Изучение действия излучений ультрафиолетовой и красной областей спектра на иммунокомпетентные клетки

В последнее время все большее внимание исследователей привлекает к себе проблема механизмов ответных реакций неретинальных клеток животных на действие оптического излучения, которое, включая ультрафиолет, составляет основную часть излучения солнца, падающего на поверхность Земли. Обладающее наибольшей энергией ультрафиолетовое излучение (УФИ) даже в низких дозах вызывает негативные для клетки последствия. Прежде всего • это относится к коротко- (КУФ, менее 280 нм) и средневолновому (СУФ, 280(2®0)-320 нм) участкам УФ-спектра. В связи с возрастающим присутствием в достигающем/земной поверхности солнечном излучении именно этих спектральных диапазонов, имеющим место вследствие повреждения озонового слоя атмосферы, проблема его действия на клетки и организм представляет большой интерес для биологии и медицины. Механизмы деструктивного действия УФИ на клеточном уровне в широком диапазоне доз в основном изучены. В центре внимания исследователей в настоящее время находятся практические и теоретические вопросы УФ-индуцированных канцерогенеза, эритемы и повреждений сетчатки глаза, то есть негативные эффекты на уровне организма. Вместе с тем, ультрафиолет естественного и антропогенного происхождения активно применяется в медицине как при лечении заболеваний кожи, так и внутренних органов в методе аутотрансфузии облученной крови.

Knott, 1948). В последнем Случае в качестве воздействующего фактора используются.

• <�" главным образом именно КУФ и СУФ (Холмогоров и др., 1988). Известны и модифицирующие эффекты УфИ на клеточном уровне (Оболенская и др., 1988; Deoliveira et al, 1996).

Интерес к модифицирующим клеточным эффектам оптического излучения объясняется широким распространением терапевтических подходов в медицине, связанных с его применением для лечения трофических расстройств, дерматитов, незаживающих ран и т. д. Особенно часто в этих целях используется излучение красной и ближней инфракрасной областей спектра (600−900 нм), в частности, излучение He-Ne лазера (632.8 нм). Несмотря йа большое количество публикаций по этой проблеме (Каш, 1989) и наличие ряда интересных гипотез относительно механизмов клеточных и организменных эффектов красного света (Зубкова, 1978; Гамалей и др., 1988; Владимиров, Потапенко, 1989; Клебанов и др., 1998) остаются открытыми вопросы о первичных акцепторах этого излучения и способах реализации ответов на него.

В реализации модифицирующих клеточных эффектов как ультрафиолетового излучения, так и оптического излучения других длин волн могут участвовать системы мессенджерной регуляции (Schieven G.L., Ledbetter J.А., 1993), к числу которых относят и систему регуляции внутриклеточного рН (Busa, Nuccitelli, 1984). Сравнительно недавние исследования показывают, что изменения концентрации вторичных мессенджеров, вызванные УФ-облучением, способны обеспечить как запуск репарационных механизмов (Ganer et al, 1997), так и разщтие апоптоза (Gottlieb et al, 1996). Обсуждается также роль активных форм кислорода (АФК), образующихся при УФ-облучении (Зенков, Меньшикова, 1993; Zhang et al, 1997), в обеспечении как негативных последствий для клетки (повреждения мембран, белков и ДНК) (Shindo, Hashimoto, 1998), так и модификаций ее функции (Amano et al, 1998). В последнем случае определенное участие в обеспечении эффектов оптического излучения на клетки может принимать наиболее стабильная АФК — перекись в. одорода, регуляторная роль которой привлекает в настоящее время большое внимание исследователей (Гамалей, Клюбин, 1996).

Большой интерес представляет разрабатываемая российскими учеными (Фрайкин и др., 1995) проблема защитного эффекта облучения дрожжевых клеток красным светом от действия УФ-излучения, приводящего к отсроченной гибели клеток. Предполагается, что красный свет вызывает активацию репарационных механизмов ДНК, повреждающейся уже при сравнительно небольших дозах ультрафиолета. Неизвестно, однако, способно ли облучение красным Светом защищать клетки от повреждений их мембран, имеющим место при значительно более высоких дозах УФ-облучения и более коротких временах пострадиационной инкубации.

При анализе механизмов действия оптического излучения особый интерес представляют клетки, участвующие в обеспечении иммунного гомеостаза организма. К их числу относятся и клетки-фагоциты, обладающие высокой активностью и способностью быстро отвечать на внешние воздействия (Маянский Д.Н., Маянский А. Н., 1983).

Таким образом, несмотря на значительные успехи, достигнутые в последние годы проблема механизмов реализации клеточных эффектов оптического излучения еще далека от своего окончательного разрешения. При этом следует подчеркнуть, что помимо важного теоретического, она имеет и большое практическое значение.

II. Обзор литературы.

11.1. Биологические эффекты и механизмы действия ультрафиолетового излучения на клетки.

В настоящее время все больший интерес для медицины и биологии вызывает проблема увеличения присутствия ультрафиолетового излучения (УФИ) естественного и антропогенного происхождения в биосфере. История изучения этого вопроса насчитывает уже несколько десятков лет, Однако, он еще далек от своего окончательного разрешения. К настоящему времени выявлены основные механизмы действия дальнего УФИ на прокариотические клетки. Фотобиология же клеток млекопитающих и, в частности, в области ближнего УФИ значительно менее изучена.

Показано, что главной. внутриклеточной мишенью при летальном и мутагенном действии ультрафиолетового д&лучения служит ДНК. Еще в 1928 году было выяснено, что спектр действия гибели бактерий соответствует спектру поглощения нуклеиновых кислот (максимум поглощения ДНК равен 254 нм). Для клеток млекопитающих эти спектры несколько отличаются, но Наблюдаемые различия могут быть объяснены эффектами самоэкранировки, которые дЛд коротковолнового излучения более значительны у клеток млекопитающих, чем у 'бактериальных клеток (Сахаров, 1988). Наиболее распространенное фотоповреждение ДНК — образование пиримидиновых димеров. Могут также происходить фотогидратация пиримидиновых оснований, сшивки ДНК с белками, разрыв цепей ДНК. Характер. повреждений зависит от дозы и длины волны излучения, а также наличия сенсибилизаторов. Так, при облучении УФИ с длинами волн больше 310 нм димеры и разрывы ДНК. образуются косвенным путем с участием определенных сенсибилизаторов, поскольку" - длинноволновая граница ее поглощения лежит в области 300−310 нм (Фрайкин, 1908). Установлено, что процесс образования димеров осуществляется не по фотодинамическому механизму, а путем молекулярной фотосенсибилизации. В то ж£- время, разрывы ДНК образуются с участием свободных радикалов и синглетного кислорода. Показано, что НАДН обладает способностью к фотосенсибилизации образования in vitro однонитевых разрывов в двуцепочечной плазмидной ДНК под действием ближнего УФИ (320−400 нм) (Бурчуладзе и др., 1990). Отношение выхода димеров к выходу одноцепочечных разрывов в ДНК уменьшается с увеличением длины волны УФ-света. Так, при облучении светом с длиной волны 254 нм данное отношение равно 800, при 313 нм — 25, а при 365 нм — 1.7. Очевидно, что это сказьюается на относительном вкладе димеров и разрывов в длинноволновую УФ-инактивацию клеток (Фрайкин, 1988).

У клеток млекопитающих, способных к делению, одним из способов регуляции развития опухолей вследствие облучения ультрафиолетом является апоптоз. Так, облучение В-УФИ вызывало апоптоз у нескольких линий клеток лейкимии (Ueno Е., 1997), в то же время, индукция дифференциации этих клеток приводила к задержке в развитии апоптоза. Однако, апоптоз известен и для высокодифференцированных клеток, каковыми являются нейтрофилы (Frasch et al, 1998).

В липидных система^' ультрафиолетовое облучение активизирует протекание процессов перекисного окисления (Bateman, Gec, 1984). Показано, что большую чувствительность к фотоокислению проявляют ненасыщенные жирные кислоты, насыщенные же жирные кислоты практически не подвергаются фотоокислению. Фотоокислению легко подвергается также холестерин, значительный процент которого содержится в клеточных мембранах млекопитающих (Черницкий, Воробей, 1988). В пострадиационный период в облученных мембранах протекают процессы аутоокисления, инициируемые первичными фотопродуктами. Процессы аутоокисления идут гораздо медленнее фотоокисления, но за длительный темновой период могут приводить к значительному повреждению мембраны (Пеленицин и др., 1974). Темновое аутоокисление липидов в облученных мембранах может блокироваться низкими концентрациями антиоксидантов: ионола, а-токоферола, ß—каротина, аскорбиновой кислотой и др. (Рощупкин и др., 1988). На основании этого было выдвинуто предположение, что одной из причин стимуляции УФ-светом темнового фотоокисления липидов является фотолиз эндогенных антиоксидантов, прежде всего а-токоферола.

Много работ посвящецо изучению влияния УФИ на белки. Как правило, такое воздействие является инактивирующим. Показано, что при облучении растворов белков ультрафиолетовым светом наблюдается потеря ферментативной активности, изменение молекулярной массы, растворимости, спектров поглощения и других физических и химических характеристик: (Конев, Волотовский, 1979). Возможный механизм инактивации был установлен Гроссвейнером с сотрудниками (Grossweiner et al, 1976). Определяющей начальной фотохимической реакцией в механизме фотоинактивации всех изученных ферментов является ионизация остатков триптофана, тирозина и фенилаланина с образованием гидратированного электрона и последующими модификациями этих аминокислот (Pileni, 1976;' Saito, 1978). Ароматические аминокислоты поглощают ультрафиолет с^тах в области280 нм. Дальнейшие процессы специфичны для различных белков. Установлено, что это. свободнорадикальные процессы, могущие идти даже без участия кислорода. Результатом их протекания может быть частичная или полная фотодеструкция молекулы белка с образованием низкомолекулярных фрагментов СО и NH=CHR (Львов, Львова, 1988). Кроме того, захват электрона аминогруппами основных аминокислот лизина и аргайгйна приводит к дезаминированию остатков, а реакции гидратированного электрона-с серосодержащими аминокислотами цистином, цистеином приводят к образованию радикалов типа RS. При относительно сильном поглощении УФИ дисульфидными связями в некоторых белках имеет место прямой фотолиз этих связей (Baugher, Grossweiner,. 1978). При достаточной концентрации кислорода в системе ионизация ароматических ¿-кинокислот может приводить к образованию супероксид аниона Ог", либо попадание кванта ультрафиолета на ароматическое кольцо приводит к прямому переносу энергии на кислород с образованием синглетного кислорода ('Ог) без ионизации (Pileni et al, 1976; Холмогоров и др., 1988). Таким образом, поглощение остатками ароматических. Аминокислот коротковолнового ультрафиолета может щ приводить к сенсибилизации цепных реакций как с участием активных форм кислорода, так и без них, приводящих к Модификациям и деструкции клеточных молекул.

Описанные эффекты УФИ при действии его на клеточные белки в больших дозах приводят в конечном итоге к гибели клетки. Менее высокие дозы УФИ на всем диапазоне длин волн способны вызывать транскрипцию многих генов, что, как считают некоторые исследователи, обусловлено фосфорилированием белков-рецепторов клеточных факторов роста, что, в свою очередь, вызвано нарушением функции тирозиновых фосфотаз этих белков при облучении УФИ'-(Bender et al, 1997). Характер более отдаленного ответа клетки на облучение будет'-'зависеть от летальности повреждений ее ДНК, и, если повреждения незначительны, то можно ожидать пролиферативного ответа. В то же время, в клетках, как прокариотических, так и эукариотических, существуют механизмы запуска синтеза так называемых белков теплового шока при сильных стрессовых воздействиях, к числу которых относится и УФИ. Механизм запуска системы синтеза этих белков при действии УФИ пока не известен (Trautiger F. et al, 1996), но по всей видимости может вовлекать системы сигнальной трансдукции.

Интересные данные были получены при изучении действия УФИ (240−390 нм) в о дозах 0.015−0.3 Дж/см на один из важнейших компонентов антиоксидантной системы супероксидцисмутазу (АртюхЪв и др., 1992). Как оказалось, облучение приводит к фотоактивации фермента, наиболее выраженной при экстремальных для проявления активности супероксиддисмутазы значениях рН (меньше 6.0 или больше 10.0 ед. рН). л.

Максимальный эффект достигался при 0.15 Дж/см. Наблюдаемая фотоактивация супероксиддисмутазы обусловлена, как полагают, конформационными изменениями ее белковой глобулы.

При изучении продуктов облучения белков плазмы крови было установлено, что триптофан и гистидин способны после фотолиза давать соединения, обладающие антирадикальной активность^, в то время, как природные антиоксиданты, содержащиеся в плазме (прежде всего, аскорбиновая кислота) утрачивают антирадикальную активность (Удилова и др., 1997). .

Одной из основных мишеней для УФИ является клеточная мембрана. Облучение клеток в высоких дозах приводит к значительному увеличению проницаемости мембран для различных веществ, в том числе, и для красителей (эозина, трипанового синего, этидиум бромида), и их гиб|ли (Мопэоп ег а1, 1979). УФИ вызывает изменение ионной V проницаемости в различных, объектах: дрожжах, яйцах морского ежа, водорослях, простейших и др. (Владимиров, Потапенко, 1989). Изменение ионной проницаемости в эритроцитах человека сопровождается выходом из них К+ и входом № +, что приводит вследствие нарушения осмотического баланса к набуханию и лизису клеток (Рощупкин и др., 1988). Показано также" повышение при облучении пассивной проницаемости внутренней мембраны митохондрий для Н+, Ыа+ и К+, в результате чего происходит разобщение окислительного фосфорилирования. УФИ инактивирует мембранные ферменты митохондрий и эритроцитов. Анализ относительного вклада в повреждение мембран, вызванного УФИ, окисления липидов и инактивации белков показал, что действие больших доз облучения связано с перекисным окислением ненасыщенных жирных кислот биологических мембран. При действии же более низких доз больший вклад вносит денатурация белка (Владимиров, Потапенко, 1989). Показано также, что у разных субпопуляций одногои того же вида клеток (в частности, лимфоцитов) могут преобладать разные механизмы фотоповреждения мембран, зависящие и независящие от перекисного окисления липидов (Рощупкин и др., 1988). Важной особенностью перекисного фотоокисления ненасыщенных жирных кислот в биологических мембранах является зависимость его скорости от структурного состояния мембран. Показано Чзначительное влияние рН перекисное фотоокисление липидов в мембранах эритроцитов. Увеличение рН. от 5 до 9 приводит к интенсификации процесса в несколько раз. По мнению авторов, наблюдаемый эффект связан с изменением структурного состояния липидов мембрйн,. опосредованным изменением структуры белков при изменении рН. В то же время, значительное влияние температуры на процессы перекисного фотоокисления обусловлено ее влиянием непосредственно на состояние липидной части мембраны (Рогцупкин и др., 1988; Рощупкин и Мурина, 1993; Roshchupkin et al, 1978).

Способность ультрафиолета вызвать модификации клеточных мембран обуславливает известные эффекты его действия на уровне организма, в частности, такие явления, как эритему (Warin А., 1978) и терапевтические эффекты реинфузии облученной крови (Савельев и др., 1981; Knott, 1948).

Ультрафиолет, особенно коротковолновый, поглощаясь белками и нуклеиновыми кислотами, практически не проходит сквозь верхние слои кожи. При этом происходит модификация клеток иммунной системы в капиллярах и непосредственно в коже. Основную часть солнечного УФИ составляют Аи ВУФИ в диапазонах 320−400 нм и 280−320 нм, соответственно, большинство эффектов такого УФИ на уровне организма иммуносупрессивны. Это и ослабление аллергических контактных дерматитов, подавление замедленной. гиперчувствительности к антигенам, увеличение продолжительности жизни чужеродных клеток, увеличение риска развития опухолей (Roberts, 1995). Эти эффекты опосредованы действием ультрафиолета непосредственно на клетки кожи, что приводит к высвобождению цитокинов, интерлейкинов и факторов роста, модулирующих клетки иммунной системы. Так, при взаимодействии локально-продуцируемых при облучении В-УФИ цитокинов с представляющими антиген клетками происходит их миграция из верхних слоев кожи, что приводит к антиген-специфической толерантности (Ohnishi Т., 1993; Boonstra А., 1997). Установлено также, что развитие вириса ВИЧ усиливается в облученных клетках благодаря активации клеточного фактора траскрипции NF-каппа-В, которая происходит как в облученных клетках, так и при действии растворимых факторов, высвобождающихся при облучении, на необлученные клетки (Visenzi Е., 1994). у.

•у.

Облучение плотвы в .дозе 0.4 Дж/см приводило к уменьшению миграции фагоцитов, выделенных из почки, и способности их к окислительному взрыву через 1−2 суток после облучения. Однако, по прошествии 14 суток активность нейтрофилов и макрофагов восстанавливалась и даже превосходило норму (Salo et al, 1998). Возможность увеличения активности клеток, обеспечивающих природный неспецифический иммунитет (фагоциты) после облучения была также установлена в экспериментах по изучению влияния облучения В-УФИ мышей на развитие в организме бактерии Listeria monocytogenes. В то же время, облучение ультрафиолетом снижало иммунитет, приобретенный после предварительной иммунизации мышей (Kang I.C. et al, 1997).

Облучение непосредственно клеток иммунной системы, что имеет место в методе аутотрансфузии облученной крови, приводит к прямым фотохимическим реакциям мембранных липидов и белков. В этом методе применяется УФИ в дозах и интенсивностях, не ведущих к гибели клеток. Механизмы влияния на клетки терапевтических доз УФИ изучены далеко не так хорошо, как летальных. Это объясняется тем, что вызываемые ими эффекты весьма многоплановы и сложны и, в значительной степени, зависят от многих факторов (спектрального состава излучения, дозы, интенсивности и др.). На — сегодняшний день установлено, что при действии на выделенные из крови человека мононуклеары и эритроциты излучения различного спектрального состава в нелетальных дозах, близких к применяемым в терапии, внешний поверхностный слой клеток подвергается частичной деструкции, а его компоненты выходят в раствор (Оболецская и др., 1988). При исследовании функциональных последствий структурных изменений гликокаликса облученных клеток крови был установлен ряд фактов, указывающих на значительную активацию специализированных систем клеточной поверхности, обусловленную, вероятно, их обнажением и демаскированием. В частности, значительно возрастает фагоцитарная активность моноцитов и гранулоцитов (Оболенская и др., 1988). Способность УФИ (320−400 нм) в дозе 0.3*104 Дж/м2 повышать функциональную активность (люминолзависимую, активируемую хемотаксическим пептидом FMLP хемилюминесценцию) нейтрофилов человека была показана в работе (Bredberg, Forsgren, 1985). В то же время, облучение этих клеток в диапазоне 306−428-.нм в дозе 0.63−10.17 кДж/м2 приводило к снижению их фагоцитарной активности, сопровождающемуся потерей клетками специфических мембранных рецепторов, определяющих их иммунные характеристики (Вальтер и др., 1989). Изучение фотомодификации рецепторов поверхности лимфоцитов крови человека при их облучении УФИ в области 275−365 нм в нелетальных дозах (24−60 Дж/м2) показало, что в течение 60 мин после воздействия происходит возрастание их способности к образованию Еи ЕАСрозеток с эритроцитами барана. Повышение доз облучения до 96 180 Дж/м2 подавляло эту способность лимфоцитов. В этих же условиях происходила модификация выраженности группоспецифических антигенов эритроцитов системы ABO, v изучавшаяся в реакциях агглютинации с соответствующими изогемагглютининами (Холмогоров и др., 1988). Предполагается, что в основе наблюдаемых изменений иммунологических характеристик клеток крови лежат в основном процессы перекисного окисления липидов, изменяющие физико-химические свойства плазматических мембран. Кроме того, конформационные изменения белковых молекул мембраны, вызванные нарушением их третичной (гйшогда вторичной и первичной) структуры могут вести к появлению на мембране «новых» маркеров, рецепторов и антигенов, что повышает «спектр» возможных мишеней иммунной системы и способствует проявлению лечебного эффекта (Холмогоров и др., 1988).

Большое внимание уделяется в настоящее время изучению механизмов действия средневолнового УФИ (29−0(280)-320 нм), ответственного за значительную часть.

V i канцерогенных эффектов солнечного облучения. Показано, что облучение меланоцитов в этом диапазоне приводит к' задержке их пролиферации в фазе G1. Это обусловлено модификацией ряда процессор участвующих в протекании клеточного цикла (Barker et al, 1995; Medrano et al, 1995)-? Весьма интересные результаты получены при изучении комбинированного действия на клетки разных длин волн ультрафиолетового излучения. Так, на бактериях и дрожжах было показано (Фрайкин, 1988), что при этом могут наблюдаться разные типы синергических эффектов (летальные, фотореактивационные и фотозащитные).

Основные процессы, происходящие в клетке при действии средневолнового ультрафиолетового излучения представлены на Схеме 1.

Таким образом, если на сегодняшний день механизмы действия УФИ в высоких летальных дозах в достаточной степени понятны, то вопрос о действии на клетки животных низких доз УФ-излучения требует дальнейших углубленных исследований.

V. Выводы.

1) Показано, что облучение изолированных нейтрофилов средневолновым л ультрафиолетом в дозах, превышающих 2.1 Дж/см, приводит к увеличению содержания в.

V. популяции клеток с повреждейной плазматической мембраной. Максимум в спектре повреждающего действия УФИ на клетки наблюдается в области 280 нм. Эффект возрастает с повышением температуры и времени темновой инкубации клеток и снижается при уменьшении концентрации Ог в среде и действии антиоксидантов.

2) Обнаружено, что' УФ-излучение в дозах, не вызывающих повреждения клеточных мембран (0.2 — 2.1 Дж/см2), приводит к отсроченному во времени снижению выживаемости и пролиферативной активности клеток. Облучение в более низких дозах вызывает в короткие сроки после облучения увеличение эстеразной активности и рН внутриклеточного содержимого.:

3) Выявлены фазовые изменения внутриклеточного рН при действии УФ-излучения и красного света в. дозах от 0.02 до 12.7 Дж/см2, сопровождавшиеся сходными изменениями содержания в клетках АТФ, эстеразной и фагоцитарной активности.

5 .

4) Обнаружено, что повреждающее действие УФ-облучения на клетки снижается при одновременном облучении их красным и ближним инфракрасным светом с длиной волны около 700 нм и более. Защитное действие красного света оказывается менее выраженным при его применении до или после УФ-облучения клеток.

5) Показано, что введение во внеклеточный раствор Н2О2 в концентрации превышающей 25 мМ, приводит к возрастанию содержания в популяции нейтрофилов клеток с поврежденной мембраной.

6) Обнаружено, что введение в среду инкубации клеток перекиси водорода (Ю'МО" 10 М) вызывает зависящие от концентрации агента и времени инкубации фазовые изменения внутриклеточного рН.

7) Показано, что фазовые изменения внутриклеточного рН, имеющие место при действии на нейтрофилы Н2О2, а также УФ-излучения и красного света в низких дозах, исчезают при ингибировании Na/H-обменника клеток и действии каталазы (0.1 мг/мл).

VI. Список сокращений.

АТФаденозинтрифосфорная кислота ДНКдезоксирибонуклеиновая кислота.

ЕГТАэтиленгликоль-бис-(р-щиноэтил)-М, Н,]Ч', М'-тетраацетиловая кислота.

НСТнитросиний тетразолий.

ФДАфлуоресцеиндиацетаЩ.

УФИультрафиолетовое изучение цАМФциклический моноаДеяозинтрифосфат.

НМАгексаметиленамилорйД.

НЕРЕв- (Ы-[2-Гидроксиэтилпцперазин^'-[2-этансульфоновая кислота]).