- Клёнкин А. А., Каталевский Н. И. Кораблина И. В., Геворкян Ж. В., Корпакова И. Г. 2004. Корреляция содержания тяжелых металлов в различных компонентав экосистемы Азовского моря. В Научные труды Международного Биотехнологического Центра Московского Государственного Университета им. М. В. Ломоносов. «Биотехнология — охране окружающей среды. Спорт и Культура.

12- Ковда В. А., Керженцев А. С., 1983. Экологический мониторинг: концепция, принципы организации. В Соколов ВЕ региональный экологический мониторинг. Наука.

13- Кренева С. В., 1984. Систематизация методов биологического анализа загрязненных вод в сложных гидрологических условиях II Самоочищающиеся воды и миграция загрязнений по трофической цепи. М. Наука. С. 75−80.

14- Макаеева В. М., Белоконь М. М., Смуров А. В. Эколого-генетический подход к охране животных антропогенных экосистем. МГУ. 2011.

15- Мелехова О. П. Принципы эмбриомониторинга водной среды. В: биотехнология, экология, охрана окружающей среды. МОИП. 2005.

16- Мелехова О. П., Сарапульцева Е. И. Биологический контроль окружающей среды. Биоиндикация и биотестирование. ACADEMIA. 2008.

17- Мисюра А. Н., Марченковская А. А. Влияние тепловых электростанций на накопление тяжелых металлов в органах и тканях рзличных видов земноводных. Вюник Дншропетровського ушверситету. Бюлопя, Еколопя. 10:1−56−60. 2002.

18- Моисеенко Т. И. Водная экотоксикология. Теоритические и прикладные аспекты. Наука. 2009.

19- Неустроева Н. С. Морфологическая изменчивость скелета представителей рода Rana в условиях антропогенной дестабилизации среды. Автореферат. 2012.

20- Николайкин Н. И., Николайкина Н. Е., Мелехова О. П. Экология. Дрофа. 2009.

21- Новиков В. В., Семенко Б. Ю., Ноздрина JI. А., Спрядышева А. В. К вопросу об определении тяжёлых металлов в бассейне нижней волги. В: Экологические проблемы загрязнения водоемов Волжского бассейна, современные методы и пути их решения. Волгоград 2004.

22- Одум Ю. П. Экология. Мир. 1986.

23- Падалка С. М., 2006. Влияние слабых электромагнитных и химических воздействий на эмбриональное развитие амфибий // Дисс. на соискание ученой степени к.б.н. М. 108 С.

24- Пенькова И. Н., Ривняк Т. Т., Мединцев А. А. Содержание тяжелых металлов в водных источниках, применяемых в животноврдстве пригородной зоны. В: Экологические проблемы загрязнения водоемов Волжского бассейна, современные методы и пути их решения. Волгоград 2004.

25- Пескова Т. Ю., 2003. Сравнение токсичности сульфата железа для головастиков двух видов амфибий //Известия ВУЗов. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. Приложение. № 4. С. 61−68.

26- Пикулик М. М. 1985. Земноводные Белоруссии // Минск. Наука и Техника. 189 С.

27- Писанец Е. М., Ткаченко О. В. Материалы по личиночному развитию травяной Rana (Rana) temporarai и остромордой, Rana (Rana) arvalis лягушек (Amphibia, Ranidae) фауны Украины. Матер1али Першо1 КонференщУ УкраУнського Герпетолопчного Товариства. 10−12 жовтня 2005 р., Ки1 В. -2005.

28- Росолимо J1. JI. Изменеие лимнических экосистем под воздействием антропогенного фактора. Наука. 1977.

29- Роус С., Роус Ф. 1961. Выделение головастиками веществ, задерживающих рост // Карельская АССР, 140С.

30- Ручин А. Б., 2004. Изучение действия температуры и освещенности на рост и развитие лчинок травяной лягушки (Rana temporaria) // Зоологический журнал, т. 83, № 12, стр. 1463- 1467.

31- Северцов A.C. 2008. Эволюционный стазис и микроэволюция // М. КМК. 174 С.

32- Северцова Е. А. 2002. Адаптивные процессы и изменчивость эмбриогенеза бесхвостых амфибий в городских популяциях // Автореф.дис.канд.биол.наук. М.: Из-во МГУ. 24с.

33- Сурков А. Л., Шишкунов В. М., Машакарян С. А. Антропогенное загрязнение и деградация водных экосистем. В: Экологические проблемы загрязнения водоемов Волжского бассейна, современные методы и пути их решения. Белгоград 2004.

34- Федоров JI.A. Яблоков A.B., 1999. Пестицидытоксический удар по биосфере и человеку II М. Наука. 461 с.

35- Ходяков Е. А. Якубов В. В. Марисов Д. Б. Влияние токсического загрязнения на экологическое состояние водоема. В: Экологические проблемы загрязнения водоемов Волжского бассейна, современные методы и пути их решения. Волгоград 2004.

36- Шапошникова И. А., Болгова И. В. Таблица Менделеева в живых организмов. Бином. 2010.

37- Шарыгин С. А. Ушаков В.А. 1979. Амфибии и рептилии в крупных городах II Эколого-фаунистическое исследование в нечерноземной зоне РСФСР. Саранск. Вып. 2. С. 83−96.

38- Шварц С. С. 1976. Эффект группы в популяциях водных животных и химическая экология. II М.: Наука. 151с.

39- Щербакова Е. Н. Оценка содержания некоторых тяжелых металлов в органах и тканях русского осетра и возможных последствий загрязнения вод Волги на его организм. В: Экологические проблемы загрязнения водоемов Волжского бассейна, современные методы и пути их решения. Волгоград 2004.

40- Шиян А. А., 2011. Изменения популяционных характеристик озерной лягушки (Rana ridibunda Pall) при обитании в прудах-испарителях сахарных заводах // Научный журнал КубГАУ. № 67 (03). С. 1−10.

41- Alexander P., Bahret М. J., Chavez J., Courts G., D’Alessio N. S. Biologia. Prentice Hall. 1992.

42- Barrett M.A., Brown J.L., Morikawa M., Labat J.L., Yoder A.D. 2010. Modeling the effects of illicit rosewood logging in Madagascar II A call for CITES designation. Science, v.328. p. 1109−1110.

43- Berzins, D.W., Bundy, K.J., 2002. Bioaccumulation of lead in Xenopus laevis tadpoles from water and sediment // Environ. Int. v. 28, p.69−77.

44- Bancroft, B. A., N. J. Baker and A. R. Blaustein. 2008. A metaanalysis of the effects of ultraviolet В radiation and its synergistic interactions with pH, contaminants, and disease on amphibian survival II Conservation Biology. V. 22 (4). P. 987−996.

45- Blaustein A. R., Belden L. K. Amphibian defenses against ultraviolet-B radiation. Evol. and Dev. 5: l-89−97. 2003.

46- Blaustein A. R., Belden L. K., Olson D. H., Green D. M., Root T. L., Kiesecker J. M. Amphibian breeding and climate change. Conservation Biology 15:6- 1804−1809. 2001.

47- Blaustein A. R., Hays J. В., Hoffman P. D., Chivers D. P., Kiesecker J. M., Leonard W. P., Marco A., Olson D. H., Reaser J., Anthony R. G. DNA repair and resistance tu UV-B radiation in western spotted frogs. Ecol. Applications. 9:3−1100−1105. 1999.

48- Blaustein A. R., Hoffman P. D., Hokit D. G., Kiesecker J. M., Walls S. C., Hays J. B. UV repair and resistance to solar UV-B in amphibian eggs: A link to population declines? Proc. Natl. Acad. Sci. 91 -1791−1795. 1994.

49- Blaustein A. R., Hoffman P. D., Kiesecker J. M., Hays J. B. DNA repair activity and resistence to solar UV-B radiation in eggs of the red-legged frog. Conservation biology 10:5- 1398−1402. 1996.

50- Blaustein A. R., Johnson P. T. J. The complexity of deformed amphibians. Front. Ecol. Environ. l:2−87−94. 2003.

51- Blaustein A. R., Kiesecker J. M. Complexity in conservation: lessons from the global decline of amphibian populations. Ecol. Letters. 5−597−608. 2002.

52- Blaustein A. R., Kiesecker J. M., Chivers D. P., Anthony R. G. Ambient UV-B radiation causes deformities in amphibian embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. 94−13 735−13 737. 1997.

53- Blaustein A. R., Kiesecker J. M., Chivers D. P., Hokit D. G., Marco A., Belden L. K., Hatch A. Effects of ultraviolet radiation on amphibians: field experiments. Amer. Zool. 38:799−812. 1998.

54- Blaustein A. R., Romansic J. M., Kiesecker J. M., Hatch A. C. Ultraviolet radiation, toxic chemicals and amphibian populations declines. Diversity and Distributions 9−123−140. 2003.

55- Blaustein A. R., Romansic J. M., Scheessele E. A. Ambient levels of ultraviolet-B radiation cause mortality in juvenile western toads, Bufo boreas. Am. Midi. Nat. 154−375−382. 2005.

56- Clark, K. L., LaZerte B. A laboratory study on the efects of aluminium and pH on amphibians eggs and tadpoles. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 42, 1544−1551. 1985.

57- Clarke B. Anfibios. Altea. 1993.

58- Crawshaw G. Anurans (Anura, Salientia): Frogs, Toads. In: Fowler M. E., Miller R. E. Zoo and wild animal medicine. Fifth edition. Saunders. 2003.

59- Cooke L., Elsdale T., 1980. Somitogenesis in amphibian embryos. 111. Effects of ambient temperature and of developmental stage upon pattern abnormalities that follow short temperature shocks II J. Embryol. Exp. Morphol. V. 58. p. 107−118.

60- Dawson D. A., McCormick C. A., Bantle J. A. Detection of teratogenic substances in acidic mine water samples using the frog embryo teratogenesis assay-Xenopus (FETAX)// J. Appl. Toxicol. 5(4):233−44. 1985.

61- Elsdale T., Pearson M., Whitehead M., 1976. Abnormalities in somite segmentation following heat shock to Xenopus embryos II J. Embryol. Exp. Morphol. V. 35. p. 625−635.

62- Enkerlin E. C., Cano G., Garza R. A., Vogel E. Ciencia ambiental y desarrollo sostenible. Thomson. 1997.

63- FETAX, 1991. Standart guide for conduction the frog embryo teratogenesis assaysXenopus (Fetax) II Amer. Soc. for test, and mat. P. 1−11.

64- Forstner, U., Wittman G. T. W. Metal pollution in the aquatic environment. 2nd ed. Springer-Verlag, New York. 1981.

65- Freda, J., Cavdek, V. & McDonald, D. Role of organic complexation in the toxicity of aluminum to Rana pipiens embryos and Bufo americanus tadpoles. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 47,.

217−224. 1990.

66- Garcia T. S., Romansic J. M., Blaustein A. R. Survival of three species of anuran metamorphs exposed to UV-B radiation and the pathogenic fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Dis. Aquat. Org. 72- 163−169. 2006.

67- Gosner K. L. A simplified table for staging anuran embryos and larvae with notes on identification. Herpetologica. 16(3): 183−190. 1960.

68- Hatch A. C., Blaustein A. R. Combined effects of UV-B, nitrate, and low pH reduce the survival and activity level of larval cascades frogs (Rana cascadae). Arch. Environ. Contam. Toxicol. 30−494−499. 2000.

69- Humphreys D. J. Toxicologia veterinaria. Interamericana McGraw-Hill. 3a edicion. 1990.

70- Jepson L. Medicina de animales exoticos. Elsevier. 2011.

71- Kaplan H. M., Arnholt T. J., Payne J. E. Toxicity of lead nitrate solutions for frogs {Rana pipiens). Lab. Animal Care, v. 17, p.240−246. 1967.

72- Lanza Espino G., Hernandez Pulido S., Carbajal Perez J. L. Organismos indicadores de la calidad del agua y de la contaminacion (Bioindicadores). PyV. 2000.

73- Love R.M., 1980. The chemical biology of fishes II London Acad. Press. V. 2. p. 2−943.

74- Macias G., Marco A., Blaustein A. R. Combined exposure to ambient UV-B radiation and nitrite negatively affect survival of amphibian early life stages. Sci. Total Environ. 385−55−65. 2007.

75- Mann R., Bidwell J. Toxicological issues for amphibians in Australia. In: Campbell A. Declines and disappearances of australian frogs. Environmenat Australia. 1999.

76- Moran J. M., Morgan M. D., Wiersma J. H. Introduction to environmental science. Second edition. Freeman. 1986.

77- Nixdorf W. L., Taylor D. H., Isaacson L. G. Use of bullfrog tadpoles (Rana catsbiana) to examine the mechanisms of lead neurotoxicity. Amer. Zool. 37:363−368. 1997.

78- Plowman, M. C., Grbac-Ivankovic S., Martin J., Hopfer S. M., Sunderman Jr. F. W. Malformations Persist After Metamorphosis ofXenopus leavis Tadpoles Exposed to Ni 2+, Co 2+, or Cd 2+ in FETAX Assays. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis, Vol. 14, pp. 135−144. 1994.

79- Porter K. R., Hakanson D. E. Toxicity of mine drainage to embryonic and larval boreal toads (Bufonidae: Bufo boreas). Copeia 2−327:331. 1976.

80- Reeves, M. K., Jensen P., Dolph C. L., Holyoak M., Trust K. A. Multiple stressors and the cause of amphibian abnormalities. Ecological Monographs 80:423—440. 2010.

81- Romansic J. M., Waggener A. M., Bancroft B. A., Blautein A. R. Influence of ultraviolet-B radiation on growth, prevalence of deformities, and susceptibility to predation in cascades frog (Rana cascadae) larvae. Hydrobiologia. 624−219−233. 2009.

82- Rostand J. Les anomalies des amphibiens anoures. Societe d’edition d’enseignement superieur. 1958.

83- Rostand J., Tetry A. La vida. Labor. 1972.

84- Rowe, C. L., Hopkins, W. A., Coffman, V. R. Failed recruitment of southern toads (Bufo terrestris) in a trace element-contaminated breeding habitat: direct and indirect effects that may lead to a local population sink.

Archives of Environmental Contamination and Toxicology 40, 399−405. 2001.

85- Rowe, C. L., Kinney, O. M., Nagle, R. D., Congdon, J. D. Elevated maintenance costs in an anuran (Rana catesbeiana) exposed to a mixture of trace elements during the embryonic and early larval periods. Physiological Zoology 71, 27−35. 1998.

86- Sanchez M. E., Garcia G. El problema de hidroarsenismo en la region lagunera. Calidad ambiental. 1:8. 1994.

87- Sparling D. W., Krest S., Ortiz-Santaliestra M. Effects of Lead-Contaminated Sediment on Rana sphenocephala Tadpoles. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 51, 458−466. 2006.

88- State of the Environment Advisory Council, Australia, State of the Environment. CSIRO Publishing, Collingwood, Vic. 1996.

89- Waddington C. H., Perry M. M. Teratogenic effects of trypan blue on amphibian embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 4:2- 110−19. 1956.

90- Wall A. Correlation between frog malormities and heavy metals in Ward Marsh, West Haven, VT, and Mud Creek, Alburg, VT. Thesis. Middlebury College. 1999.

91- Wright K. M., Vails Badia X. Anfibios. In: Aguilar R., Hernandez-Divers S. M., Hernandez-Divers S. J. Atlas de medicina, terapeutica y patologia de animales exoticos. Intermedica. 2005.