Клинико-морфологические особенности течения хронических вирусных гепатитов в зависимости от иммуно-генетического статуса больных

Актуальность Хронические заболевания печени (ХЗП) — одна из актуальных проблем современной медицины, что обусловлено их широкой распространенностью, прогредиентным течением, развитием тяжелых осложнений и ограниченными возможностями терапии.

По данным ВОЗ, от хронических заболеваний печени, включая цирроз и первичную карциному печени, ежегодно погибает более 700 тыс. человек. При всеобщем признании полиэтиологичности ХЗП, ведущая роль в их возникновении принадлежит гепатотропным вирусам [78]. Среди ХЗП вирусный гепатит С стоит на первом месте и составляет 40−60%. Заболеваемость хроническим гепатитом С (ХГ-С) коррелирует с распространенностью HCV-инфекции. В мире насчитывается от 500 до 700 млн. носителей HCV [41,259]. В разных странах от 1 до 5% населения поражены этим вирусом. В России частота встречаемости инфекции HCV составляет около 4,5% [26,295]. По данным различных авторов, у 60−90% инфицированных HCV при естественном течении заболевания развиваются хронические болезни печени: ХГ-С, ЦП и ГЦК [24,52]. Высокая степень хронизации, преимущественно молодой возраст инфицированных обуславливают серьезную социальную значимость HCV-инфекции.

В мире число инфицированных вирусом гепатита В к 2000 году достигло 400 млн. человек [2]. В исходе острого гепатита В хронизация наступает у 5 — 10% больных, а при HDV-инфекции — в 60 — 70% случаев. В общем ряду причин смерти ХГ-В занимает 9-е место, следуя непосредственно за хроническими заболеваниями легких и значительно (в 50 раз) опережая СПИД [44]. В России и странах СНГ ежегодно от болезней, связанных с вирусом гепатита В, погибают около 10 тыс. человек, из них порядка 5 тыс. от острого и 4 тыс. от хронического гепатита В [41].

Активное участие ученых различных специальностей в решении данной проблемы привело к накоплению знаний о широком спектре 5 вариантов течения и исходов инфицирования гепатотропными вирусами. Однако, механизмы хронизации и прогрессирования вирусной инфекции во многом не определены [86]. Разнообразие темпов прогрессирования ХВГ связывают с влиянием на его течение множества факторов. Среди них рассматриваются факторы вируса, «хозяина» и ряд кофакторов [24].

Успехи молекулярной генетики, сделанные за последние несколько лет, открыли новые возможности для клинической медицины. Роль генетических факторов в патогенезе заболеваний печени очевидна, но на сегодняшний день не установлены конкретные гены, лежащие в основе подверженности к заболеванию и механизмов его развития [24,53,106,288]. Изучение генетических основ предрасположенности к вирусным гепатитам и детерминации индивидуальных особенностей течения и исхода заболевания, обретает все большую актуальность. Это связано с повышением «генетической грамотности» практических врачей, осознанием того, что наука о наследственности применительно к человеку является реальной теоретической базой клинической медицины. Среди маркерных систем большое внимание уделяется генам иммунной системы, медиаторы которой, в частности, принимают участие в регуляции воспалительного процесса и фиброза печени у больных ХВГ [23].

Центральное место в регуляции и развитии как локального иммунного ответа в месте репродукции возбудителя, так и в общей реакции организма на патоген принадлежит цитокинам [77]. Вполне закономерным может являться факт, что иммунный ответ на различные воздействия может определяться аллельным полиморфизмом генов цитокинов. Это лежит в основе межиндивидуальных различий в реагировании иммунной системы на внешние и внутренние стимулы [48]. Существующие на сегодня данные позволяют предположить, что полиморфные варианты генов цитокинов способны принимать активное участие в формировании специфического иммунного ответа на патологические состояния человека [108,130,155, 190,198,244,255]. При этом отдельные аллельные варианты ассоциированы с уровнем продукции соответствующего белкового продукта, что тоже оказывает влияние на характер течения, возникновение определенных осложнений заболевания. Важность иммуногенетических исследований заключается в поиске аллелей, определяющих изменение продукции цитокина с тем, чтобы предсказать тип функционирования иммунной системы при контакте с патогеном или при развитии заболевания.

В связи с этим, представляет интерес изучение полиморфных вариантов генов цитокинов для определения генетических факторов подверженности и прогнозирования исхода заболевания при заражении вирусом гепатита.

Кроме того, учитывая, что этиологическим фактором ХВГ является инфекция, обоснованным представляется изучение гена макрофагального протеина 1 (NRAMP1), ассоциированного с естественной резистентностью к инфекционным заболеваниям, который участвует в определении чувствительности или невосприимчивости к некоторым инфекционным агентам [157]. Ген NRAMP1 кодирует политопный, макрофаг-специфический мембранный белок, одной из функций которого является активации макрофагов, включающая сверхрегуляцию таких провоспалительных цитокинов, как фактор некроза опухоли альфа, IL-lbeta и экспрессию главного комплекса гистосовместимости класса II [93]. В последние годы выполнено большое количество исследований ассоциации этого гена с некоторыми заболеваниями человека, в том числе инфекционной этиологии [90,91,134,221].

Исследования генетической компоненты ХВГ наиболее интенсивно стали проводиться в последнее время. Ведется активный поиск генов-кандидатов подверженности к вирусным гепатитам. С этой целью изучаются гены различных систем организма, это, в первую очередь, целый спектр генов иммунной системы (TNFa, IL1, IL6, IL10, TGF, IFNy, CCR5, RANTES), ренин-ангиотензиновой системы (AT, АСЕ) и другие. Получены данные о функциональной значимости различных полиморфных вариантов гена TNFa в формировании предрасположенности к вирусным гепатитам В и С в популяциях европеоидного (-308G/A) и монголоидного (-863С/А) происхождения [158,169,170,171,252,294,297]. Проведено большое количество исследований по изучению вовлеченности гена IL10. Показан вклад полиморфизмов -592А/С, -1082G/A, -819Т/С в предрасположенность к гепатиту С, ответ на терапию и исход заболевания в европеоидных и монголоидных популяциях [160,185,197,274,286,293]. Однако полученные результаты зачастую носят противоречивый характер. Так для полиморфизмов генов TNFa и IL10 рядом исследователей не было показано ассоциаций с гепатитом [89.104,109,126,171,205,245,253]. То же касается и полиморфных вариантов других исследованных генов. В отношении связи генов IL12B и NRAMP1 с ХВГ имеются лишь единичные исследования [252].

Таким образом, гены TNFa, IL12B и NRAMP1 требуют дальнейшего изучения и уточнения их роли в предрасположенности к развитию ХВГ и особенностях течения заболевания. Информации об исследовании связи К/ генов IL4, IL4RA с ХВГ в доступной литературе не обнаружено.

Цель исследования. Изучить клинико-морфологические особенности течения хронических вирусных гепатитов в зависимости от количественных показателей цитокинового обмена и полиморфных вариантов генов IL4, IL4RA, IL12B, TNFa, NRAMP1.

Задачи исследования:

1. Исследовать продукцию цитокинов — ИЛ4, ИЛ6, ИЛ2, ИЛ10, ИЛ 12, у-ИФН и ФНОа мононуклеарными клетками крови у больных хроническими вирусными гепатитами в зависимости от клинико-морфологической активности и стадии процесса с целью определения их диагностической значимости.

2. Изучить полиморфные варианты генов IL4 (С-590Т), IL4RA (Ile50Val), IL12B (А1188С), TNFa (G-308A) и NRAMP1 (D543N, 469+14G/C) у больных хроническим вирусным гепатитом.

3. Провести анализ ассоциаций аллельных вариантов генов цитокинов и гена макрофагального протеина 1 с хроническим вирусным гепатитом, его морфологическими критериями прогрессирования — стадией фиброза, на основе чего изучить возможности прогнозирования характера течения заболевания.

4. Оценить связь аллельных вариантов генов IL4, IL4RA, IL12B, TNFa, NRAMP1 с количественными показателями цитокинов у больных хроническим вирусным гепатитом.

Научная новизна. Впервые проведено исследование полиморфизма генов IL4, IL4RA, NRAMP1 (полиморфизмы D543N, 469+14G/C) у больных хроническим вирусным гепатитомизучена вовлеченность полиморфизмов генов IL4, IL4RA, IL12B, TNFa, NRAMP1 в формирование предрасположенности к хроническим вирусным гепатитампроведено исследование связи полиморфных вариантов генов IL4, IL4RA, IL12B, TNFa, NRAMP1 с качественными и количественными признаками, патогенетически значимыми в развитии заболевания. Установлена значимость генов IL4 (С-590Т) и NRAMP1 (D543N) в предрасположенности к хроническому вирусному гепатиту. Выявлена связь полиморфных вариантов генов IL4, NRAMP1 с хроническим вирусным гепатитом, генов IL4RA (полиморфизм Ile50Val) и TNFa (полиморфизм G-308А) со стадией фиброза. Показана связь гена TNFa (полиморфизм G-308A) с уровнем ФНОа, гена IL12B (полиморфизм А1188С) — с уровнем ИЛ4.

Практическая значимость работы. Сведения о вкладе генетических факторов в развитие и варианты течения хронических вирусных гепатитов и структуре наследственной компоненты в терминах конкретных генов, а также обнаруженные взаимосвязи аллельных вариантов, участвующих в регуляции цитокинов, могут быть использованы в. создании исследовательских и диагностических панелей маркеров. Полученные молекулярно-генетические данные могут стать основой прогноза течения, исхода заболевания, а также индивидуализированного подхода в лечении хронических вирусных гепатитов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. У пациентов с хроническим вирусным гепатитом в ответ на инфекцию гепатотропными вирусами типичным является смещение иммунного ответа в сторону цитокинов ТЬ2-типа вне зависимости от степени активности и стадии хронизации процесса, что приводит к персистенции вирусной инфекции и прогрессированию процесса.

2. В случае контакта с гепатотропным вирусом, риск развития хронического вирусного гепатита повышен у лиц, имеющих однонуклеотидные замены в генах IL4 (С-590Т) и NRAMP1 (D543N).

Риск развития фиброза печени увеличивается у больных хроническим вирусным гепатитом — носителей гетерозиготного генотипа полиморфного варианта гена IL4RA (Ile50Val), у пациентов с гетерозиготным генотипом по полиморфизму G-308A гена TNFa с большей вероятностью сформируется слабый фиброз.

3. У больных хроническим вирусным гепатитом уровень провоспалительного цитокина ФНОа детерминирован одноименным геном (полиморфизм G-308A). Продукция противовоспалительного ИЛ4 ассоциирована с полиморфным вариантом А1188С теяз.1Ы2 В.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались и обсуждались на 11-ой и 12-ой научно-практических конференциях «Достижения современной гастроэнтерологии» (сентябрь 2003, 2004гг., г. Томск), научно-практических конференциях «Диагностика и лечение хронических гепатитов, достижения и перспективы» (март 2003 г., апрель 2004 г, г. Томск), на областном научно-практическом обществе терапевтов (Томск, 2004), на заседании проблемной комиссии «Внутренние болезни».

Томск, 2001 г.), на заседании экспертной комиссии по «Внутренним болезням» СибГМУ (Томск, 2005 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ в отечественной и зарубежной печати.

выводы.

1. У больных хроническим вирусным гепатитом выявлены достоверные изменения цитокин-продуцирующей способности мононуклеарных клеток периферической крови — увеличение спонтанного синтеза ИЛ4, ИЛ 10, ИЛ6, у-ИФН и уменьшение спонтанной секреции ФНОа, стимулированной продукции ФНОа, ИЛ 12, ИЛ2.

2. Выявленное увеличение синтеза мононуклеарными клетками крови ИЛ4, ИЛ 10 и уменьшение продукции ФНОа у больных хроническим вирусным гепатитом вне зависимости от степени активности и стадии хронизации процесса отражает смещение цитокинового баланса в сторону факторов с противовоспалительной активностью. Полученные результаты позволяют предположить, что выраженный цитокиновый ответ ТЪ2-типа, характеризующийся избыточной продукцией ИЛ4 и ИЛ 10, является типичным для больных хроническим вирусным гепатитом, что приводит к персистенции гепатотропных вирусов и прогрессированию хронического гепатита.

3. Количественное определение спонтанной продукции цитокинов мононуклеарными клетками крови у больных хроническим вирусным гепатитом не может использоваться для оценки степени активности процесса и стадии хронизации.

4. Распределение частот аллелей полиморфных вариантов генов IL4 (С-590Т), IL4RA (Ile50Val), IL12B (А1188С), TNFa (G-308A) и NRAMP1 (D543N, 469+14G/C) у больных хроническим вирусным гепатитом г. Томска находятся в пределах частот, полученных для других европейских популяций.

5. Выявлены различия по частотам аллелей гена NRAMP1 (D543N) и генотипов генов IL4 (С-590Т) и NRAMP1 (D543N) между больными хроническим вирусным гепатитом и здоровыми лицами. Больные хроническим вирусным гепатитом характеризовались повышенной частотой патологического" аллеля «N» полиморфного варианта D543N гена NRAMP1 и увеличением генотипов, несущих аллель «Т» гена IL4 (С-590Т) по сравнению с контрольной группой. Лица, несущие аллели «Т» гена IL4 и «N» гена NRAMP1 имеют большую подверженность к развитию заболевания хроническим вирусным гепатитом в случае контакта с патогеном.

6. Гены IL4RA (Ue50Val) и TNFa (G-308A) участвуют в формировании особенностей течения хронических вирусных гепатитов — Ile/Val генотип гена IL4RA ассоциируется с более выраженными стадиями хронизации, а генотип G/A гена TNFa — со слабой степенью фиброза. Больные хроническим вирусным гепатитом — носители гетерозиготного генотипа по гену IL4RA (Ile50Val) будут иметь повышенный риск развития фиброза печени.

7. У больных хроническим вирусным гепатитом уровень продукции ФНО-а мононуклеарными клетками крови ассоциирован с одноименным геном TNFa (полиморфизм G-308A) — пациенты с генотипами, несущими аллель «А» характеризуются более низким синтезом ФНОа. Количественные показатели ИЛ4 ассоциированы с полиморфизмом А1188С гена IL12B — уровень продукции ИЛ4 мононуклеарами больных хроническим вирусным гепатитом с гетерозиготным генотипом по данному аллельному варианту снижен.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Полученные молекулярно-генетические данные могут быть использованы в клинической практике:

1. Выявление генотипа у больных острыми вирусными гепатитами В и С по полиморфным вариантам генов IL4 (С-590Т) и NRAMP1 (D543N) на предмет определения возможной хронизации процесса, на основе чего формировать группы риска. Такой подход позволит индивидуализировать лечебную тактику в отношении пациентов с острыми парентеральными гепатитами (особенно гепатитом С), поможет принять решение о назначении противовирусной терапии, обратит внимание врача на более тщательное диспансерное наблюдение за больными, имеющими генетические факторы риска формирования хронической патологии печени.

2. Определение генотипа у больных ХВГ по полиморфизму Ile50Val гена IL4RA и G-308A гена TNFa с целью оценки прогноза течения (формирование фиброза), исхода заболевания, а в связи с этим индивидуализированного подхода в лечении пациентов с ХВГ.