Актуальность исследования.
Нейротрофины — семейство факторов роста, играющих важную роль в регуляции развития и функционирования центральной и периферической нервной системы. Они влияют на пролиферацию и дифференцировку нейрональных и глиальных клеток, необходимы для поддержания жизнеспособности и функционирования нейронов, обладают нейропротекторным действием, влияют на передачу и изменение синаптического сигнала (синаптическая пластичность).
На сегодняшний день для человека описано четыре представителя данного семейства — фактор роста нервов NGF, нейротрофический фактор головного мозга BDNF, а также нейротрофические факторы NT-3 и NT-4/5. При этом наиболее значимыми для развития нервной системы являются первые три нейротрофических фактора, что делает их важными объектами различных биомедицинских исследований.
Нейротрофины синтезируются в клетках в виде предшественников — препронейротрофинов, имеющих в своем составе сигнальный пептид, N-концевую пропоследовательность и, собственно, зрелую часть, которая, как полагали долгое время, и обладает всеми свойствами, описанными для данных факторов роста. Препептид, считается, участвует в транспорте синтезированного белка из эндоплазматического ретикулума в транс-отдел аппарата Гольджи. Роль пропептида не установлена и активно исследуется во многих лабораториях. Есть основания полагать, что про-часть нейротрофинов может служить внутримолекулярным шапероном и определять фолдинг молекулы нейротрофина.
Недавно было показано, что клетками секретируются не только зрелые, процессированные, нейротрофины, но и их предшественники. При этом пронейротрофины, как было показано, обладают биологической активностью. Известно, что в некоторых случаях проформы нейротрофинов могут запускать механизм клеточной смерти. Таким образом, пронейротрофины и зрелые белки способны оказывать противоположные эффекты на клетки, а процессинг в таком случае может служить своего рода механизмом регуляции функциональной активности нейротрофических факторов.
Имеющаяся на данный момент совокупность данных свидетельствует о том, что изучение предшественников нейротрофинов необходимо для понимания механизмов функционирования нервной системы человека в норме и при патологии и является важным направлением в современных биологических науках.
Цели исследования.
Целью данной работы являлось изучение вовлеченности прогтоследовательностей в формирование биологически активных молекул нейротрофических факторов NGF и BDNF человека.
Научная новизна.
Впервые проведено комплексное сравнительное исследование фолдинга нейротрофических факторов человека с использованием предшественников нейротрофинов NGF и BDNF, их индивидуальных зрелых форм и пропоследовательностей. При этом в данной работе впервые осуществлен фолдинг зрелого NGF в присутствии несвязанного ковалентной связью пропептида NGF (фолдинг в системе in trans). Показано, что пропептид NGF способен существенно повышать эффективность образования биологически активного нейротрофина NGF, причем наличие ковалентной связи между зрелым белком и пропептидом не является необходимым. Таким образом, в данной работе получены доказательства про-зависимого фолдинга нейротрофина NGF. Впервые осуществлен фолдинг нейротрофина NGF в присутствии не связанной ковалентной связью чужеродной пропоследовательности (пропептида BDNF) и показано, что пропептид BDNF способен направлять фолдинг зрелого NGF. Впервые показано, что пропептид BDNF не оказывает существенного влияния на образование биологически активного нейротрофина BDNF и, по-видимому, фолдинг данного нейротрофина не является про-зависимьтм. Показано, что индивидуальные пропоследовательности нейротрофинов NGF и BDNF в растворе образуют стабильную димерную форму. Также показано отсутствие дифференцирующего и пролиферативного действия пропептидов на культуры клеток феохромоцитомы крысы PC 12 и эритролейкемии человека TF-1.
Практическая значимость.
Получение новых данных о механизмах фолдинга нейротрофических факторов открывает большие перспективы в конструировании нейротрофинов с модифицированными свойствами, в том числе на базе одной аминокислотной последовательности. Это может помочь в исследовании взаимодействия нейротрофических факторов с тирозинкиназными рецепторами (TrkA, TrkB и TrkC), рецептором р75 и сортилином. Препаративное получение очищенных вариантов нейротрофических факторов NGF и BDNF (предшественников, индивидуальных зрелых нейротрофинов и индивидуальных пропептидов), отработанное в данной работе, позволит 8 использовать данные белки для разработки и создания тест-систем для детектирования пронейротрофинов, нейротрофинов и, вероятно, пропептидов в различных биологических жидкостях (крови, спинномозговой жидкости и т. д.), что может быть широко использовано в диагностике и исследовании целого ряда нейродегенеративных заболеваний.
Положения, выносимые на защиту.
Конструирование рекомбинантных продуцентов различных форм нейротрофических факторов NGF и BDNF человека, а именно, их предшественников, пропептидов и зрелых частей.
Получение высокоочищенных вариантов нейротрофических факторов NGF и BDNF человека.
Разработка системы анализа эффективности фолдинга различных форм нейротрофинов.
Анализ биологической активности полученных нейротрофических факторов.
Исследование наличия шапероноподобной функции пропептидов при фолдинге нейротрофинов NGF и BDNF.
Исследование влияния пропептида на биологическую активность сформировавшегося зрелого нейротрофина NGF.
Исследование собственной биологической активности индивидуальных пропептидов.
Выполнение работы проводилось в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007;2012 годы», в рамках программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (2009), программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине» (2009) и при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (М" грантов 06−04−48 678-а, 06−04−48 690-а, 09−04−734-а, 09−04−870-а).
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ НЕЙРОТРОФИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ.
выводы.
1. Зрелые нейротрофины NGF и BDNF способны формировать биологически активные формы без участия пропоследовательностей. При этом фолдинг нейротрофина BDNF протекает значительно эффективнее.
2. При фолдинге нейротрофического фактора NGF в системах in cis и in trans пропептид повышает эффективность образования биологически активной формы белка, причем наличие ковалентной связи между зрелым нейротрофином и пропоследовательностью не является необходимым. Таким образом, фолдинг нейротрофина NGF протекает по про-зависимому механизму.
3. Пропептид BDNF не оказывает существенного влияния на процесс формирования биологически активной формы данного нейротрофина (BDNF). Следовательно, фолдинг нейротрофина BDNF не является про-зависимым. Таким образом, молекулярные механизмы функционирования пропоследовательностей нейротрофических факторов NGF и BDNF различны.
4. Пропептид BDNF способен направлять фолдинг зрелой части NGF и существенно повышать эффективность образования биологически активного белка.
5. Индивидуальный пропептид в растворе имеет стабильную димерную форму, и это свидетельствует в пользу того, что в димерной структуре предшественника пропоследовательности, по-видимому, взаимодействуют между собой.
6. Индивидуальные пропоследовательности NGF и BDNF не обладают собственной дифференцирующей либо пролиферативной активностью в рамках использованных экспериментальных моделей.
7. В условиях эксперимента пропептид NGF не влияет на биологическую активность уже сформировавшегося зрелого нейротрофина.
БЛАГОДАРНОСТИ.
Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю, члену-корреспонденту РАН, доктору химических наук, профессору Кострову Сергею Викторовичу за внимание, чуткое отношение, теоретическую и практическую помощь, оказанные им в процессе выполнения данной диссертационной работы.
Автор также выражает признательность ведущему научному сотруднику Московского научно-исследовательского института медицинской экологии, кандидату химических наук Посыпановой Галине Ароновне за неоценимую помощь в выполнении экспериментальной части работы и обсуждении полученных результатов.
Автор благодарит за помощь, ценные советы и моральную поддержку всех сотрудников лаборатории белковой инженерии ИМГ РАН, особенно кандидата химических наук Демидюка Илью Валерьевича, кандидата химических наук Сафину Дину Рашидовну и кандидата химических наук Гасанова Евгения Валерьевича.
Автор также благодарит всех сотрудников ИМГ РАН за внимание и содействие, оказанное ими, особенно доктора биологических наук, профессора Лимборскую Светлану Андреевну, кандидата химических наук Шрама Станислава Ивановича и доктора биологических наук Кульбачинского Андрея Владимировича.
3.4.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
.
Как известно, нейротрофические факторы NGF, BDNF и NT-3 являются ключевыми регуляторами развития и функционирования нервной системы позвоночных. Несмотря на то, что данные факторы исследуются не первый год, о биологических функциях пропоследовательностей нейротрофинов известно недостаточно. В частности оставался открытым вопрос об участии пропептидов нейротрофических факторов в процессе образования биологически активной пространственной структуры зрелых молекул. Наша работа была направлена на исследование роли пропоследовательностей нейротрофических факторов NGF и BDNF в фолдинге этих белков. Для этого было необходимо получить препаративные количества различных форм нейротрофических факторов NGF и BDNF человека, а именно, их предшественников, пропептидов и зрелых частей, и изучить процесс их созревания.
Нами сконструированы продуценты различных форм нейротрофических факторов NGF и BDNF человека. Была разработана эффективная система очистки рекомбинантных белков, подобраны условия ренатурации предшественников и зрелых форм нейротрофинов NGF и BDNF. Разработана система анализа эффективности фолдинга различных форм нейротрофинов, ключевой стадией которой являлась оценка биологической активности полученных нейротрофических факторов. С использованием этой системы было показано, что ренатурированные рекомбинантные нейротрофины в условиях эксперимента обладают профилем биологической активности, характерной для факторов роста, полученных из природных источников. Изучение биологической активности различных форм нейротрофинов, полученных нами, позволило оценить степень участия их пропоследовательностей в формировании биологически активной структуры факторов NGF и BDNF. Было показано, что фолдинг нейротрофического фактора NGF протекает по про-зависимому механизму, тогда как на образование биологически активного нейротрофина BDNF пропептид, по-видимому, влияния не оказывает. Анализ полученных экспериментальных данных позволяет заключить, что, несмотря на общее сходство всех нейротрофинов, молекулярные механизмы функционирования пропоследовательностей NGF и BDNF различны.
В то же время остается открытым вопрос о возможности введения структурных изменений в молекулу зрелого нейротрофина при взаимодействии с различными вариантами пропептида. Наши данные, полученные при сворачивании нейротрофина NGF в присутствии природной и гетерологичной пропоследовательности, позволяют предполагать наличие конформационных изомеров NGF. Дальнейшие исследования, в том числе и структурные, позволят подтвердить или опровергнуть вероятность образования различных конформеров нейротрофических факторов на базе одной аминокислотной последовательности.
