Изменение свойств популяции вируса клещевого энцефалита при смене хозяина

ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Адаптация ВКЭ к клещам связана с появлением мутаций в белке Е, повышающих аффинность связывания вирионов с гликозаминогликанами (ГАГ) на поверхности клетки. Мутанты ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом восстанавливают способность к низкоаффинному связыванию с ГАГ клеток за счет появления обратных и компенсирующих замен. Свойства ревертантов зависят от характера и расположения компенсирующих замен… Читать ещё >

Изменение свойств популяции вируса клещевого энцефалита при смене хозяина (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Общая характеристика флавивирусов
Структура и функции белков флавивирусов. Ю
Цикл репродукции флавивирусов
2. Молекулярные основы вирулентности флавивирусов
3. Хозяин-специфические детерминанты флавивирусов
4. Эволюция флавивирусов
5. Экология ВКЭ
6. Популяционная биология РНК-содержащих вирусов
- 6. 1. Общие положения
- 6. 2. Изменения приспособленности
7. Популяция вируса и смена хозяев
- 7. 1. Общие положения
- 7. 2. Фенотипические и генетические изменения вирусов ККЭ при адаптации к клещам и млекопитающим
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Использованные в работе вирусы
2. Кулы ура клеток
3. Животные
4. Клещи
5. Иммунные сыворотки и моноклональные антитела
6. Олигонуклеотиды
7. Титрование инфекционного вируса
8. Клонирование вируса методом бляшек
9. Титрование ВКЭ на мышах
10. Опьп на клещах
11. Реакция гемагглютинации
12. Концентрирование ВКЭ из культуральной жидкости инфицированных клеток
13. Ракетный иммуноэлектрофорез
14. Сорбция на гепарин сефарозь
15. Сорбция на эритроцитах
16. иммуноферментный анализ
17. иммунопреципитация вирусспецифических белков
18. Электрофорез белков в полиакриламидном геле
19. Выделение РНК
20. Обратная транскрипция
21. полимеразная цепная реакция
22. АНАЛИ1ИЧЕСКИЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК в
АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ
23. Препаративный электрофорез и выделение продукта ПЦР из легкоплавкой агарозы
24. определение нуклеотидной последовательности
25. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей
26. Me год доказательства отсутствия РНК ВКЭ в биопробах
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. фенотипическая характеристика варианта м
2. Определение полной нукльотидной последовательности генома штамма ЭК-328 и выявление его филогенетического положения среди штаммов ВКЭ
3. Сравнение полных последова i ельностей геномов цп амма ЭК-328 и baphai гта М
4. Сравнение антигенной структуры белка Е ш гамма ЭК-328 и варианта М
5. Характеристика ревертантов, полученных при репродукции варианта М в культуре клеток СПЭВ с помощью клонирования
- 5. 1. Получение клонов из популяции варианта М, обладающих крупнобляшечным и мелкобляшечным фенотипом
- 5. 2. Сорбция на гепаринсефарозе
- 5. 3. Оценка вирулентности для мышей дополнительно клонированных ревертантов
- 5. 4. Сорбция на эритроцитах
6. Разработка метода доказательства отсутствия РНК ВКЭ в биопробах
7. Оценка способности варианта М, штамма ЭК-328 и клона 116/59 попадать и персистировать в ЦНС мыши после периферического введения с помощью ОТ-ПЦР
8. Поведение популяции варианта М при репродукции in vivo
9. Поведение популяции варианта М при пассажах через мозг мыши
10. Пассажи варианта М в культуре клеток СПЭВ
11. Опыт по смешанной инфекции штамма ЭК-328 и адаптированного к клещам варианта М в культуре клеток СПЭВ
ОБСУЖДЕНИЕ
1. Обоснование выбора данной модели для изучения изменения свойств популяции ВКЭ при смене хозяина
2. Выявление филогенетического положения штамма ЭК-328 среди штаммов ВКЭ
3. Сравнение геномов родительского штамма ЭК-328 и варианта М
4. Выявление замен, связанных с фенотипом
5. Роль мутаций, повышающих аффинность связывания с ГАГ, в проявлении свойств ВКЭ
6. Поведение популяции варианта М при смене хозяина
ВЫВОДЫ
С ПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Список сокращений а.к. — аминокислота (ы) — б/п — беспородные
БОЕ — бляшкообразующая единица
ВА — вирионный антиген
ВКЭ — вирус клещевого энцефалита
ВС — везикулярный стоматит
ВЭЛ — восточный энцефалит лошадей
ГА — гемагглютинирующая активность
ГАГ — гликозаминогликаны
ГС — гепаринсефароза- дНТФ — дезоксинуклеотидтрифосфат
ЖЛ — желтая лихорадка
ИП — иммунопреципитация- и/п — интраперитонеально
ИПБ — иммуно-преципитационный буфер
ИФА- иммуноферментный анализ- и/ц — интрацеребрально
КЖ — культуральная жидкость
ККЭ — комплекс клещевого энцефалита
КЭ — клещевой энцефалит
ЛЗН — лихорадка Западного Нила
ЛСБ — ламинин-связывающий белок
М.в. — молекулярный вес
МС — мозговая суспензия
НА — невирионный антиген- нт — нуклеотид (ы)
НТО — нетранслируемая область
ОРС — открытая рамка считывания
ОТ — обратная транскрипция
ПААГ— полиакриламидный гель- п/к — подкожно
ПЦР — полимеразная цепная реакция
ПЭГ — полиэтиленгликоль
РГА — реакция гемагглютинации
РДПА — реакция диффузной преципитации в агаре
РИЭФ — ракетный иммуноэлектрофорез
РНБ — реакция нейтрализации бляшек
СПЭВ — культура клеток почек эмбриона свиньи
ЦНС — центральная нервная система
ЦПД — цитопатическое действие
ЭДМ — энцефалит долины Мюррей
ЭПР — эндоплазматический ретикулум
ЯЭ — Японский энцефалит

На современном этапе накоплен большой массив данных по эволюции вирусов. Установлено, что арбовирусы эволюционируют медленнее, чем другие РНК-содержащие вирусы. Тем не менее, среди вирусов этой группы наблюдается внезапное появление новых эпидемически значимых вариантов. Для понимания закономерностей эволюции вирусов, для предсказания появления более вирулентных вариантов или вариантов с измененным тропизмом необходимо изучение микроэволюционных процессов, определяющих уровень и направление изменчивости.

Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) является представителем рода Flavivirus и вызывает тяжелые заболевания человека, такие как энцефалиты и менингиты. Очаги клещевого энцефалита (КЭ) различаются по количеству и тяжести течения заболевания людей. В последние годы в ряде регионов было показано увеличение числа тяжелых форм, появление новых клинических форм заболевания в виде энцефалита с геморрагическим синдром, а также расширение ареала этого вируса.

В природных очагах ВКЭ существует за счет попеременного размножения в клещах и позвоночных. Филогенетические исследования указывают на то, что эволюция флавивирусов определяется прежде всего видом переносчика, хотя определенное значение имеет и вид прокормителя. На фенотипическом уровне показано, что клещи и позвоночные оказывают разное селективное давление на ВКЭ. Однако, информация о хозяин-специфических детерминантах в геноме ВКЭ крайне ограничена. До сих пор нет никаких данных о поведении гетерогенной популяции ВКЭ при смене хозяина, а также в процессе вирусной инфекции.

Цель и задачи работы: Целью данной работы было изучение изменения свойств популяции ВКЭ при смене хозяина.

Для этого было необходимо решить следующие задачи:

1. Сравнить полные нуклеотидные последовательности геномов штамма ЭК-328 и варианта М, полученного в результате пассажей штамма ЭК-328 в клещах.

2. Сравнить антигенную структура белка Е адаптированного к клещам варианта М и родительского штамма ЭК-328.

3. Изучить изменение свойств популяции варианта М на генетическом и фенотипическом уровне при пассажах in vivo и in vitro.

4. На основе анализа ревертантов, полученных из популяции варианта М, выявить хозяин-специфические детерминанты в геноме ВКЭ.

Научная новизна.

Впервые изучены молекулярные основы адаптации ВКЭ к клещам и млекопитающим и предложена схема, объясняющая быструю переадаптацию вируса при смене хозяина.

Впервые показано, что адаптация ВКЭ к клещам связана с появлением мутаций в белке Е, повышающих аффинность связывания вирионов с гликозаминогликанами (ГАГ) на поверхности клетки.

Впервые показано, что адаптация ВКЭ к клещам может приводить к комплексному изменению антигенной структуры основного гликопротеина оболочки Е.

Впервые изучены механизмы восстановления низкой аффинности связывания вирионов с ГАГ на поверхности клетки у мутантов ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом. Впервые показано, что в процессе реверсии ГАГ-связывающего фенотипа образуются варианты ВКЭ, способные вызывать все формы инфекции. Научно-практическая ценность.

Получена фенотипическая и генетическая характеристика вариантов, имеющих селективное преимущество при размножении в клещах и млекопитающих.

Разработан корректный методический подход, позволяющий оценить попадание вируса в мозг и наличие персистенции вируса в ЦНС.

Определена первая полная нуклеотидная последовательность генома штамма ВКЭ прибалтийской группы сибирского подтипа, депонирована в международной базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.mh.gov/Genbank, № DQ486861).

Выявлено, что адаптация ВКЭ к клещам может приводить к значительному изменению антигенной структуры белка Е. Это необходимо учитывать при разработке и применении вакцинных препаратов, а также при оценке природной изменчивости антигенной структуры ВКЭ.

Показано, что при переадаптации ВКЭ от клещей к млекопитающим в популяции вируса появляются варианты, различающиеся по патогенетическим характеристикам.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Выводы.

1. Определена первая полная нуклеотидная последовательность генома штамма ВКЭ (ЭК-328) прибалтийской группы сибирского подтипа.

2. Адаптация штамма ЭК-328 к клещам Hyalomma marginatum marginatum сопровождается набором несинонимических замен в геноме: нуклеотидными заменами в 5'-НТО, аминокислотными заменами в сигнальной последовательности белка ргМ, в области белков Е, NS2A, NS4A. Замены в белке Е Gluj22->Gly и ТЬг42б—>11е определяют основные свойства адаптированного к клещам варианта М, отличающие его от родительского штамма ЭК-328.

3. Адаптация ВКЭ к клещам связана с появлением мутаций в белке Е, повышающих аффинность связывания вирионов с гликозаминогликанами (ГАГ) на поверхности клетки. Мутанты ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом восстанавливают способность к низкоаффинному связыванию с ГАГ клеток за счет появления обратных и компенсирующих замен. Свойства ревертантов зависят от характера и расположения компенсирующих замен в белке Е.

4. ВКЭ может существовать в виде гетерогенной популяции, содержащей варианты, обладающие селективным преимуществом при репродукции либо в клещах, либо в млекопитающих. Переадаптация к млекопитающим адаптированного к клещам вируса происходит за счет изменения соотношения этих вариантов в популяции, а также за счет появления новых мутантов с более высокой приспособленностью к репродукции в данной системе.

5. Скорость изменения генетической структуры популяции ВКЭ и разнообразие мутантов определяется характеристикой хозяина и наличием эффекта «бутылочного горлышка» .

• т.

Благодарности.

Выражаю глубокую благодарность дирекции ГУ ИПВЭ им. М. П. Чумакова РАМН (академику РАМН С. Г. Дроздову и профессору М.И. Михайлову) за предоставленную возможность выполнения данной работы. Я искренне благодарна к.б.н. Г. Г. Каргановой за научное руководство, постоянное внимание и поддержку. Также благодарю сотрудников ГУ ИПВЭ им. М. П. Чумакова РАМН [Д.В. Бахмутова|, к.б.н. А. П. Гмыль, к.б.н. JI.B. Гмыль, к.м.н. Т. И. Дживанян, к.б.н. JI.A. Буренкову, Л. И. Козловскую, Ю. В. Рогову, д.м.н. А. Н Лукашева за помощь и участие в настоящей работе. Я глубоко признательна академику РАМН В. А. Лашкевичу за плодотворные научные дискуссии. Я благодарна официальным рецензентам д.б.н. В. Н. Ляпустину и к.б.н. Е. В. Белоусову за внимательное прочтение работы и ценные замечания. Я благодарна всем соавторам моих работ, не упомянутых выше, за помощь в проведении данных исследований.

Показать весь текст

Список литературы

Алексеев А.И., Чунихин С. П. 1987. Способ изготовления стеклянных микроигл для инъецирования клещей и других мелких членистоногих. Мед. паразитол. и паразит, болезни, № 6, стр.69−70.
Баннова Г. Г., Сарманова Е. С., Караванов А. С., Бычкова М. В., Ливанова Г. П., Флеер Г. П. 1982. Изучение биологических свойств штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных в разных частях его ареала. Вопр. вирусол., № 3, стр. 41−44.
Богачек М.В., Протопопова Е. В., Терновой В. А., Качко А. В., Иванова А. В., Иванисенко В. А., Локтев В. Б. 2005. Иммунохимические свойства рекомбинантных полипептидов, моделирующих домены I и II белка Е вируса Западного Нила. Мол. биол., № 5, стр. 813−822.
Гмыль Л.В., Карганова Г. Г., Смирнова С. Е., Лашкевич В. А. 2001. Вирусспецифические белки вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки. Вопр. вирусол., № 3, стр. 16−21.
Грицун Т.С., Ляпустин В. Н., Шаталов А. Г., Лашкевич В. А. 1990. Множественные формы белка NS1 как основного компонента невирионного («растворимого») антигена вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусол., № 6, стр. 471−474.
Дживанян Т.И., Чунихин С. П., Чупринская М. В., Лашкевич В. А. 1975. Изменчивость вируса клещевого энцефалита по ДС-признаку при пассажах через клещей и позвоночных животных. Материалы IX симпозиума «Экология вирусов», г. Душанбе, стр. 22−24.
Дживанян Т.И., Чунихин С. П., Лисак В. М., Каштанова Г. М., Королев М. Б. 1986.
Иммунохимические характеристики антигенов варианта вируса клещевого128энцефалита, адаптированного к клещам Hyalomma plumbeum. Вопр. вирусол., № 1, стр. 92−96.
Дживанян Т.И., Карганова Г. Г., Кондратьева Я. Ю., Лашкевич В. А. 1999. Изменение антигенной специфичности вируса клещевого энцефалита при смене хозяев. Материалы конференции «Актуальные проблемы вирусологии», Москва, стр. 23.
Злобин В.И. 2005. Клещевой энцефалит в Российской Федерации: современное состояние проблемы и стратегия профилактики. Вопр. вирусол., № 3, 26−32.
Иерусалимский А.П. 2001. «Клещевой энцефалит». Новосибирск, 360 с.
Карганова Г. Г. 1991. Зависимые от хозяина варианты вируса клещевого энцефалита и особенности их репродукции в клетках млекопитающих. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности вирусология.
Кимура М. 1985. Молекулярная эволюция: теория нейтральности. М., Мир, 520 с.
Кондратьева Я.Ю. 2005. Особенности экспериментальной инфекции, вызванной вариантами вируса клещевого энцефалита с высокой и низкой нейроинвазивностью. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности вирусология.
Леонова Г. Н., Майстровская О. С. 1996. Вирусемия у больных клещевым энцефалитом и у лиц с присасыванием иксодовых клещей. Вопр. вирусол., № 5, стр. 224−228.
Ляпустин В.Н., Лисак В. М., Грицун Т. С., Королев М. Б., Лашкевич В. А. 1985. Иммунохимический и электронномикроскопический анализ высокомолекулярных структур вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусол., № 4, стр. 419−426.
Ляпустин В.Н., Чунихин С. П., Решетников И. Н., Лашкевич В. А. 1987. Изменения синтеза вирионного антигена вируса клещевого энцефалита после пассирования через иксодовых клещей и мелких млекопитающих. Вопр. вирусол., № 4, стр. 451 456.
Малкова Д., Франкова В. 1959. Роль лимфатической системы в развитии клещевого энцефалита у мышей. Acta virol., т. З, стр. 210−214.
Мальдов Д.Г., Гмыль Л. В., Карганова Г. Г. 1997. Изменение активности Na+, К+ -АТФазы при репродукции вируса клещевого энцефалита в культуре клеток СПЭВ. Вопр. вирусол., № 4, стр. 23−26.
Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. 1984. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., Мир, 480 с.
Остерман Л.А. 1981. Исследование белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М., Наука, 286 с.
Пиванова Г. П., Баннова Г. Г., Бычкова М. В., Караванов А. С. 1990. Иммуногенная и гемагглютинирующая активность штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных от больных в разных частях нозоареала. Вопр. вирусол., № 3, стр. 49−51.
Погодина В.В., Бочкова Н. Г., Корешкова Г. В. 1981. Свойства штаммов серотипа Айна/1448 вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусол., № 6, стр.741−745.
Погодина В.В., Бочкова Н. Г., Карань Л. С., Фролова М. Н., Трухина А. Г., Маленко Г. В., Левина Л. С., Платонов А. Е. 20 046. Сравнительный анализ вирулентности сибирского и дальневосточного подтипов вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусол., № 6, стр. 24−30.
Погодина В.В. 2005. Мониторинг популяций вируса клещевого энцефалита и этиологической структуры заболеваемости за 60-летний период. Вопр. вирусол., № 3, стр.7−13.
Протопопова Е.И., Хусаинова А. Д., Коновалова С. Н., Локтев В. Б. 1996. Получение и характеризация антиидиотипических антител, несущих на своей поверхности гемагглютинирующие паратопы вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусол., № 2, стр. 50−53.
Протопопова Е.В., Коновалова С. Н., Локтев В. Б. 1997. Выделение клеточного рецетора для вируса клещевого энцефалита при помощи антиидиотипических антител. Вопр. вирусол., № 6, стр. 264−268.
Северцев А.С. 1987. Основы теории эволюции. М., Изд-во МГУ, 320 с.
Смородинцев А.А., Дубов А. В. 1986. Клещевой энцефалит и его вакцинопрофилактика. Л., Медицина.
Топчий М.К., Корнюшенко Н. П. 1967. Руководство к практическим занятиям по вирусологии. Киев, Издательство Киевского Университета, 248 с.
Фролова Т.В., Погодина В. В., Ларина Г. И. 1982. Активирующий эффект циклофосфана на поздних этапах персистенции вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусол., № 5, стр.578−585.
Чунихин С.П., Дживанян Т. И., Баннова Г. Г., Бабенко Л. В. 1975. Экспериментальное изучение роли иксодовых клещей в изменчивости вируса клещевого энцефалита по ДС-признаку. Мед. паразитол. и паразит, болезни, т.44, вып. 3, стр. 344−347.
Чунихин С.П., Дживанян Т. И. 1977. «Экологические маркеры» арбовирусов. ДС-маркер вируса клещевого энцефалита. Вестник АМН СССР, № 5, стр. 17−21.
Чунихин С.П., Куренков В. Б., Дживанян Т. И., Рыльцева Е. В. 1979. Изучение особенностей трансфазовой и трансмиссивной передачи штаммов вируса клещевого энцефалита с разной степенью патогенности для мышей. Мед. паразитол., № 2, стр. 61−65.
Чунихин С.П., Леонова Г. Н. 1985. Экология и географическое распространение арбовирусов. М., Медицина, 128 с.
Чунихин С.П., Решетников И. Н., Ляпустин В. Н. 1986. Изменчивость вируса клещевого энцефалита при пассировании через иксодовых клещей и мелких млекопитающих. Мед. паразитол. и паразит, болезни, № 6, стр. 58−61.
Шаповал А.Н. 1980. Клещевой энцефаломиелит. Ленинград, Медицина, 180 с.
Allison S.L., Stiasny К., Stadler К., Mandl C.W., Heinz F.X. 1999. Mapping of functional elements in the stem-anchor region of tick-borne encephalitis virus envelope protein E. J. Virol., v. 73, p. 5605−5612.
Bernfield M., Gotte M., Park P.W., Reizes O., Fitzgerald M. L., Lincecum J., Zako M. Functions of cell surface heparan sulfate proteoglycans. 1999. Annu. Rev. Biochem., v.68, p. 729−777.
Billoir F., Chesse R., Tolou H., Micco P., Gould E.A., Lamballerie X. 2000. Phylogeny of the genus Flavivirus using complete coding sequences of arthropod-borne viruses and viruses with no known vector. J. Gen.Virol., v. 81, p. 781−790.5558,59,60

Заполнить форму текущей работой