Клонирование, экспрессия и поиск белков-партнеров нового селен-содержащего белка млекопитающих

Актуальность проблемы.

Селен-содержащий белок V млекопитающих (SelV) относится к новому семейству Rdx белков, функции которых до конца остаются неизученными. Однако, наличие консервативного CXXC/CXXU (где С-цистеин, Хлюбая аминокислота, U-селеноцистеин) мотива в каталитических центрах данных белков и тиоредоксинподобной укладки свидетельствуют о их участии в окислительно-восстановительных реакциях [Dikiy A. et al., 2007].

Из двадцати пяти селенсодержащих белков человека, четыре, включая SelV, являются представителями данного семейства (SelW, SelH, SelT и SelV), среди которых первым был открыт SelW, обладающий способностью связываться в нативных условиях с 14−3-3 белками, составляющими большой класс белков, вовлеченных в ключевые физиологические процессы [Darling D.L. et al., 2005; Pozuelo R.M. et al., 2004; Van Heusden G.P.H.]. Важная роль в сопротивляемости клеток окислительному стрессу, индуцированному перекисью водорода [Novoselov S.V. et al., 2007], а также в ингибировании процесса образования супероксид аниона посредством поддержания уровня глутатиона в клетках [Ben Jilani К.Е. et al., 2007], принадлежит другому представителю Rdx семействаселеновому белку Н. При изучении SelT впервые было показано вовлечение селенсодержащих белков в.

ГЧ 2+ поддержание Сагомеостаза и контроль секреторной активности, что позволяет лучше понять роль селена в предотвращении человеческих болезней и рака.

Изучение нового белка осуществляется, как правило, по трем направлениям: определяется первичная структура белка, исследуется его локализация на клеточном и тканевом уровнях, осуществляется функциональная характеристика белка.

На данный момент известно, что селен-содержащий белок V млекопитающих (36.7 kDa) является гомологом известного белка SelW и несет дополнительный Nконцевой пролинбогатый домен, кроме того, показано, что мРНК SelV экспрессируется исключительно в семенниках (сперматоцитах). Одним из основных эффектов селена считается его влияние на мужскую фертильность, что особенно хорошо показано на моделях животных с нарушенным синтезом и/или метаболизмом селенсодержащих белков. Эти данные дают основание предположить, что SelV может играть важную роль в сперматогенезе [Kryukov G.V. et al., 2003], поэтому выяснение механизмов функционирования данного белка является крайне актуальной проблемой.

Данная работа посвящена исследованиям внутриклеточной локализации, поиску белковпартнеров SelV, а также определению экспрессии его мРНК на ключевых стадиях сперматогенеза и онтогенеза млекопитающих. Полученные в ходе нашей работы результаты способствуют установлению роли SelV в белковых комплексах или в метаболических путях, что очень важно для накопления фундаментальных знаний.

Цель работы.

Клонирование, экспрессия и поиск белков-партнеров нового селен-содержащего белка млекопитающих (SelV).

Задачи работы.

1. Клонирование полученных путем сайт-направленного мутагенеза вариантов рекомбинантного SelV мыши {Mus mus cuius) в составе векторов, предназначенных для экспрессии в прокариотической и эукариотической системах.

2. Определение локализации полноразмерного SelV, а также его Nи С-концевого доменов в клетках млекопитающих линии COS-7.

3. Поиск белков-партнеров SelV методом аффинной хроматографии в тандеме с масс-спектрометрическим анализом.

4. Исследование специфичности белок-белковых взаимодействий SelV и его партнеров методами коиммунопреципитации и ко-локализации в клетках млекопитающих линии COS-7.

5. Выявление экспрессии мРНК SelV, полученной на различных стадиях сперматогенеза и онтогенеза крысы (Rattus norvegicus), с помощью ПЦР.

Научная новизна работы.

Впервые определена локализация SelV в клетках млекопитающих. Методом аффинной хроматографии в тандеме с масс-спектрометрическим анализом идентифицированы возможные белки-партнеры SelV, взаимодействующие с ним путем образования межмолекулярных селенид-сульфидных связей. Ими оказались Оацетилглюкозаминтрансфераза (OGT), а также Asb-9 и Asb-17, относящиеся к семейству ASB (семейство белков, содержащих анкириновые повторы и SOCS-домен-супрессор сигнализации цитокинов). Проверена специфичность данных белокбелковых взаимодействий методам коиммунопреципитации потенциальных партнеров на аффинном матриксе, а также путем определения степени их совместной локализации в клетках млекопитающих. Определена локализация рассматриваемых белков-партнеров SelV в клетках млекопитающих линии COS-7. Установлено наличие экспрессии мРНК SelV в процессе онтогенеза и сперматогенеза крысы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

выводы.

1. SelV, так же как и его Nи С-концевые домены, характеризуется ядерно-цитоплазматическим распределением в клетках млекопитающих линии COS-7 и отсутствием локализации в митохондриях.

2. Методом аффинной хроматографии в тандеме с масс-спектрометрическим анализом идентифицированы возможные белки-партнёры SelV: OGT (О-связывающая N ацетилглюкозаминтрансфераза), Asb-9 и Asb-17, относящиеся к семейству ASB (семейство белков, содержащих анкириновые повторы и SOCS-домен-супрессор сигнализации цитокинов).

3. Методом ко-иммунопреципитации SelV с его потенциальными партнерами специфичность белокбелковых взаимодействий подтверждена для SelV и OGT (которое осуществляется посредством N-концевого домена OGT), а также SelV и Asb-9.

4. SelV, Nконцевой домен OGT и Asb-9 имеют одинаковый паттерн внутриклеточной локализации, что является косвенным доказательством специфичности их взаимодействий.

5. В семенниках крысы мРНК SelV экспрессируется на поздних стадиях сперматогенеза, а также на протяжении периода полового созревания и репродуктивного периода.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ Статьи.

1. Варламова Е. Г. Внутриклеточная локализация селен-содержащих белков млекопитающих: SelV (Selenoprotein V) и Gpx6 (Glutathion peroxidase 6). // Фундаментальные исследования, 2011, № 9 (2), с. 326−330.

2. Варламова Е. Г., Новосёлов С. В., Новосёлов В. И., Фесенко Е. Е. Новый селенсодержащий белок млекопитающих V: поиск белков-партнеров. // Доклады Академии Наук, 2011, том 441, № 3, с. 399−401.

3. Варламова Е. Г., Новосёлов В. И. Поиск партнеров нового селенового белка млекопитающих (SelV) и экспрессия его мРНК в процессе онтогенеза и сперматогенеза. // Молекулярная биология, 2012, том 46, № 2, с. 278−286.

Тезисы докладов.

1. Варламова Е. Г., Новосёлова Т. С., Черенков Д. А., Новосёлов С. В. Биохимическая характеристика селенового белка V (SelV). // Международная конференция «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии». Казань. 2008 г. с. 23.

2. Варламова Е. Г., Новосёлова Т. С., Черенков Д. А., Новосёлов С. В. Биохимическая характеристика селенового белка V (SelV). // XII Международная Пущинская конференция молодых ученых «Биология наука XXI века». Пущино. 2008 г. с. 10.

3. Варламова Е. Г., Новосёлов С. В. Биохимическая характеристика селенового белка V (SelV). // XV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов». Москва. 2009 г. с. 4.

4. Варламова Е. Г. Внутриклеточная локализация, поиск белков-партнеров и экспрессия SelV в процессе сперматогенеза и онтогенеза крысы. // XV.

Международная Пущинская конференция молодых ученых «Биология наука XXI века». Пущино. 2011 г. с. 9.

5. Варламова Е. Г., Новосёлов В. И. Новый селен-содержащий белок млекопитающих V (8е1У): поиск белков-партнеров, экспрессия его мРНК в процессе сперматогенеза и онтогенеза крысы. // Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова». Москва-Пущино. 2011 г. с. 15.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Данная работа направлена на выяснение функциональной значимости нового селенсодержащего белка млекопитающих (SelV) путем идентификации его физиологических партнеров и подтверждения специфичности таких белок-белковых взаимодействий с помощью независимых подходов, а также определение его внутриклеточной локализации и экспрессии мРНК SelV в процессе сперматогенеза и онтогенеза млекопитающих.

Являясь парнером OGT, SelV, скорее всего, подвергается процессу О-гликозилирования, осуществляемого данным ферментом и сопровождающегося переносом N-ацетил глюкозамина к сериновым и треониновым остаткам SelV. Данный вид посттрансляционной модификации белков, оказывающий существенное влияние на их стабильность (обычно усиливаемую гликозилированием), заряженность и нормальное функционирование в организме, характерен для таких ключевых ферментов, как РНК-полимераза 2, транскрипционные факторы, различные киназы и фосфотазы, а также для белков цитоскелета, белков теплового шока и др.

Другой предполагаемый партнер SelVAsb-9 относится к семейству ASB белков, характеризующихся наличием анкириновых повторов и С-концевого SOCS-домена (SOCSсупрессор сигнализации цитокинов). Известно, что белки, обладающие таким доменом помимо участия в регуляции сигнализации цитокинов, осуществляемой посредством ингибирования Янус киназы, также вовлечены в убиквитин-опосредованную протеасомную деградацию белков. Так, было показано, что Asb-9, действуя подобно специфической ЕЗ убиквитин-лигазе, участвует в деградации митохондриальной креатинкиназы (uMtCK) и креатинкиназы мозга (СКВ) и, тем самым, является эффективным регулятором энергетического статуса клеток. Кроме того известно, что данная функция Asb-9 аналогична таковой, характерной для другого SOCSдомен содержащего белкаWSB-1 (белки,.

84 имеющие WD повторы и SOCSдомен), который осуществляет убиквитин-опосредованную деградацию одного из 25 известных селен-содержащих белков млекопитающихдейодиназы второго типа (DI2). Таким образом, SelV может служить мишенью для Asb-9 белка, который способствует его убиквитинилированию путем взаимодействия с элонгин В/С комплексом посредством С-концевого SOCSдомена, и тем самым, осуществляет его протеолиз. Однако данные об экспрессии мРНК SelV и Asb-9, свидетельствующие об одновременном синтезе и функционировании этих белков в семенниках млекопитающих, заставляют задуматься об их совместном участии в процессах, происходящих в данном органе, например, в созревании и дифференцировке сперматид, конденсации хроматина сперматозоидов, в антиоксидантную защиту стероидных гормонов в клетках Лейдига и др.

Таким образом, результаты, полученные в рамках настоящей работы, с одной стороны, представляют собой ценную информацию, необходимую для выяснения функциональной роли SelV в организме млекопитающих, а с другойслужат важным дополнением к уже существующим данным о идентифицированных нами физиологических партнерах исследуемого белка: OGT (О-связывающая N ацетилглюкозаминтрансфераза) и Asb-9.