Исследование невирусных способов доставки генных конструкций для генотерапии миодистрофии Дюшенна

Мышечная дистрофия Дюшенна/Беккера (МДД/Б) — является наиболее распространенным наследственным нервно-мышечным заболеванием человека. Частота встречаемости для мышечной дистрофии Дюшенна (МДД) составляет 1 на 3500 новорожденных мальчиков (Горбунова и др., 1998). Основным клиническим проявлением МДД/Б является прогрессирующая мышечная дистрофия. Симптомы миодистрофии Дюшенна (МДД) начинают в возрасте 3−5 лет. К 12−15 годам пациенты с МДД теряют способность передвигаться самостоятельно. Летальный исход, как правило, наступает из-за сердечной недостаточности либо отказа дыхательной мускулатуры в возрасте около 20 лет (Partridge, 1997). В случае более легкой формы миодистрофии — МДБ, симптомы заболевания начинают проявляться значительно позже, и больные часто доживают до 3 5−50 лет. f ¦

Причиной заболевания являются мутации в гене дистрофина (Koenig et al., 1987; Hoffman et al., 1987). Основным продуктом гена в мышечных тканях является присарколеммный белок мышечный дистрофии, выполняющий функцию связующего звена между внутренним цитоскелетом миофибриллы и внеклеточным матриксом. Присутствие в мембране мышечного волокна аномального белка (МДБ) или же его полное отсутствие (МДД), индуцирует первичные нарушения в структурной организации и функции сарколеммы, что приводит к запуску каскадного процесса дегенерации мышц (Hoffman'et al. 1987).

Отсутствие эффективного медикаментозного лечения делает актуальной разработку новых — генотерапевтических подходов к лечению миодистрофии Дюшенна/Беккера. Суть метода, заключается во введении больному конструкций с нормальным геном дистрофина, обеспечивающим синтез полноценного белка и восстанавливающим структуру и функцию мышц. В экспериментах in vivo на биологических моделях МДД мышах mdx, была показана возмолшость возобновление синтеза дистрофина в скелетных и сердечной мышцах после внутривенного введения аденовирусного вектора с кДНК гена дистрофина человека. (Stratford-Perricaudet et al., 1992). Кроме возобновления синтеза белка, было отмечено, что гиперэкспрессия человеческого дистрофина предотвращает 7 патологические и механические изменения поврежденных мышечных волокон без побочных эффектов.

К сожалению, кардинальных успехов в генотерапии МДД/Б пока не достигнуто (Баранов, 1999). Причиной этого являются, не только гигантские размеры гена и его мРНК, но и, главным образом, отсутствие. эффективных средств доставки гена в мышцы. Системы доставки генных конструкций, или носители, должны обеспечивать: компактизацию ДНК, проникновение в клетки мишени, предотвращать деградацию ДНК лизосомальными ферментами и обеспечивать ядерную транслокацию. При этом, система доставки должна быть не токсичной или иммуногенной, а входящие в ее состав компоненты быть биодеградируемыми (Wilson, 1998).

Считается, что достижение терапевтического эффекта возможно при успешной трансфекции не менее 20%, а, по последним данным, даже 30−40% мышечных волокон не только скелетной, мускулатуры, но так же мышц сердца и диафрагмы (Phelps et al., 1995). При этом Ьсновными критерйями эффективности трансфекции и терапевтического эффекта являются: появление дистрофии-положительных мышечных волокон (ДПМВ), нормализация уровня биохимических маркеров МДД/Б, изменения физиологических параметров мышц. Высокий уровень трансфекции пока достигнут только в нескольких опытах, где кДНК гена дистрофина вводили с помощью аденовирусного или ретровирусного векторов (Ascadi et al., 1995; Fassati et al., 1995). Использование вирусных носителей, однако, наталкивается на существенные методические трудности. Наибольшим препятствием к использованию вирусных векторов является выраженный иммунный ответ на вирусные антигеныВышеперечисленных недостатков в 1 значительной мере лишены невирусные носители (липосомьг олигопептиды, полимеры и др.). Однако эффективность трансфекции при их использовании in vivo оказывалась очень низкой (Turner et al., 1997). Таким образом, проблема создания и испытаний новых средств доставки генных конструкций в мышцы продолжает оставаться актуальной проблемой генотерапии миодистрофии Дюшенна. 8.

Данная работа является продолжением цикла проводимых лабораторией пренатальной диагностики ИАГ РАМН исследований, по разработке экспериментальных основ генотерапии МДД/Б и посвящена анализу результатов доставки кДНК гена дистрофина человека в мышцы мышей mdx при помощи различных типов невирусных носителей генов. .

Цели и задачи исследования. Целью работы является поиск оптимальных методов невирусной доставки гена дистрофина человека в мышцы mdx мышей и оценка I ¦ эффекта генетической трансфекции.

Для реализации намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать эффективность экспрессии гена дистрофина человека в зависимости от типа генных конструкций и способов их доставки в пораженные мышцы мышей mdx.

2. Иммуноцитохимическими и молекулярными методами изучить эффект генокоррекции;

3. Изучить возможность, системной коррекции дефекта скелетных мышц, диафрагмы и сердца мышей mdx в условиях внутримышечного введения генных конструкций;

Научная новизна и практическая значимость.

• Исследованы особенности трех новых невирусных способов доставки кДНК гена дистрофина в мышцы биологических моделей МДД мышей mdx.

• В экспериментах показано существование феномена «дистантной трансфекции». Полученные данные об особенностях трансфекции органов и тканей модельных животных открывают перспективы для системной терапии миодистрофии Дюшенна путем местного введения генотерапевтических конструкций.

• Показана возможность прохождения синтетических полимерных микросфер с «терапевтическими» генами через гематоэнцефалический барьер.

• Доказана высокая эффективность внутриядерной доставки генов с использованием полимерного носителя MF2.

• Исследованы возможности системной терапии миодистрофии Дюшенна путем местного введения генотерапевтических конструкций;

Практическая значимость:

Полученные результаты могут быть использованы в качестве экспериментальной.

• 1 • основой для разработки доклинических и первой клинической фаз испытаний геннотерапевтических конструкций для лечения миодистрофии Дюшенна.

Апробация работы.

Представленные в диссертации результаты были доложены на VIII итоговой конференции «Геном человека-98» (Черноголовка, 1998), 30 ежегодном совещании Европейского общества по генетике человека (Лисабон, 1998), VI совещании Европейской рабочей Труппы по генной терапии человека (Иерусалим, 1998). V Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1998), II Американском ежегодном совещании по генной терапии (Вашингтон, 1999). IX итоговой конференции «Геном человека-99» (Черноголовка, 1999), II съезде Всероссийского общества генетиков и селекционеров (С-Петербург, 2000), Ежегодном совещании по генетике человека (Канада, 2000), II Всероссийском съезде медицинских генетиков (Курск, 2000).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 20 работ.

Структура и объем диссертации

.

Работа изложена на 111 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал представлен 8 таблицами и 13 рисунками. Диссертация состоит из следующих разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы исследования, Результаты и обсуждение, Выводы.

Список литературы

насчитывает 165 наименований.

2.'Обзор литературы.

Миодистрофия Дюшенна/Беккера (МДД/Б) является наиболее частым среди сцепленных с полом наследственных заболеваний человека. Основным клиническим проявлением МДД/Б является прогрессирующая мышечная дистрофия. Миодистрофия Дюшенна встречается с частотой 1 на 3500 новорожденных мальчиков (Горбунова и др., 1998), характеризуется ранним, до 5 лет, проявлением симптомов и последующим тяжелым течением заболевания. Прогрессирующая мышечная дегенерация приводит к потере подвижности и летальному исходу из-за сердечной недостаточности либо отказа дыхательной мускулатуры в возрасте до '20 лет (Partridge, 1997). Миодистрофия Беккера 1.

ВЫВОДЫ.

Эффект трансфекции (появление дистрофии положительных мышечных волокон — ДПМВ) показан при доставке гена дистрофина с помощью: аналогов вирусных олигопептидов, полимерных микросфер MF2 и генного ружьятрансфекция in vivo с использованием поликатионных липосом оказалась не эффективной .

Максимальное число дистрофии положительных мышечных волокон (до 20%) и отсутствие выраженных дегенеративных изменений мышц, отмечены при доставке плазмидных конструкций в, опытах in vivo с помощью микросфер MF2 и «генного ружья» .

Высокий уровень ДПМВ (до 16%) при использовании в качестве носителя аналогов вирусных олигопептидов, сопровождался появлением волокон с аномальной, цитоплазматической локализацией дистрофина и дегенерацией миофибрилл, что делает эту систему мало пригодной для доставки кДНК гена дистрофина in vivo.

Методами FISH и электронной микроскопии, доказана высокая эффективность внутриядерной доставки генов с использованием полимерного носителя MF2 in vitro и in vivo.

Показана возможность преодоления гемато-энцефалического барьера экспрессирующими генными конструкциями в составе синтетических полимерных микросфер MF2.

• 1 ¦

Внутримышечное и параэнтеральное введение генных конструкций при помощи аналогов вирусных олигопептидов, полимерных микросфер MF2 и «генного ружья» сопровождалось появлением ДПМВ в скелетных мышцах, удаленных от места введения, а так же в диафрагме и в сердце. Высказано предположение, что данный эффект, названный нами «феноменом дистантной трансфекции «, открывает реальные перспективы для разработки генотерапевтических подходов к системному лечению миодистрофии Дюшенна и других нервно-мышечных заболеваний.