Изучение молекулярных механизмов антимикробной защиты морской звезды Asterias Rubens

Многоклеточные организмы в ходе своей жизнедеятельности постоянно контактируют с бактериями. Обширные и зачастую многокомпонентные межклеточные структуры многоклеточных животных, через которые идет диффузный транспорт кислорода, минеральных и питательных веществ, представляют собой пригодный субстрат для бактериального роста. Проникновение во внутреннюю среду организма тем легче, чем меньше размеры потенциальных патогенов. Оно тем опаснее для организма-хозяина, чем активнее проникающие патогены способны расти и размножаться в его внутренней среде, не подчиняясь регуляторным сигналам в нее поступающим, исчерпывая ее питательные возможности, меняя минеральный баланс, нарушая регуляторпую целостность и иптегральность управления в организме (см. обзоры на тему Bals, 2000; Peschel, 2002: Boman, 2003; Agerberth &-Gudmundsson, 2006 и др).

Живые системы — это системы открытые. В силу разных причин, в том числе, и функциональной необходимости, внутренняя среда не может быть абсолютно изолирована от среды, окружающей организм: должны осуществляться потоки вещества и энергии. Более того, изолирующие свойства эпителиев могут нарушаться в результате травмирующего воздействия из внешней среды. Следовательно, многоклеточный организм не всегда может предотвратить доступ патогенного начала к питательным ресурсам своей внутренней среды. Способность быстро сопротивляться активно развивающейся микробной (в первую очередь, бактериальной) инвазии является, таким образом, жизненной необходимостью для любого многоклеточного организма. Вместе с эпителиальными барьерами эта способность вносит важный вклад в поддержание постоянства состава внутренней среды организма (см. Bals. 2000; Boman, 2003 Braff & Gallo, 2006; Yeaman & Bayer, 2006; и др.).

Реакции многоклеточного организма, обеспечивающие врожденную невосприимчивость к микробным патогенам (система антимикробной защиты), разнообразны. Комплекс этих реакций могут составлять факторы как быстрого, так и медленного реагирования: присутствующие постоянно или появляющиеся ипдуцибельно, эффекторного или регуляторного действия (см. Loker et al., 2004; Кокряков, 2005; Bowdish et al., 2005; Agerberth &-Gudmundsson, 2006 и др.). В зависимости от степени сложности такой системы она способна принимать на себя целый ряд дополнительных функций (см. Elbach, 2003; Yeaman & Bayers, 2006). Изучение имеющегося в природе разнообразия защитных антимикробных систем, построение морфо-функциональных рядов и понимание логики усложнения этих систем в связи с уровнем организации и систематическим положением организма представляет значительный теоретический интерес.

Антимикробные пептиды являются одной из важнейших компонент защитной системы немедленного реагирования. Ныне описано более 1000 пептидов с антимикробной активностью (см. базу данных http://www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/amsdb.html). Большая часть этих пептидов была выделена из позвоночных животных, доля которых в общем биоразнообразии многоклеточных весьма незначительна. Среди морских беспозвоночных исследования молекулярных компонентов антимикробной защиты проводились лишь на ограниченном числе модельных видов. Вовлечение в круг рассмотрения представителей неисследованных (или малоисследованных) таксонов, выделение и изучение новых антимикробных пептидов имеет не только упомянутое ранее теоретическое значение, но также и значительный практический интерес. Проблема появления среди патогенных микробов линий, устойчивых к действию так называемых классических антибиотиков (микробного происхождения), имеет давнюю историю (Ваксмаи, 1946/ С течением времени эта проблема становится все более острой. Антимикробные пептиды представляют собой возможную альтернативу классическим антибиотикам, т.к. (что будет подробнее рассмотрено ниже) не приводят к появлению устойчивых линий микроорганизмов в ряду поколений (см. Hancock & Diamond, 2000; Gallo et al, 2002; Vizioli & Salzet, 2002; Zasloff. 2002; Yeaman & Yount, 2003; Reddy et al., 2004 и др.).

Иглокожие как относительно примитивные представители вторичноротых могут служить важным звеном для сравнительной морфо-функциональной характеристики систем антимикробной защиты в различных филогенетических ветвях многоклеточных животных. Изучение защитной системы иглокожих позволяет провести сравнительный анализ таких систем между первичнои вторичноротыми беспозвоночными, а также между позвоночными и беспозвоночными вторичноротыми. Кроме того, иглокожие представляют собой сравнительно крупных полостных животных, удобных для экспериментальных исследований. Все это делает массовых беломорских морских звезд Asterias riibens (Echinodermata, Asteroidea, Forcipulata, Asteriidae) в высшей степени привлекательным объектом для сравнительно-иммунологических исследований.

Реализация защитных реакций — это функция тканей внутренней среды (см. Горышина & Чага, 1990), каковые у иглокожих представлены, в первую очередь, целомической жидкостью, наполняющей обширную полость тела и населенной целомоцитами. Наличие антимикробной активности у иглокожих было показано в различных тканях и органах (Wardlow & Unkles, 1978; Rinehart et al., 1981; Canicatti, 1990; Bryan at al., 1994; Haug et al. 2002 и др.), в том числе, и в целомической жидкости морской A. rubens (Jolies & Jolies, 1975; Haug et al., 2002). Из факторов этой активности были идентифицированы только лизоцим (Jolies & Jolies, 1975) и «дефенсин-подобпый» антимикробный пептид (Мирончик, 1999). Однако для изученных видов обычным является присутствие в одном организме 15−40 различных антимикробный пептидов (см. Boman, 2003). Поэтому нами и было предпринято более подробное исследование целомической жидкости A. rubens на предмет присутствия млекул с антимикробной активностью, в первую очередь, антимикробных пептидов.

Таким образом, целью нашей работы являлось: охарактеризовать антимикробный защитный потенциал целомической жидкости морской звезды A. rubens.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи.

1. Получение экстрактов из форменных элементов целомической жидкости морской звезды Asterias rubens, и выявление присутствия антимикробной активности в этих экстрактах и/или в плазме целомической жидкости.

2. Идентификация активных компонентов и выделение их в чистом виде.

3. Изучение физико-химических свойств выделенных пептидов, их секвенирование. сравнительный анализ и поиск структурно или функционально близких пептидов среди уже описанных молекул.

4. Синтез искусственных аналогов для более детального изучения их биоактивности.

5. Характеристика антимикробной активности выделенных пептидов: широты спектра ингибирующего действия, а также механизма реализации этого действия. ip 6. Характеристика связи структурных особенностей пептидов с механизмом антибактериального действия.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

АГ: аппарат Гольджи амк: аминокислота АП: антимикробный пептид ЛПС: липополисахарид.

МИК: минимальная ингибирующая концентрация.

МТТ: 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид нт: нуклеотид.

НФБ: натрий-фосфатный буфер

ОТ ПЦР: полимеразная цепная реакция с обратный транскриптом ОФ ВЭЖХ: обратно фазовая высоко эффективная жидкостная хроматография ПААГ: полиакриламидный гель ^ пн: пара нуклеотидов.

ПЦЖ: плазма целомической жидкости ПЭФ: препаративный электрофорез С1-С9: компоненты комплемента СМВ: стерильная морская вода СФ: спектрофотометр

ФАМ: протеолитические фрагменты с антимикробной активностью ЦЖ: цел омическая жидкость.

Эо, Э|, Э2: экстракты из целомоцитов, полученные в соответствующей номеру очередности.

ЭДТА: этанолдитиоацетат.

ЭПР: эндоплазматический ретикулум.

ЯМР: ядерно-магнитный резонанс.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

АГ: аппарат Гольджи амк: аминокислота АП: антимикробный пептид ЛПС: липополисахарид.

МИК: минимальная ингибирующая концентрация.

МТТ: 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид нт: нуклеотид.

НФБ: натрий-фосфатный буфер

ОТ ПЦР: полимеразная цепная реакция с обратный транскриптом ОФ ВЭЖХ: обратно фазовая высоко эффективная жидкостная хроматография ПААГ: полиакриламидный гель ^ пн: пара нуклеотидов.

ПЦЖ: плазма целомической жидкости ПЭФ: препаративный электрофорез С1-С9: компоненты комплемента СМВ: стерильная морская вода СФ: спектрофотометр

ФАМ: протеолитические фрагменты с антимикробной активностью ЦЖ: целомическая жидкость.

Эо, Э|, Эг: экстракты из целомоцитов, полученные в соответствующей номеру очередности.

ЭДТА: этаполди гиоацетат.

ЭПР: эндоплазматический ретикулум.

ЯМР: ядерно-магнитный резонанс.

AI (accession index): регистрационный индекс последовательности в базе данных ArAct-1,2: пептиды морской звезды, представляющие фрагменты актина ArFln-1: пептид морской звезды, представляющий фрагмента филамина ArFln-lsy": синтетический аналог ArFln-1.

ArFln-Rsyn: синтетический аналог ArFln-1, укороченный на одну аминокислоту (глицин) и с заменой изолейцина (I^) на аргинин ®.

ArHst-1,2: пептиды морской звезды, представляющие собой фрагменты гисюпа Н2А CFU (colony forming unit): колония-образующая единица FInA (filamin А): филамин А, актин-связывающий белок.

GNBP (gram-negative bacteria binding protein) белки, связывающие клетки грам-отрицатсльных бактерий.

GRP (/?-l-3-glyean recognizing protein): белки, распознающие /?-1−3-гликан HBD (human beta defensin): /?-дефенсип человека Ig (immunoglobulin): иммуноглобулин IL-1 (interleukin-1): интерлейкин-1.

LRR (leucine reach repeat): лейцин-богатый повтор в составе рецепторных белков MALDI TOF (matrix associated laser desorption ionizationtime of flight): время пролетная масс-спектрометрия с лазерной десорбционной ионизацией на матрице МАРК (mitosis activating protein kinase): протеинкиназа, активируемая в ходе митоза MeCN: ацетонитрил.

MW (molecular weight): молекулярный вес.

NLP (NACHT and LRR proteins): рецепторы, содержащие NACHT и LRR-домены NP (neutrophil jjrotein): «-дефенсин кролика OD (optical density): оптическая плотность.

ONPG (orthonitroj)henylgalactoside): орто-нитрофенил-галактозид.

PAMP (pathogen associated molecular pattern): молекулярные комплексы, маркирующие клетки (частицы) патогена.

RGD (arginine, glycine, aspartate): трипептид, узнаваемый инегировыми рецепторами RGD-связывающего подсемейства в составе белков-лигандов.

PGRP (petidoglycan recognizing protein): белки, распознающие пептидогликан.

PR-39: пептид лейкоцитов свиньи, с высоким содержанием пролина и аргинина.

RAG½ (recombination activating gene): ген обеспечивающий рекомбинацию.

RPMI (Roswell Park Memorial Institute): культуральная среда, разработанная в указанном институте на онове бикарбонатной буферной системы и содержащая основные аминокислоты и витамины.

SDS (sodium dodecylsulfate): додецилсульфат натрия.

SRCRD (scavenger receptor with cysteine reach domain): scavenger-рецепторы, содержащие цистеин-богатый домен.

TCR (T-cell receptor): рецептор Т-лимфоцитов.

TGF/? (transforming growth factor): трансформирующий фактор роста TLR (Toll-like receptor): Толл-подобный рецептор TNFct (tumor necrosis factor): фактор некроза опухоли TSB (tryptic soy broth): триптический гидролизат сои.

VWA/l (von Willebrand A/Integrin domain): консервативный домен, входящий в состав фактора фон Виллебранда или интегринов VWA/1-подсемейсгва.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Л1. ОСОБЕННОСТИ ЗАЩИТНЫХ РЕАКЦИЙ ИГЛОКОЖИХ.

Л1−1. Общие замечания. Тип Echinodermata — один из наиболее обширных типов беспозвоночных (выделяется от 22 до 32 классов), первые представители которого описаны из Эдиакарской фауны (докембрий), наибольшего расцвета разнообразие иглокожих достигает в ордовике, после чего большая часть классов вымирает (см., например, Paul & Smith, 1984). Современные представители принадлежат шести классам: Crinoidea (морские лилии), Concentricycloidea (морские маргаритки), Asteroidea (морские звезды), Ophiuroidea (змеехвостки), Holothuroidea (морские огурцы) и Echinoidea (морские ежи). О возможных филогенетических отношениях между классами иглокожих высказывались самые различные мнения, ни одно из них не является общепринятым: выделение ключевых ароморфозов внутри группы весьма затруднительно, расстояние «по вертикали» от примитивных форм до продвинутых сравнительно мало, сами эти понятия в отношении группы в значительной степени условны (см. Hyman, 1955; Беклемишев, 1964; Smith, 1984; Smiley, 1988; Smith, 1988: Littlewood, 1995 и др).

У всех иглокожих имеется несколько полостей целомического происхождения: гемальная. перигемальная, амбулакральная, организованные в сосудистые системы, и висцеральный целом, занимающий большую часть полости тела. Жидкости, наполняющие указанные полости, населены подвижными клетками — целомоцитами. Считается, что состав форменных элементов сходен во всех полостях, хотя специальных исследований на эту тему не так много (см. Hyman, 1955; Lawrence, 1987 и др.). Предметом подробного изучения являлись клетки висцерального целома, причем подобного рода исследования проводились. главным образом, на представителях трех классов: голотурии, морские звезды и морские ежи. Одной из функций целомоцитов иглокожих является обеспечение защитных реакций.

Они несут ответственность как за распознавание, так и элиминацию или изоляцию инородных тел (живых или неживых), обеспечивают гемостатическую реакцию и вовлекаются в регенерационные процессы (см. Hyman, 1955; Matranga, 1996; Smith et al. 2006 и др.). Но исключительно защитная функция не приписывается ни одному типу форменных элементов целома. Целомоциты могут участвовать в переносе и запасании питательных веществ, экскреции, формировании межклеточного матрикса соединительной ткани, скелетных игл и пр. (Hymen, 1955; Hetzel, 1963; Doyle & McNiell, 1964 и др.).

Классификации клеток целомической жидкости, предлагаемые для различных классов иглокожих, варьируют от автора к автору (см. Kindred, 1924; Liebmann, 1950; Millot, 1950; Endean, 1958; Boolootian & Giese, 1958; Hetzel, 1963; Burton, 1966; Brown, 1967; Johnson. 1969; Fontain & Lambert, 1975; Kaneshiro & Karp, 1980; Eliseikina & Magarlamov. 2002; Xing et al. 2008 и др.). Наиболее часто выделяемыми типами целомоцитов являются: фагоциты (амебоциты), морулярные (сферулярные) клетки (бесцветные), виброциты (жгутиковые клетки) и лимфоциты. Помимо названных, также выделяются типы клеток, специфичные для отдельных классов — красные морулярные клетки морских ежей, кристальные клетки и гемоцигы голотурий и др. Ряд авторов указывают на то, что у морских звезд разнообразие целомоцитов выражено в меньшей степени, чем у прочих иглокожих. Единственным многократно описанным типом являются амебоциты, описания других клеточных типов единичны (Boolootian & Giese, 1958; Vanden Bossche & Jangoux, 1976; Kaneshiro & Karp, 1980; Smith, 1981; Коренбаум & Воробьев, 1988). Считается, что присутствие целомоцитов других типов в полости тела морских звезд нерегулярно, и вероятно, связано с активацией регенерационных процессов (в ответ на ранение, например) (Penn, 1979).

JI1−2. Фагоцитоз и фагоциты (амебоциты, лейкоциты) — самая многочисленная популяция целомоцитовназвание отражает их ключевую особенность — способность к амебоидному движению и фагоцитозу (Hymen, 1955; Boolootian & Giese, 1958; Johnson, 1969; Fontain & Lambert, 1975; Коренбаум & Воробьев, 1988 и др.). Амебоциты — активно подвижные клетки с непостоянной формой тела, активным округлым ядром, включающим 1.

2 ядрышка, и в разной степени развитым гранулярным аппаратом, в зависимости от чего могут условно подразделяться на агранулярные и гранулярные. Первые характеризуются сравнительно меньшими размерами и более высоким ядерно-плазменным отношением, цитоплазма содержит несколько вакуолей и гранул (по при этом выглядит практически гомогенной). Вторые — несколько крупнее, ядро может быть не совсем правильной формы, цитоплазма заполнена многочисленными гранулами (Brown, 1967; Коренбаум & Воробьев. 1988; Исаева & Коренбаум, 1989).

Для амебоцитов описаны два основных морфологических состояния: петалоидное (petaloid) и филиподиальное (filopodial) (Andrew, 1962; Hetzel, 1963; Johnson, 1969; Vethamany & Fung. 1971; Fontain & Lambert, 1975 и др.). Первые — вероятно, основное состояние амебоцитов в полостной жидкости. Они более или менее округлой формы, для них характерно наличие широких псевдоподий с ровным краем, которые включают крупную вакуоль, окруженную тонким слоем богатой микрофиламентами эктоплазмы (Fontain & Lambert, 1975; Jangoux & Vanden Bossche, 1975). Появление филоподиальных амебоцитов в условиях in vivo связано с повреждением тканей и нарушении целостности целомической полости (Edds, 1980). В ходе трансформации вакуоли петалоидных псевдоподий могут либо распадаться на более мелкие, либо открываться наружу, в эктоплазматическом слое формируются отростки, которые сильно вытягиваются, ветвятся и анастомозируют друг с другом и с аналогичными отростками других клеток (Johnson, 1969; Edds, 1977). Трансформация происходит достаточно быстро — занимает 4−10 минут — и является обратимой (Edds, 1977).

Трансформация целомоцитов из петалоидной стадии в филоподиальную сопровождается перестройкой актин-миозинового цитоскелета (Edds, 1977; Edds 1980). Данная трансформация регулируется изменением концентрации ионов Ca2t в цитозоле при участии кальмодулина (Ilenson & Schatten, 1983) и может быть инициирована искусственно помещением клеток в гипотонический раствор в присутствии внеклеточного Са2+ (Edds,.

1979; Otto et al., 1979) или же добавлением в раствор кальциевого ионофора (Henson & Schatten, 1983; Hyatt et al., 1984). Петалоидная стадия характеризуется диффузным распределением актиновых фибрилл в периферической цитоплазме. При переходе в филоподиальную стадию актиновые фибриллы организуются в пучки, направленные перпендикулярно поверхности клетки. Одним из ключевых белков, отвечающих за объединение фибрилл актина в пучки, является фасцин (58 кДа). На завершающем этане происходит втягивание плазматической мембраны вдоль упомянутых актиновых пучков и формирование филоподий (Otto etal., 1979; Edds, 1977; Edds, 1979; Edds, 1980).

Петалоидные и филоподиальные амебоциты характеризуются разными адгезионными свойствами. Филоподиальные амебоциты более склонны к активной агрегации, что при нарушении гомеостаза обеспечивает реакции гемостаза и изоляции патогенов путем формирования клеточного сгустка (Boolotian & Giese, 1958; Edds, 1977; Kanungo, 1984).

Внутри популяции петалоидных фагоцитов выделяют несколько субпопуляций, главным образом, в зависимости от особенностей организации актинового цитоскелета, и. следовательно, формы распластывания на субстрате, а также размера клетки: дискоидальные, полигональные (Edds, 1993) и малые фагоциты (Gross et al., 2000). Функциональные и цитологические особенности последних исследованы довольно малоизвестно, что оии характеризуются высоким ядерно-плазменным соотношением и меньшими размерами, чем клетки двух первых разновидностей (см. Smith et al., 2006).

Во взвешенном состоянии дискоидальные и полигональные фагоциты морфологически неразличимы, однако, легко разделяются в градиенте сахарозы. После оседания и распластывания на субстратеклетки двух субпопуляций становятся хорошо различимы: форма тела первых описывается более или менее правильной окружностью, вторыхломанной линией. И те, и другие способны трансформироваться в филоподиальную стадию при изменении внешних условий (Edds, 1977). Дискоидальные клетки всегда (во всех исследованных случаях) доминируют по численности, они образуют равномерный моиослой, в отличие от них, полигональные фагоциты склонны к объединению в небольшие агрегаты, легко диссоциируемые изменением осмотичности раствора (Edds, 1993).

Организация цитоскелета в клетках двух разновидностей различается: в дискоидальпых клетках актиновые фибриллы организованы в радиально расходящиеся от ядра «ребра" — в полигональных — пучки актиновых фибрилл идут, в основном, параллельно клеточной поверхности, лишь небольшая их часть идет радиально в направлении ядра, вокруг которого формируется «ограждение» (cage-likc structure) (рис. 6d-e). Различия в распределении актиновых фибрилл в цитоплазме представителей двух названных клеточных субпопуляций коррелируют с различиями в составе и концентрации актин-связывающих белков: в полигональных клетках их общее количество и разнообразие значительно выше (Edds, 1993).

Имеются некоторые различия между дискоидальиыми и полигональными фагоцитами в наборе выполняемых в организме функций. Клетки первой из названных субпопуляций вовлечены в инкапсуляцию (Clow et al., 2004), отторжение трансплантата (см. Edds, 1993). способны к фагоцитозу и хемотаксису (см. Gross et al., 2000). Полигональные клетки также проявляют фагоцитарную и хемотактическую активности (см. Gross et al., 2000; Clow et al. 2004), участвуют в реакциях инкапсуляции, коагуляции и отторжения трансплантата (см. Edds, 1993), кроме того, они способны к секреции лизоцима, что может служить антимикробной защите организма (Gerardi et al., 1990).

Амебоциты, нагруженные фагоцитированными частицами, уходят из целомической полости в ткани, а оттуда, вероятно, во внешнюю среду. Выход во внешнюю среду осуществляется через определенные участки тела, которые могут разниться у представителей разных классов иглокожих. У морских ежей и морских звезд такими участками являются дыхательные части покровов — кожные папулы (см. Bang & Lemma, 1962; Reinish & Bang, 1971) — и возможно амбулакральные ножки (см. Bang, Lemma, 1962). У голотурий миграция идет главным образом через стенки водных легких (выросты кишки) (Brown, 1967).

JI1−3. Инкапсуляция, гемостаз и морулярные клетки. Фагоцитоз, являясь основным механизмом поддержания стерильности внутренней среды у иглокожих, часто сопровождается реакцией инкапсуляции (Johnson, 1969; Dybas & Frankboner, 1986; Canieatti & Parrinello, 1985). Общими чертами инкапсуляции и фагоцитоза у иглокожих являются не только их временная и пространственная сопряженность, но и участие в этих процессах одних и тех же клеток — амебоцитов. Впрочем, следует заметить, что инкапсуляция — более сложный процесс, в который могут также вовлекаться морулярные клетки. В ходе гемостатической реакции задействуются те же клеточные типы, что и при инкапсуляции. Поведение амебоцитов и морулярных клеток в этих двух реакциях принципиально сходно.

JI1−3-1. Морулярные клетки (сферулярные клетки, трефоциты, элеоциты и др.) (Kindred. 1926; Liebmann, 1950; Endean, 1958 и др.). Это малоподвижные клетки, практически не образуют псевдоподий, но способные, впрочем, к медленному амебоидному движению. Основную часть цитоплазмы занимают крупные плотно упакованные одетые мембраной базофильные гранулы-сферулы (Helzel, 1965; Burton, 1966; Fontain & Lambert, 1975 и др.).

Морулярные клетки могут уходить в ткани: они выявляются не только в полостях целомического происхождения, но и в составе соединительнотканных пластов стенки кишки и стенки тела. Считается, что там данные клетки участвуют в формировании межклеточного вещества (Doyle & McNiell, 1964). Кроме того, есть описания, предполагающие, что в стенке тела эти клетки могут участвовать в отторжения трансплантата (Coffaro & Hinegarner. 1977). Собственно в целомической жидкости морулярные клетки задействованы в реакциях гемостаза и инкапсуляции, а их гранулы важны для инициации агрегации целомоцитов, что является начальным этапом и той, и другой реакции (Подгорная & Исаева, 1985).

Л1−3-2. Агрегация целомоцитов. Первые стадии свертывания целомической жидкости сходны для всех иглокожих. Они связаны с трансформацией амебоцитов из петалоиднои стадии в филоподиальную (Canicatti & Farina-Lipari, 1989). В целомической жидкости постоянно присутствуют амебоциты готовые к агрегации, что определяет наличие нестабильных клеточных агрегатов. Данные агрегаты при необходимости могут являться основой для быстрого формирования сгустка в ходе гемостатической реакции (Vethamany & Fung, 1971; Fontain & Lambert, 1975).

Активно агрегируют, в основном, амебоциты, а морулярные клетки (которых по количеству значительно меньше) чаще улавливаются в агрегаты пассивно. Первичные скопления клеток взаимодействуют друг с другом за счет филоподий, образующих сложную сеть, в результате их сближения формируется окончательный клеточный сгусток (Canicalti & Farina-Lipari. 1989). На морской звезде A. forbesi было показано, что для формирования первичного контакта целомоцитов друг с другом важно присутствие в среде некоторого Mg2± и Са:> ' -зависимого фактора (Kanungo, 1982). В случае морского ежа Paracentrotas lividus фактор, необходимый для инициации агрегации целомоцитов, был идентифицирован: им оказался вителлогенин (MW 200 кДа) (Cervello & Matranga, 1989). Эта молекула — предшественник топосома (loposome), который был первоначально описан как фактор адгезии бластомеров. ответственный за поддержание целостности эмбриона морского ежа (Noll el al., 1985; Matranga et al., 1986). Вителлогенин локализован в гранулах морулярных клеток и подвергается дегрануляции в ответ на стрессорное воздействие (Cervello et al., 1994). Из целомоцитов голотурии Holothuria polii был выделен молекулярный фактор, ответственный за агрегацию целомоцитов и, как предполагают авторы, вовлеченный в начальные стадии сворачивания целомической жидкости. Приблизительная масса этой молекулы составляет 220 кДа, но, есть ли структурная гомология с вителлогенином морского ежа, не известно (Canicatti & Rizzo, 1991).

У морских ежей (и только у них из всех иглокожих) имеется дополнительная финальная стадия: разрушение клеток, входящих в агрегат, и образование плотного фибриллярного сгустка (Подгорная & Исаева, 1985). В адгезии целомоцитов друг ко другу и формировании сгустка участвует OLF-домен-содержащий белок плазмы целомической жидкости, названный амассин (MW 75 кДа) (Hillier & Vacquier, 2003). Амассин может взаимодействовать с интегриновыми рецепторами на поверхности целомоцитов (Burke, unpublished: цит. по Nair et al., 2005) и образовывать перекрестные сшивки между молекулами за счет дисульфидных связей (Hillier & Vacquier, 2003).

JJ 1−4. Другие типы целомоцитов и их участие в защите организма.

Л]-4−1. Вибцоциты (жгутиковые клетки) (Cuenot, 1891: цит. по Hetzel, 1963). Довольно мелкие округлой формы клетки с развитым гранулярным аппаратом в цитоплазме: обладают одним (очень редко двумя) длинным классическим (9+2) жгутиком, с помощью которого свободно передвигаются в целомической полости (Hetzel, 1963; Burton, 1966; Johnson, 1969: Vethamany & Fung, 1971; Коренбаум & Воробьев, 1988 и др.).

Относительно функции жгутиковых клеток высказывались разные мнения, в том числе, и описание их в качестве паразитических протестов (Cuenot, 1891: цит. по Burton, 1966). Согласно наблюдениям П. Т. Джонсона (Johnson, 1969), жгутиковые клетки обеспечивают увеличение вязкости плазмы целомической жидкости. При соприкосновении е чужеродным материалом они освобождают мукоидные вещества, содержащиеся в гранулах, чем вносят вклад в локализацию инвазионного очага и облегчают инкапсуляцию.

Некоторыми авторами жгутиковые клетки рассматриваются, как недавние выходцы из целомического эпителия, который считается одним из возможных источников пополнения всех клеточных популяций целома (Liebmann, 1950; Коренбаум & Воробьев, 1988). Но по другим наблюдениям, виброциты — это единственные целомоциты, которые никогда не включают тимидин, что ставит по вопрос их функционирование как стволовых клеток или их ближайших потомков (Holland et al., 1965).

Л1−4-2. Лимфоциты (Jourdan, 1883: цит. по Hetzel, 1963) характеризуются округлой формой клетки, хотя и способны иногда образовывать филоподии (более короткие, нежели амебоциты), но, в целом, форма клетки значительно более постоянна, чем у амебоцитов (Hetzel, 1963). Иногда они не выделяются в отдельный тип, если рассматриваются как недоразвитые стадии амебоцитов (Johnson, 1969 и др.). Чаще же этим клеткам приписывается роль общего предшественника для всех клеточных типов. Лимфоциты, действительно, обладают некоторыми чертами, свидетельствующими о незавершенной специализации: сравнительно малые размеры и высокое ядерно-плазменное отношение. Ядро включает центрально расположенное крупное ядрышко, в цитоплазме присутствует множество рибосом, свободных и связанных с мембранами ЭПР, что указывает на протекание в клетке активных синтетических процессов (Fontain & Lambert, 1975).

JI1−5. Зона гемопоэза. Генетические отношения между различными классами целомоциговдо сих пор открытый для дискуссий вопрос. Не известными достоверно являются не только морфология стволовых клеток или же их ближайших потомков, но и расположение зоны гемопоэза. Исследование этого вопроса затрагивало не все классы иглокожих, результаты, к которым приходили в разное время исследователи на основании изучения различных объектов, противоречивы. Называются несколько возможных источников происхождения целомических элементов. Среди них общие для всех классов:

1) целомический эпителий (Geddes, 1880: цит. по Holland et al., 1965; Hausmann, 1931: цит. по Hetzel, 1965; Liebmann, 1950);

2) кровеносные сосуды (Cuenot, 1897: цит. по Hetzel, 1965);

3) осевой орган (Kollmann, 1908: цит. по Holland et al., 1965);

4) соединительнотканный слой стенки тела (см. Holland et al, 1965).

Как возможные области гемопоэза называются также органы, наличие которых не является типовым признаком иглокожих — ткани водных легких голотурий, например (Herouard, 1889: цит. по Hetzel, 1965) и/или целомический эпителий, их выстилающий (Endean. 1958). Наиболее общепринятое мнение относительно зоны гемопоэза у иглокожих называет в этом качестве осевой орган (Matranga, 1996), что, впрочем, не исключает возможность параллельного функционирования у всех или части видов других органов и тканей как зон пролиферации целомоцитов.

J11−6. Рецепторы, вовлеченные в распознавание патогенов. Описания рецепторов, находящихся на поверхности целомоцитов или в плазме целомической жидкости, которые могли бы обеспечивать распознавание, были сделаны на основании анализа генома морского ежа Strongylocentrotus purpuralus. Поиск в его геноме представителей известных групп распознающих молекул позволил идентифицировать несколько классов генов. Наиболее представленными из них являются три: scavenger-, Toll-like и NOD-like рецепторы.

771−6-1. Молекулы, относимые в группу scavengcr-рецепторов, были идентифицированы у представителей основных ветвей Metazoa: губок, нематод, насекомых, асцидий. позвоночных. Круг возможных лигандов и возможных функций в организме достаточно широк. Типичными лигандами для scavenger-рецепторов являются полианионные молекулы (обычно модифицированные липопротеины), которые могут присутствовать на поверхности как собственных клеток организма (состарившихся, поврежденных и т. п. в общем случае, предназначенных на уничтожение), так и различных микроорганизмов, в результате и т. е. и другие могут уничтожаться путем фагоцитоза (Lavina & Strand, 2002; Meistcr, 2004; Mukhopadhyay & Gordon, 2004). В геноме морского ежа выявлено присутствие пяти генов для предполагаемых CD-36-подобных рецепторов (эти рецепторы узнают эндогенные или микробные диацилглицериды (Hoebe et al., 2005)). Второе и более широко представленное семейство — SRCRD: цистеин-богатый повтор содержащие scavenger-рецепторы. Число их генов оценивается как 218, при общем числе различных SRCR-доменов 1095 (у позвоночных соотношение числа SRCRD и полных рецепторов составляет 81/16, у Ciona intestinalis (Ascidia) — 22/8). Эти гены активно экспрессируются в целомоцитах, причем паттерн экспрессии индивидуален и меняется у каждого индивидуума во времени. Функциональных доказательств участия рецепторов данного семейства в иммунном ответе морского ежа получено не было, но особенности их экспрессии разрешают такое участие предполагать (Рапсег, 2000; Hibino et al., 2006).

JI1−6-2. Гены второй группы кодируют белки, содержащие Nachtи LRR-домены и, следовательно, относящиеся к NLP-ссмейству. Кроме морского ежа, представители указанного семейства идентифицированы только у позвоночных. Функциональная нагрузка на эти рецепторы в организме позвоночных очень разнообразна, в иммунное реагирование вовлечены NOD и NALP — цитоплазматические белки, распознающие локализованные в цитозоле PAMPs (Inohara et al., 2005; Kufer et al., 2005). NOD1 и NOD2, в частности, связывают фрагменты пептидогликана через LRR (Girardin et al., 2003). Число генов NLP-семейства в геноме морского ежа составляет 208(у позвоночных — 20) (Iiibino et al., 2006; Rast et al., 2006). Основное место экспрессии — клетки кишечника, контактирующие с кишечными микроорганизмами (Messier & Rast, unpublished: цит. по Hibino et al., 2006).

JJ1−6-3. Третий обширный класс рецепторов, предположительно вовлеченных в иммунное распознавание — То11-подобные рецепторы (TLR). Представители TLR-семейства идентифицированы у представителей всех основных ветвей многоклеточных животных: Porifera (Demospongi) (Wiens et al., 2005), Ecdysozoa (Nematoda (Pujol et al., 2001), Arthropoda (см. Imler & Zheng 2004, Inamori et al., 2004; Yang et al., 2008 и др.)), Lophotrochozoa (Annelida (Davidson et al., 2008), Mollusca (Goodson et al., 2005; Qui et al., 2007), Deuterostomia (Ascidia (Azumi et al., 2003), Vertebrata (см Pasare & Medzhitov, 2005)). Эти рецепторы могу т распознавать как микробные, так и эндогенные лигапды, участвуя в иммунном реагировании в частности, через них может регулироваться экспрессия генов антимикробных пептидов) или выполняя иные функции. В геноме морского ежа идентифицировано 222 гипотетических гена, продукты которых могут быть отнесены к группе TLR. Из них 211 формируют кластер из структурно-близких генов, гомология внутри которого выше любых межгрупповых связей. Представители этой группы рецепторов имеют гак называемый ''Vertebrate-like" тип организации, то есть, присутствуют’только проксимально расположенные цистеин-богатые повторы (CRM: cystein-reach motif) во внеклеточном домене и уникальные вставки в LRR. вследствие чего могут обеспечивать распознавание широкого круга PAMPs. Гены этой группы активно экспрессируются в целомоцитах, что также указывает на возможность их участия в защитном ответе организма (Panccr, unpublished: цит. по Hibino et al., 2006). Оставшиеся 11 гипотетических рецепторов попадают в три несходные между собой группы. Три гена по структуре внеклеточного домена относятся группе «Vertebrate-like», отличаясь от генов предыдущей группы наличием интронов. Три другие гена из 11 относятся к группе «Protostome-like», т. е. не имеют дополнительных вставок внутри LRR и, исходя из структуры, должны распознавать эндогенные лиганды. Оставшиеся пять генов кодируют рецепторы с укороченным внеклеточным доменом — не описанные пока для других животных (Hibino et al., 2006; Rast et al., 2006). Гены двух последних групп экспрессируются в целомоцитах и амбулакральных ножках (Hibino & Rast, unpublished: цит. по Hibino et al., 2006).

Л1−6-4. Описаны также группы генов распознающих белков, характеризующиеся меньшим разнообразием. Пептидогликан распознающие белки (PGRP): известны для позвоночных и насекомыхсвязывают пептидогликан бактериальной клеточной стенки, в ряде случаев имеют амидазную активность и могут участвовать в разрушении пептидогликана (см. Dziarski. 2004). В геноме морского ежа имеется 5 генов для PGRPдва из пяти кодируемых ими белков предположительно имеют функциональный каталитический ценф (и. следовательно, могут функционировать не только как рецепторы, но и как эффекторные антибактериальные факторы, что показано для PGRP млекопитающих (Dziarski & Gupta.

2006)). Два представителя этого семейства были также идентифицированы в целомической жидкости морской звезды Asterias rubens. Оба представителя имеют функциональный каталитический домен, один из них (PGRP-Sla, MW 20 кДа) синтезируется и секретируется клетками целомического эпителия, второй (PGRP-S2a, MW 21.3 кДа) — целомоцитами. Было показано, что PGRP-S2a (но не PGRP-Sla) положительно влияет на фагоцитарную активность целомоцитов в отношении грам-положительных бактерий (предположи 1ельно, за счет опсонизации) (Coteur et al., 2007).

ЛI-6−5. Рецепторы, распознающие грам-отрицательные бактерии (GNBP//?GRP): описаны для насекомых (Kim et al., 2000) и асцидий (Azumi et al., 2003), но не позвоночных. Рецепторы связывают бактериальный ЛПС или /?1−3-гликан клеточной стенки низших грибов, могут присутствовать как на поверхности гемоцитов (целомоцитов), так и секретировагься в плазму полостной жидкости, участвуя в опсонизации, запуске фенолоксидазной системы, инкапсуляции и пр. (Ochiai & Ashida, 1988; Ma & Kanost, 2000; Lee & Soederhaell, 2002 и др.).' В геноме морского ежа (как и в геноме асцидии Ciona intestinalis) идентифицировано 3 гена данного семейства (Hibino et al., 2006; Rast et al., 2006).

JI1−6-6. Интегрины — молекулы клеточной адгезии, участвующие как в различных морфогенетических процессах, так и в реакции организма на патогенное вторжение (см. Van der Flier & Sonnenberg, 2001). В геноме морского ежа имеются гены для 8 «-субъединиц (RGD-связывающего подсемейства) и 4 /?-субъединиц (Whittaker et al., 2006), три из 4-х ß—субъединиц экспрессируются во взрослом состоянии в целомоцитах (Marsden & Burke, 1997). Участие интегринов этого подсемейства в защитных реакциях описано для различных беспозвоночных: например, у двукрылого насекомого Ceratitis capitata они опосредуют фагоцитоз (Foukas et al., 1998). У десятиногого ракообразного Pacifastacus leniuscidus RGD-узнающие интегрины обеспечивают адгезию и распластывание гемоцитов с последующей дегрануляцией, запускающей процесс меланизацип в ходе инкапсуляции (интегрииовый рецептор узнает RGD-сайт в составе секретируемого /?GRP) (Lee & Soederhaell, 2002).

Л1−6-7. Лсктины опосредуют в живых организмах широкий спектр функций, могут включать как единственный углевод-распознающий домен (обычно, небольшие секретируемые гликопротеины), так и входить в состав сложных мозаичных белковсекретируемых или трансмембранных. Иммунная функция лектинов реализуется при опсонизации, запуске системы комплемента, опосредовании клеточной адгезии в ходе инкапсуляции и пр. (см. Drickamer & Taylor, 1993). Гликопротеины лектинового семейства (главным образом, С-типа (Са2±зависимые)) были выявлены как постоянно присутствующие во внутренних жидкостях компоненты для многих видов морских ежей (Lylechimis variegatus, Echinarachnius parma, Anthocidaris crassispina, St. pwpuratiis и др.). голотурий (Hololhuria polii, H. leucopsilota, Slichopus californiens и др.), морских звезд (Paliria miniata, Asterina pectinifera и др.) (Brown et al., 1968; McCay et al., 1969; Ryoyama, 1974; Parrincllo et al., 1979; Hatakeyama et al., 1995; Luk’yanov et al., 2007; Matsubara et al., 2007).

В геноме морского ежа идентифицировано 104 предположительных гена, кодирующих небольшие представленные 1−2 углевод-распознающими доменами лектины С-типа (Hibino et al., 2006). По крайней мере, некоторые из них вовлечены в иммунное реагированиенапример, эхиноидин (лектин С-типа, описанный для нескольких морских ежей (Giga et al., 1987)) эксирессируется исключительно в ЛПС-активированных фагоцитах (Smith et al., 1996). Аналогичным образом в активированных целомоцитах увеличивается экспрессия генов нескольких галактоза-свящывающих лектинов (галектин-подобный лектин (Sp0014) и лектин С-типа (Sp064)). Их возможное участие в защите организма — предмет спекуляций: активация апоптоза (что известно для галектинов позвоночных (Kashio et al., 2003)). опосредование хемотаксиса (также по аналогии с позвоночными (Matsumoto et al., 1998)) и клеточной адгезии, распознавание и опсонизация микробных клеток.

Л1−6-8. Анализ библиотеки кДНК из активированных целомоцитов морского ежа позволил идентифицировать группу генов, продукты которых вовлечены в иммунный ответ, но не имеют известных гомологов в других группах животных — 183/333 (Rast et al., 2000; Nair et al., 2005). Экспрессия генов этого семейства чувствительна к воздействию ЛПС на целомоциты, инъекции клеток бактерий в полость тела и ранению, их продукты составляют 60% всей мРНК, синтезируемой в ответ на иммунную стимуляцию целомоцитов. В геноме имеется приблизительно 50−60 генов, с которых считывается большое число (около 750 идентифицированных форм) различных транскрипгов за счет альтернативного сплайсинга. В целомоцитах одного индивида может синтезироваться до 200 различных белков данною семейства (Dheilly, unpublished: цит. по Bowden et al., 2007), причем индивиды существенно различаются по набору экспрессируемых 183/333-белков (Terwilliger et al. 2006; Terwilliger et al., 2007). Известно, что данные белки присутствуют на поверхности определенного класса целомоцитов, и представленность этого класса в целомической жидкости увеличивайся при иммунной стимуляции (Brockton et al., 2007). Все имеющиеся данные указывают на участие 183/333-белков в защитном ответе, но конкретная функция до сих пор не выяснена. Помимо St. purpuratus гены данного семейства выявлены у нескольких других представителей класса Echinoidea (Roth, unpublished: цит. по Bowden et al., 2007).

Л1−6-9. Самым неожиданным и труднообъяснимым при анализе потенциальных «защитных» генов St. purpuratus было обнаружение в его геноме гомологов RAG ½ челюстных позвоночных, кодирующих ферменты, необходимые для реарранжировки Igи TCR-последователыюстей в ходе созревания лимфоцитов (см. Fugmann et al., 2000). Гены-гомологи морского ежа имеют сходную организацию, экспрсссируются на низком уровне в целомоцитах взрослых животных и личинок (Fugmann et al., 2006). Кроме того, имеется гомолог терминальной деоксинуклеотидил трансферразы, а также гомологи дру1 их факторов, вовлеченных в У (0).1-рекомбинацию в лимфоцитах позвоночных: хггс4, ДНК-лигаза IV, Ku70, Ku80 и др. (Hibino et al., 2006). Никаких функциональных или молекулярных доказательств функционирования УфУ-рскомбинации в организме морского ежа до еих пор получено не было, и относительно назначения этого комплекса ферментов не высказываются пока даже предположения.

JI1−7. Цитотоксические гуморальные молекулярные факторы.

Л1−7-1. Гемолизины. Гемолитическая активность плазмы целомической жидкости была выявлена у нескольких видов иглокожих (в частности, морской звезды A. forbesi (Leonard et al., 1990)), по только в одном случае были идентифицированы конкретные молекулы. Из Holothuria polii. были выделены два основных гемолитических фактора: Не1 (76 кДа) и Не2 (80 кДа) и два дополнительных — 27 и 31 кДа (Canicatti, 1990). Их активность является Са2±зависимой (Parinello et al., 1979), причем цитотоксический эффект достигается за счет повреждения мембран. Гемолизины взаимодействуют со сфингомиелином мембран эритроцитов (Canicatti, 1990), результат воздействия аналогичен таковому перфорина цитогоксичсских Т-лимфоцитов (Canicatti & Ciulla, 1988).

JI1−7-2. Комплемент-подобная система. Спекуляция относительно функционирования у иглокожих системы, подобной комплементу позвоночных, была высказана на основании наличия литической активности плазмы целомической жидкости морского ежа St. droebachiensis и морской звезды A. nibens в отношении IgM-меченных эритроцитов человека. Эта активность является Са2±зависимой и подавляется ингибиторами комплемента позвоночных (Bertheussen, 1983; Leonard et al., 1990).

Позже у морского ежа St. purpuratus были идентифицированы гомологи компонентов комплемента позвоночных: представитель СЗ/С4/С5-семейства (обычно обозначаемый как SpC3) и представитель С2/фактор В-семейства (обычно расцениваемый как фактор В и обозначаемый SpBf). На этом основании была высказана спекуляция относительно функционирования у иглокожих альтернативного пути активации комплемента (Al-Sharif et al., 1998).

Анализ генома морского ежа показал, что гомологов компонентов комплемента больше, чем предполагалось ранее. В геноме имеется не один, а 4 гена, продукты которых включают тиоэфирный сайт и принадлежат СЗ/С4/С5-семейству. Также описанный ранее фактор В (SpBf) является не единственным представителей С2/ВГ-семейства: имеются два других гомолога (SpBf-2 и SpBf-З). Идентифицирован ряд генов-гомологов «распознающих» компонентов комплемента, функционирующих, главным образом, в «лектиновом каскаде»: 5 представителей коллектинового семейства и 46 предположительных гомологов фиколинов. Интересным является то, что не удалось идентифицировать гены ни для одной из протеаз, инициирующей формирование СЗ/5-конвертазного комплекса (Hibino et al., 2006), а также ген рецептора для СЗЬ-компонента (VWA/I-подсемейство а-интегринов вообще не представлено в геноме морского ежа (Whittaker et al., 2006)). Гомологов компонентов терминальной части каскада (С6−9) также выявлено не было (Hibino et al., 2006).

Таким образом, спекуляция о функционировании альтернативного каскада комплемеша у морского ежа до сих пор не получила убедительного подтверждения: не идентифицирован фактор D, не показано наличие СЗ/С5-конвертазы (т.е. функционального комплекса C3-Bf). не описан рецептор на фагоцитах к СЗЬ (т.к. предполагаемая функция — опсонизация). Говорить о конкретном пути формирования предполагаемого СЗ/5-конвертазного комплекса, безусловно, пока рано. Однако показано, что уровень экспрессии гена SpC3 увеличивается в ответ на инъекцию ЛПС в полость тела как у взрослых животных, так и личиночных стадий (Al-Sharif et al., 1998), что предполагает участие продукта экспрессии этого гена в защитном ответе организма.

J11−7-3. Антимикробные факторы. Антимикробная активность была описана для широкого круга видов иглокожих (около 100 различных видов) (Rinehart et al., 1981; Bryan at al., 1994; Haug et al., 2002 и др.), но о молекулах, стоящих за указанной активностью, и их локализации в организме известно не так много. Одним из первых бактерицидных компонентов был идентифицирован эхинохром — нафтоквиноновый пигмент, содержащийся в гранулах красных морулярных клеток морских ежей (Service & Wardlow, 1984). Второй описанный антимикробный агент — лизоцим из целомоцитов морской звезды A. rubens с молекулярной массой 15.5±1 кДа (Jolles & Jolles, 1975; Bachali et al., 2004). Лизоцим был также выявлен в целомической жидкости нескольких других иглокожих: морских ежей St. intermedins (Shimizu et al., 1999) и Paracentrotus lividus (Gerardi et al., 1990), голотурии Holothuria poiii. (Canicatti & Roch, 1989; Canicatti, 1990).

После того, как антимикробным пептидам, не обладающим энзиматической активностью, была приписан статус ключевых компонентов антимикробной защиты многоклеточного организма (см. Boman, 2000, Zassloff, 2002 и др.), ожидаемым был поиск таких молекул у иглокожих. Однако до сих пор в литературе имеется сообщение только об одном антимикробном пептиде, идентифицированном в представителях иглокожих (не A. rubens). Из целомической жидкости голотурии Cucumaria frondosa был выделен пептид, характеризующийся конститутивной экспрессией, приблизительной массой 6 кДа и ингибирующей активностью в отношении грам-положительных иотрицательных бактерий. (Beauregard et al., 2001). Сообщения о более подробном изучении данного пептида (характеристика аминокислотной последовательности, например) не появлялись. Так же нет сообщений об обнаружении генов-гомологов АП, известных для других групп животных, в геноме морского ежа. Исследование, проведенное на трех видах иглокожих: A. rubens, Cucumaria frondosa и St. droebachiensis, выявило наличие в разной степени выраженной антимикробной активности в различных органах и тканях: покровах, гонадах, органах пищеварительной системы, целомоцитах, плазме целомической жидкости. Вся описанная активность не может быть объяснена присутствием лизоцима и эхииохрома, а ее чувствительность к обработке протеиназой К указывает на белковую природу агентов, за пей стоящих (Haug et al., 2002). Вероятно, что какие-то из них могли бы принадлежать группе антимикробных пептидов.

Л2. АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ и ИХ РОЛЬ В ЗАЩИТЕ ОРГАНИЗМА Л2−1. История вопроса. Систематические исследования молекул, обладающих антимикробной активностью, начались с описания явления антибиоза: патогенные бактерии, вызывающие дифтерию, тиф, холеру, туберкулез, дизентерию, проказу, бубонную чуму, пневмонию и другие заболевания, попав в почву, достаточно быстро из нее исчезают (в течение нескольких дней). В качестве одного из основных факторов, определяющих гибель патогенных микроорганизмов в почве, было предположено наличие собственной сапротрофной микробиоты. Это явление — подавление роста микроорганизмов одного вида со стороны другого — было названо антибиозом, или антагонизмом. В. Д. Фрост, изучавший природу микробного антагонизма, сделал следующее заключение: се. антагонизм приводит не только к прекращению роста патогенных микроорганизмов, но и к их уничтожению. Действие сапрофитов на патогенные бактерии проявляется не в результате нарушения питания, действия протеолитических ферментов или изменения реакции среды, а благодаря образованию специфических термостабильных по природе агентов, называемых антагонистическими веществами" (Frost, 1904). Антагонистические вещества позднее получили название антибиотиков (см. Ваксман, 1946). Очевидным был тот факт, что явление антибиоза не ограничивается взаимоотношениями микроорганизмов друг с другом, но имеет место по отношению к микробам со стороны клеток и тканей организмов многоклеточных (исследовались с этой точки зрения главным образом животные). Следовательно, в животных и растительных организмах должны присутствовать функциональные аналоги антагонистических веществ.

Как первое описание антибиотиков «многоклеточного происхождения» можно рассматривать наблюдения И. И. Мечникова за изменением свойств поверхности бактериальной клетки в ходе фагоцитоза: изначально эта поверхность базофильна, но после попадания в фагосому постепенно теряет отрицательный заряд (Мечников, 1903: цит. по Кокряков, 1999). Во второй половине 20-го века было подтверждено участие в уничтожении фагоцитированных микроорганизмов катионных антимикробных белков, попадающих в фагосому и способных взаимодействовать с отрицательно заряженной клеточной поверхностью микробов (Spiznagel & Chi, 1963). Низкомолекулярные (менее ЮкДа) пептидные компоненты с катионными свойствами, обладающие антимикробной активностью, были выделены из гранулярного аппарата нейтрофилов кролика (Spitznagel. 1984) и в дальнейшем названы дефенсинами (Ganz et al., 1985). Это были первые антимикробные пептиды, идентифицированные в позвоночных (к тому моменту уже были описаны цекропины и аттацины из чешуекрылого Hyalophora cecropia). Когда число описанных антимикробных пептидов превысило несколько сотен, эти молекулы стали рассматривать в качестве универсальных эффскторвов врожденного иммунитета, а не как частный аспект защитной системы отдельной моли или отдельных гранулоцитов кролика.

JI2−2. Определяющие свойства. Не смотря на огромное структурное многообразие антимикробных пептидов (АП), эти молекулы обладают несколькими общими свойствами, позволяющими говорить о них как о единой группе. Два из них указаны в названии обсуждаемой группы молекул: во-первых, ярко выраженная антимикробная активность (в первую очередь, противобактериальная), проявляющаяся в низких концентрациях (обычнонесколько мкг/мл). Во-вторых, низкая молекулярная масса (термин пептиды, в отличие от термина протеины, объединяет молекулы пептидной природы с молекулярной массой не более 12 кДа).

JI2−2-I. Катионностъ. Подавляюще большая часть множества известных на настоящий момент АП — катионные молекулы, т. е. имеют изоэлектрическую точку (pi) в щелочной области pH, при физиологических значениях pH в среднем они имеют заряд от +2 до +7 (Scott & Hancock, 2000). Описаны среди АП и более сильные катионы — например. АП из гемоцитов тарантула (Acanthoscurria gomesiana) — акантоскуррин — имеет заряд +8 (pi 10) (Lorenzini et al., 2003).

JI2−2-2. Гадрофобность: чаще всего доля гидрофобных аминокислот в составе АП составляет более 50% (см. Anderson & Zasloff, 1999; Hancock & Scott, 2000; Shai & Oren. 2001 и др.). Гидрофобные аминокислоты могут не объединяться в постоянный функциональный домен. Так, a-спиральные молекулы обычно не структурированы в водной среде, но приобретают характерную конформацию при вхождении в мембрану клетки-мишени (с оформленным гидрофобным доменом) (Tossi et al., 2000; Zasloff, 2002). То есть, в момент взаимодействия с липидной фазой конформация пептидной молекулы меняется таким образом, что ее заряженная и гидрофобная части оказываются пространственно сегрегированы (рис. 1а).

Л2−2-3. Амфипатичностъ: наличие разделенных гидрофобной и гидрофильной частей в молекуле разрешает АП конкурировать с липидами за вхождение в состав мембраны. Амфипатическая a-спираль характеризуется полярным углом (рис. lb) — чем меньше утл, тем выше доля гидрофобных аминокислот, и тем глубже пептид способен входить в гидрофобный слой мембраны (см. Scott & Hancock, 2000; Zasloff, 2002).

Л2−2-4. Как еще одно общее свойство АП, отличающее их от антибиотиков микробного происхождения, можно рассматривать их «присутствие» в геноме: подавляющее большинство АП считываются с индивидуальных генов (некоторые дефенсины могут быть результатом альтернативного сплайсинга одной пре-мРНК (см. Scott & Hancock, 2000)) и синтезируются рибосомами. Микробные антибиотики (в том числе и пептидные) являются вторичными метаболитами — они появляются в ходе метаболических циклов клетки (см. Ganz & Lehrer, 1999, Boman, 2000; Tossi et al., 2000). Важность АП в защите организма и наличие собственных генов открывает эти молекулы для селектирующего действия отбора, который постоянно «настраивает» весь имеющийся у организма репертуар АП на конкретную, взаимодействующую с ним микробиоту (см. Tennessen, 2005).

J12−3. Разнообразив и классификация АП. Сейчас доступна информация более чем о 1 ООО различных пептидах с антимикробной активностью (см., например, в базе данных http://www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/amsdb.html). Пока нет никаких оснований думать, что это множество не будет продолжать увеличиваться. Разнообразие аминокислотных последовательностей ЛП настолько велико, что построение классификации на их основе не имеет смысла, гак как это не упорядочивает и не упрощает ситуацию. Сравнительный анализ первичных структур позволяет в некоторых случаях сформировать группы родственных пептидов, обозначаемые как семейства (ec-, ?-, 0-дефеисины позвоночных, дефенсины насекомых, гистатины, цекропины, пролин-богатые пептиды и пр.). Но большая часть описанных пептидов не попадает в указанные семейства (т.е. не имеет «очевидных родственников») и, следовательно, не охватывается подобной классификацией.

Объединение АП в крупные группы возможно, исходя из их вторичной структуры. Впервые такая классификация была предложена в 1995 году (Boman, 1995), когда разнообразие АГ1 исчислялось пятью десятками последовательностей, но и с увеличением на порядок числа описанных АП она не потеряла своей актуальности. На основе одного предложенного принципа разные авторы, тем не менее, предлагают немного отличающиеся классификацииосновными выделяемыми молекулярными классами являются следующие.

JJ2−3-1. Линейные а-спиралъпые молекулы, не имеющие остатков цистеинамолекула включает один или два or-спиральных домена, соединенных в последнем случае шарнирным участком. Как уже было указано, такие молекулы могут менять конформацию на границе раздела гидрофильной и гидрофобной фаз (т.е. or-спиральная конформация формируется только в окружении липидов (или молекул их имитирующих)).

Л2−3-2. Молекулы, образующие f3-слоистую структуру. В состав таких молекул входит от четырех до восьми остатков цистеина, между которыми замыкается соответственно от двух до четырех дисульфидных мостиков, стабилизирующих /?-слоймогут содержать короткие а-спиральные участки. Молекулы этого класса характеризуются наиболее стабильной конформацией, которая не зависит от особенностей среды.

Л2−3-3. Молекулы, которые условно называются циклическими, так как они содержат два остатка цистеина, между которыми замыкается одна внутримолекулярная дисульфидная связь. В результате образуется структура петли (loop-structure) с одним или двумя свободными концами.

Л2−3-4. Молекулы, содержащие высокое число определенных аминокислот, например, пролина, аргинина, триптофана, гистидина или глицина. Чаще всего такие пептиды не формируют какой-либо определенной вторичной структуры и остаются развернутыми (extended) и в водной среде, и в гидрофобной фазе мембраны.

Кроме того, возможна также классификация АП, использующая в качестве определяющего иной признак — механизм появления зрелого пептида. Либо АП считываются с индивидуальной мРНК (подавляющее большинство описанных пептидов) в состоянии нефункционального предшественника, который подвергается при созревании протеолизу. Во втором случае пептид с антимикробной активностью появляется в результате протеолиза другого более крупного белка, который, хотя и может быть назван предшественником, обеспечивает свою специфическую функцию (например, производные гистонов). Таким образом, в обоих случаях зрелые пептиды появляются в результате протеолиза, но при этом существенно разнятся свойства молекул-предшественниц, что влечет за собой различия в компартментализации процесса созревания и механизмах его регуляции.

Распределение молекул по классам как в первой системе, так и во второй не является бесспорным. Так, в результате работы трех генов гистатинов может появляться большое число молекул с антимикробной активностью различной длины, из которых только две считываются с мРНК, остальные происходят друг от друга под действием протеаз (Oppenheim et al., 1988). По второй системе представители данного семейства должны были оказаться в разных классах. В первой системе часть представителей третьего класса могут1 рассматриваться в рамках второго, если замыкающаяся единственная дисульфидная связь поддерживает двунитевой /?-слой (Bulet et al., 1999; В ornan, 2000; Scott & Hancock, 2000; Zasloff, 2002), в результате родственные пептиды также могут попадать в разные классы.

Пептиды, синтезируемые в одном организме, могут являться представителями всех названных классов, при этом каждый клас может быть представлен далеко не одной разновидностью. Например, для крупного рогатого скота {Bos tanrus) известно 38 различных АП (Hancock & Diamond, 2000), для дрозофилы (D. melanogaster) — 34 (Hultmark, 2003). Объяснений подобному многообразию АП в пределах одного организма предлагается несколько. Во-первых, возможна тканеспецифичная экспрессия: разные части тела многоклеточного организма контактируют с несколько различным набором микроорганизмов, потому могут нуждаться в несколько отличающихся защитных молекулах. Так, в геноме человека присутствуют гены для нескольких дефенсиновых молекул: шести а-дефенсинов, четырех /?-дефенсинов (HBD) (Lehrer & Ganz, 2002), и одного 0-дефенсина (Cole et al., 2002). При этом ог-дефенсины 1−4 экспрессируются в незрелых пейтрофилах, а-дефенсины 5 и 6 — главным образом, в эпителии тонкого кишечника (см. Raj & Dentino, 2002) — HBD1 — эпителиями различных органов тела (петли Генли в почках, мочевого пузыря, женского репродуктивного тракта) — HBD2, в основном, экспреесируетея ипдуцибельно — в ответ на контакт с инфекционным началом — клетками различных эпителиев (дыхательного тракта, кожи, толстого кишечника) (см. Schroeder & Harder, 1999) — HBD3 — сердечной и скелетной мускулатурой, эпителиями плаценты и (после стимуляции 11−1/?) ротовой полостиэкспрессия HBD4 конститутивна, наиболее четко детектируется в тестикулярном эпителии (см. Lehrer, Ganz, 2002), мРНК (9-дефенсипа (он же ретроциклин) выявляется в тканях красного костного мозга, хотя белковый продукт в организме отсутствует из-за мутации в сигнальной части молекулы (Cole et al., 2002).

Во-вторых, молекулы АП имеют особенности в смысле широты круга чувствительных к их действию микробов. Например, известные АП дрозофилы, довольно сильно различаются по широте спектра активности: аттацины и диптерицны подавляют рост грамотрицательных бактерий, дефенсины более активны против грамположительных бактерий, а дрозомицпнпротив клеток низших грибов (см. Imler & Hoffmann, 2000 и Hultmark, 2003). Следовательно, компенсирование ограниченности спектра активности может рассматриваться как еще одно основание для их разнообразия в пределах одного организма.

Для многих АП было показано, что между различными АП или в паре АП с иной защитной молекулой возможно синэргическое действие на микробные клетки, т. е. значительное уменьшение минимальной ингибирующей концентрации при совместном действии. Оно. в частности, было продемострироано для двух АП поверхностной слизи лягушек — магейнина-2 и PGLa (Matsuzaki et al., 1998), человеческого кателицидина LL-37 из гранулярного аппарата нейтрофилов и лизоцима, и некоторых других пар. Возможность синэргизма также может оправдывать совместное присутствие нескольких антимикробных молекул в одном организме (см. Scott & Hancock, 2000).

В контексте данной работы подробная характеристика всех известных АГ1 или простое их перечисление не имеет особого смысла. Приводимое ниже описание некоторых групп All представляет собой скорее иллюстрацию к общему их многообразию. При этом более пристальное внимании направлено на АП беспозвоночных животных (несмотря на то, что большая часть известных АП была выделена из позвоночных). Среди различных беспозвоночных животных, как источники АГ1, изучались лишь немногие представители следующих типов: нематоды, кольчецы, моллюски (Cho et al., 1998; Матукова, 1999; Schroeder, 1999; Mitta et al., 2000; Tossi et al., 2000; Zhang & Kato, 2002; Iijima et al., 2003), хотя лидируют по числу идентифицированных и исследованных пептидов безусловно членистоногие, а среди них — насекомые (см. Bulet et al., 1999; Otvos, 2000; Iwanaga, 2002).

JI2−4. Цистеип-богатые пептиды.

Л2−4-1. Дефенсины насекомых и структурно связанные с ними пептиды. Это наиболее широко представленная у беспозвоночных группа АП. В ее состав входят не только дефенсины собственно насекомых (из которых они были выделены первыми (Matsuyama & Natori, 1988; Lambert et al., 1989)), но также дефенсины других беспозвоночныхпаукообразных (см. Bulet et al., 1999; Otvos, 2000), двустворчатых моллюсков (Charlet et al., 1996) и нематод (Kato & Komatsu, 1996; Kato et al., 2002). Вместе с дефенсипами позвоночных и дефенсинами растений дефенсины насекомых объединяются в сборную группу дефенсинов. Объединение производится по единственному признаку: присутствие в молекуле 3-х (иногда 4-х) пар цистеиновых остатков, замыкающих соответственно 3 (или 4) дисульфидные связи, стабилизирующих вторичную структуру (которая может варьировать, обязательно включая /^-слоистый участок).

В отличие от дефенсинов позвоночных дефенсины насекомых не проявляют активности против клеток низших грибов и вирусов, имеют некоторую токсичность в отношении грам-отрицательных бактерий, в основном же активны против грам-положительных бактерий. Все известные дефенсины именно насекомых характеризуются достаточно обычным для группы дефенсинов размером молекулы (38−43 аминокислоты) и наличием шести консервативно расположенных цистеинов, которые замыкают три дисульфидные связи постоянным для всех отрядов насекомых, но отличным от такового позвоночных способом: 1−4, 2−5, 3−6. Формирующаяся при этом надпервичная структура несколько отличается от таковой дефенсииов позвоночных: она представлена не тремя антипараллельными /?-тяжами, а неупорядоченным N-концом, а-спиралыо и двунитевым /?-слоем. Такая структура была называна цистеин-стабилизированный-а/7-мотив (Csafi) (Cornet et al., 1995). Csa/7-мотив описан и для других цистеин-богатых АП, которые обозначаются как дефенсин-подобные молекулы. Например, фунгицидный пептид дрозофилы — дрозомицин. Дрозомицин содержит 8 цистеиновых остатков (замыкающие 4 дисульфидные связи), и его вторичная структура довольно сильно отличается от таковой дефенсинов насекомых, однако в нее как составная часть входит Csec/2-мотив. Интересно, что гораздо больше сходства дрозомицин имеет не с дефенсинами насекомых, а дефенсинами растений (также активными, в основном, против клеток низших грибов). Последние, подобно дрозомицину, содержат 8 цистсинов, замыкающих в сходном порядке SS-мостики, вторичная структура также включает Cs (ф-мотив (см. Bulet et al., 1999; Raj & Dentino, 2001). Дефенсин-подобные АП, содержащие по 8 цистеииов и включающие Csa/7-мотив, были описаны не только для членистоногих, но и других беспозвоночных, в частности, двустворчатых моллюсков — MGD1. 2 (из представителей рода Mytilus) (Mitta et al., 1999b) и нематод — ASABF (из представителей рода Ascaris) (Kato & Komatsu, 1996) и Abfl, 2 (из Caenorhabditis elegans) (Kato et al., 2002).

J12−4-2. Другие цистеип богатые пептиды. В гранулах гемоцитов мечехвоста Tachypleus Irindentatus был идентифицирован так называемый большой дефепсин (big dclensin). проявляющий активность в отношении и грамположительных, и грамотрицательных бактерий, и клеток грибов. Этот пептид содержит 79 аминокислот и не похож на дефенсины насекомых или другие АП беспозвоночных. С-конец молекулы (последние 37 остатков) напоминают по последовательности «-дефенсины позвоночных, а аранжировка внутримолекулярных связей аналогична таковой их же^{-дефенсинов} (Kawabata et al., 1997).

Из гемоцитов мечехвостов же были выделены АГ1, названные тахиплезины и полифсмузины (из Т. №с1еп1Шш (Какатига е1 а1., 1988) или Цтгйиз ро1урЬетт (М1уа1а е1 а1., 1989)). Эти молекулы имеют 4 остатка цистеина, между которыми замыкается 2 дисульфидные связи с образованием шпильки из двух антипараллельных /?-тяжей. Заметное сходство в аминокислотной последовательности и вторичной структуре с названными пептидами мечехвостов наблюдается у двух других антимикробных молекул безпозвоночныхандроктонипа из гемолимфы скорпиона Апс (гос1опж аж^аИя (ЕЬге1:-8аЬа (лег е1 а1., 1996) и гомезина из гемоцитов тарантула Асап1юнсигг1а gomesiana (ЭПуа е1 а1., 2000). Удивительным является не их сходство между собой (названные АП выделены из представителей п/т Агас1то1<�Зеа), а их структурное сходство с протегрипом — АГ1 из лейкоцитов свипьп (Кокгуакоу е* а1., 1993; Кокряков, 1999; Ьогегшт & а1., 2003).

Цистеин-богагый пептид, не имеющий структурной гомологии с какими-либо известными защитными молекулами беспозвоночных — митимицин из гемоцитов МуМж ес/иНх. в его составе имеется 12 цистеинов, проявляет выраженную активность против клеток низших грибов (СЬаНй е1 а1., 1996). То же самое (отсутствие структурного родства) относится и к митицинам (из М. galloprovincialis) и митилинам (из М. ес1иП, ч и М. gallopruvincialis) (МШа е1 а1., 2000), а также пептиду из яда скорпиона РапсИпт ЬпрегШог — его молекула из 75 амк содержит 6 цистеинов (Сопс1е е! а1., 2000). Танацин, индуцибельный фунгицидный пептид травяного клопа РосИзт тасиЦуеп1г'1 $, содержит 21 амк, в числе которых 2 цистеина. замыкающих 1 дисульфидную связь с формированием структуры петли. Молекула пе имеет сходства с известными АП беспозвоночных, но заметно напоминает АП из поверхностной слизи лягушек (бревинины, раналексины, эскулентины) (РеЫЬаиш еЬ а1., 1996). Список пептидов без «структурных родственников» или с филогенетически трудно объяснимым сходством мог бы быть продолжен.

JI2−5. а-Спиральные молекулы.

Л2−5-1. Цекропгшы и родственные im пептиды. Цекропины — первые описанные АГ1 (Steiner et al., 1981) — включают 35−40 амквторичная структура представлена двумя «-спиральными доменами, соединенными шарнирным участком. N-концевой домен — более катионный, С-концевой — более гидрофобный и всегда амидирован. Цекропины описаны, главным образом, из представителей двух отрядов насекомых: двукрылых и бабочек (см. Otvos, 2000: Tossi et al., 2000). Довольно неожиданным было описание цекропин-подобного пептида у позвоночных (в тонкой кишке свиней) (Lee et al., 1989). В дальнейшем оказалось, что пептид принадлежит представителям рода Ascaris, паразитам из пищеварительной системы предполагавшихся продуцентов (Andersson et al., 2003).

Подобной цекропинам вторичной структурой обладают немногие цекропин-родственные пептиды. Так, сходство с цекропинами (в основном, по вторичной структуре) выявляется у АП асцидии Styela clava — стиелинов (Lee et al., 1997). Стиелины содержат 31−32 амк, сильно катионны и характеризуются высоким содержанием фенилаланина (Taylor et al., 2000).

J12−5-2. Другие а-спиральные пептиды. Как и в случае цисгеин-богатых АП, большая часть известных a-спиральных пептидов не имеет заметных гомологий с другими АГ1. Например, кроме упомянутых выше стиелинов, из гемоцитов асцидии S. clava были выделены пептиды, названные клаванинами (см. Tossi et al., 2000). Это гистидин-богатые, сильно гидрофобные молекулы, состоят из 23 амк, С-конец всегда амидирован. По широте спектра антимикробной активности, размеру молекулы и особенностям вторичной структуры (но не аминокислотной последовательности) напоминают магейнин — эпителиальный АГ1 лягушки Xenopus laevis (Zasloff, 1987). Чаще же никаких гомологий (или аналогий) не находится вообще. Сравнительно большой частью таких «непохожих» молекул являются компоненты ядов различных членистоногих, токсичных не только в отношении клеток микробов, но и клеток многоклеточных организмов: хадрурин (скорпиона Hadrurus aztectus), ликотоксин (паука Lycosa carolinensis), купиннин (паука Cupiennius salei), мелиттин (пчелы Apis mellifera) (см. Tossi et al., 2000, Lorcnzini et al., 2003 и др.).

Л2−6. Пептиды с высоким содержанием определенных аминокислот.

Л2−6-1. Пролин-богатые пептиды. Пролин-богатые пептиды выделены, в основном, из насекомых. Типичными представителями являются пиррокорицин (клопа Pyrrhocoris apterus (Cociancich et al., 1994)), формецин (муравья Myrmecia gulosa (Mackintosh et al., 1998)) и дрозоцин (D. melanogaster (Bulet et al., 1993), также идентифицированный в представителях двукрылых, перепончатокрылых, чешуекрылых и полужесткокрылых (см. Otvos. 2000)). Они содержат консервативный мотив P-R-P, повторенный в молекуле 2−3 раза (в формецине мотив видоизменен в P-N-P или Р-Н-Р, с чем, вероятно, связано снижение противобактериалыюй активности). В середине молекулы имеется консервативный треониновый остаток Тп, по которому нативные пептиды О-гликозилированыфункция сахара не известна. Проявляют активность только в отношении грам-отрицательных бактерий, в первую очередь, представителей семейства Enterobacleriacea. Интересным является сходство с представителями данной группы «N-концевой части диптерицииапептида гемоцитов двукрылых: данный фрагмент обогащен остатками иролина и гликозилирован по остатку треонина Тц. С-концевая часть диптерицина является цекропин-подобной, т. е. данный пептид представляет собой химеру и появился, вероятно, в результате слияния двух генов (Dimarcq et al., 1990).

Несколько пролин-богатых пептидов, отдаленно напоминающих дрозоцин, было выделено их различных представителей жалящих перепончатокрылых (в частности, медоносной пчелы Apis mellifera, почему они и были обозначены как апидацины): это 18−20 амк, на С-конце расположен консервативный домен PRPPHPRI/ L, N-конец достаточно изменчив и, видимо, с этим связано разнообразие в спектре активности. Отдаленно напоминают апидацины пептиды, выделенные из клопов Palomeria prasina и Р. maculiventris — мегалниковины, также короткие пептиды из 15−17 амк (Fehlbaum et al., 1996; Chernysh et al., 1996). Другие описанные Р-богатые АП: абецины из A. mellifera (Casteels et al., 1990), мечниковины из D. mekwogasier (Levashina et al., 1995), лебоцины из шелкопряда Bombix mori (Нага & Yamakawa, 1995) — ни по размеру (21−39 аминокислот), ни по первичной структуре молекулы не имеют сходства с апидацинами или группой дрозоцин-пиррокорицин-формицин, хотя похожи между собой (см. Bulet, 1999).

Известно, что присутствие пролина является фактором, нарушающим формирование а-спирали. Наличие нескольких остатков пролина в составе описанных пептидов является определяющим для ключевого свойства этих пептидов — их развернутой структуры и в гидрофольной и гидрофобной средах.

J12−6-2. Глицип-богатые АП. Среди молекул беспозвоночных с антимикробной активностью, включающих высокое количество глицина, большую часть составляют протеины (20−30 кДа) (Otvos, 2000). Для насекомых известно лишь несколько групп пептидов (6−8 кДа) -голотрицины (из жука Holotrichia) и тенецины (из жука Tenebrio), проявляющие (и первые, и вторые) фунгицидную активность (Lee et al., 1995; Jung et al., 1995). Глицин-богатый пептид акантоскурин, активный не только против грибов, но и против грам-отрицагельных бактерий, был выделен из гемоцитов мигаломорфного паука Acanthoscuria gomesiana. Сравнительный анализ последовательностей этих молекул указывает на отсутствие гомологи между ними (Lorenzini et al., 2003).

JJ2−7. Протеолитические фрагменты с антимикробной активностью. Разнообразие группы «иротеолитических фрагментов с антимикробной активностью» (ФАМ) безусловно уступает таковому «индивидуальных антимикробных пептидов», имеющих собственные гены. Образование в результате протеолиза функциональных и функционирующих белков ограничивает набор компартментов, в которых оно возможно — это внеклеточные компаргменты. Именно по специфике компартментов образования и функционирования проще всего систематизировать белки данной группы.

JJ2−7-1. Пищевые белки. В эту группу входят белки, которые попадают в организм с пищей и подвергаются действию пищеварительных ферментов, в частности эндоиепгидаз, что приводит к появлению относительно коротких фрагментов, часть из которых обладает антимикробной активностью. Поскольку такие пептиды появляются в полости пищеварительной трубки, они могут участвовать в регуляции состава обитающих в ней симбиотических микроорганизмов. Один из наиболее исследованных в этом отношении пищевых белков — лактоферрин. Первоначально лакгоферрин (MW 80 кДа) был выделен из молока млекопитающих животных (Sorensen & Sorensen, 1939), и позже идентифицирован в составе эпителиальных слизей, биологических жидкостях, а также гранулярном аппарате нейтрофилов (см. Кокряков, 1999). Нативный белок обладает антимикробной активностью (Masson, 1970). Под действием пепсина от N-концевой части лакюферрина могут отщепляться стабильные фрагменты, обладающие большей антимикробной активностью, чем исходный белок, и названные лактоферрицинами (рис. 2а) (Saito et al., 1991; Bellamy et al., 1992a, bKuwata et al., 1998). Наиболее изучены лактоферрицины человека и крупного рогатого скота (LfH и LfB, соответственно). Лактоферрицины включают 1−47 (Lffl) или 1741 (LIB) N-концевые аминокислоты, их вторичная структура представлена петлей с двумя свободными концами, которая поддерживается одной дисульфидной связью (рис. 21>с).

Разными авторами было показано, что в качестве источника для появления фрагментов с антимикробной активностью могут выступать и другие компоненты молока млекопитающих: а-казеин (его фрагменты названы казоцидинами (Zucht et al., 1995; Lopcz-Exposito et al., 2006)), овальбумин (Pellegrini et al., 2004), катепсин G (Bangalore et al., 1990). лизоцим (Ibrahim et al., 2005), а-лактальбумин (Pellegrini et al., 1999), /?-лактоглобулин.

Pellegrini et al., 2001), овотрансферрин (Ibrahim et al., 1998). Из пищеварительной системы клеща Boophilus microplus был выделен пептид с бактерицидной и фунгицид ной активностями, который оказался фрагментом бычьего гемоглобина (Fogaca et al., 1999). Сходным образом фрагменты гемоглобина и убиквитина позвоночных с антимикробной активностью были идентифицированы в пищеварительной системе паразитиформпых клещей Dernacentor variabilis (Sonenshine et al., 2005) и Ornithodorus moubata (Nakajima et al. 2003). И хотя для всех названных клещей известны дефенсины, они не выявляются в кишечнике и, считается, что защиту от кишечных микроорганизмов обеспечивают именно фрагменты пищевых белков (Sonenshine et al., 2005).

Л2−7-2. Эпителиальные белки. Исходными молекулами в данном случае являются собственные белки организма, присутствующие на слизистых оболочках (в том числе, слизистой кишечника) или входящие в состав покровных слизей. Эти белки могут активно секрегироваться клетками эпителия или освобождаться пассивно при разрушении этих клеток. Как и в предыдущем случае, белки-предшественники могут расщепляться с образованием ФАМ под действием пищеварительных ферментов: например, DB1 (diazepam-binding inhibitor) в кишечнике свиньи (Agerberth et al., 1993) или гистон Н2А под действием пепсина в желудке азиатской жабы (Bufo bufo, почему появляющиеся пептиды были обозначены как буфорины I и II) (Kim et al., 2000). Известно, что молекулы гистонов и без прогеолитического расщепления проявляют антимикробную активность, которая была описана еще в начале 20-го века (Petterson, 1905: цит. по Кокряков, 1999). Многие производные от гистонов ФАМ были выделены из эпителиальных слизей различных животных, главным образом, рыб: например, гистона Н2 В кошачьего сома Ictalurus punclalus (Robinette et al., 1998) или гистона H2A (гипнозин обыкновенного палтуса Hippuglossus hippoglossus (Birkemo et al., 2003) и паразин из амурского сома Parasilurus asolus (Park et al., 1998)). В последнем случае пептид появляется в поверхностной слизи только после нанесения раны. Были идентифицированы и протеазы, ответственные за появление паразина: катепсин G (присутствующий в зимогенной форме в слизи) и металопротсиназа-2, обеспечивающая его активацию в ответ на ранение (Cho et al., 2002). Изучение состава антимикробных пептидов покровной слизи радужной форели Oncorhynchus mykiss выявило производные гистонов Н2А (Fernandes et al., 2002), HI (Fernandes et al., 2004), негистонового хромосомного белка Нб (Fernandes et al., 2003), а также 40S рибосомального белка (Fernandes & Smith, 2002). Предполагается, что у карпа Cyprinus carpio в антимикробную защиту организма вовлечены производные липопротеина высокой плотности, который активно секретируется эпидермальными клетками (Concha et al., 2004). У млекопитающих ФАМ были индетифицированы в выделениях слизистых мочеполового тракта: фрагменты гемоглобина в менструальной крови (Мак et al., 2004) и семиногелина в семенной жидкости (Zhao et al., 2008).

Л2−7-3. Белки внутренних жидкостей. ФАМ, выделенных из внутренних жидкостей, известно меньше всего. Наиболее яркий пример — производные гемоцианина ракообразных и паукообразных. Первым из этих производных был описан астацидин, который представляет собой 16 С-концевых аминокислот гемоцианинабыл выделен из плазмы гемолимфы десятиногого рака Pacifastacus leniusculus. Вторичная структура астацидина представлена двунитсвым /?-слосм, который не поддерживается дисульфидными связями. По вторичной структуре астацидин сходен с танацином, упоминавшимся АП травяного клопа. За появление астацидина в гемолимфе отвечает цистеиновая протеаза, реализуемое ею расщепление гемоцианина усиливается в ответ на инъекцию ЛПС или /f-глюкана (Lee et al. 2003). Подобным образом ФАМ, представляющие С-концевые участки гемоцианина, были выявлены у двух видов креветок: Репаеш stylirostris и Р. vannamei (Destoumieux-Gar/on et al. 2001). С-концевая часть гемоцианина наиболее изменчива, поэтому между пептидами креветок и астацидином нет структурной гомологии. Механизм появления пептидов, вероятно, сходен, т.к. уровень продукции всех пептидов увеличивается в ответ на инъекцию ЛПС в полость тела. Интересно, что гемоцианин может служить исходной молекулой не только для производства АП, но и фенолоксидазы, обеспечивающей меланизацию в ходе фагоцитоза, инкапсуляции и гемостаза. Фенолоксидазная активность гемоцианина выявляется после расщепления нативной молекулы в N-концевой области. Эта активное ib показана для большого числа видов ракообразных и паукообразных (см. Decker & Jaenicke, 2004). Другим примером плазменного белка-предшественника для ФАМ является хромогранин, А млекопитающих, его производные могут выполнять в организме различные функции, и для некоторых из них была, в частности, описана антимикробная активность (Tota et al., 2007).

Таким образом, ФАМ — очень разнообразная группа, в ряде случаев их продукция организмом и функционирование как иммунных молекул является спорными и/или труднообъяснимыми (например, функционирование производных гистонов III А, Н1 В, HID и Н4, выделенных из активированных гранулоцитов человека (Wang et al., 2002)). Однако в нескольких случаях механизм продукции ФАМ тщательно изучен (буфорин, паразин, астацидин), и участие этих пептидов в защите организма не вызывает сомнений.

JI2−8. Механизм противобактериалыюго действия.

J12−8-L Общие замечания. При обсуждении предполагаемого механизма цитотоксического действия АП функцию следует учитывать, что гибель микроорганизмов должна служить защите организма-хозяина. Для этого необходимо, чтобы АП и их активность соответствовали следующим требованиям.

1). Токсическое действие АП должно быть избирательно направлено на микробные клетки и не затрагивать собственные клетки организма. Это требование выполнимо наиболее просто, если во взаимодействие между АП и клетками-мишенями вовлечены молекулы, специфичные для микробов, не встречающиеся на клетках многоклеточных организмов.

2). АП должны проявлять свою активность достаточно быстро, чтобы патогенное начало не успело размножиться и рассеяться по организму. Желательно, чтобы время действия АП не превышало времени одного клеточного цикла (при среднем времени клеточного цикла 50 минут в благоприятных условиях одна клетка может за сутки оставить 5×108 потомков (см. Hancock & Diamand, 2000)).

3). Желательно, чтобы каждый пептид был компетентен в отношении широкого круга микроорганизмов (т.е. обладать некоторой универсальностью действия на клетки-мишени), потому что потенциальное разнообразие микробов-интервентов a priori больше реально возможного разнообразия антимикробных молекул, которые могли бы синтезироваться в одном организме. Активность в отношении многих видов микробов возможна, если действие направлено на консервативные структуры клетки-мишени.

JT-2−8-2. Объект действия. Широта спектра токсической активности АП индивидуальна. Мишенями, чувтевительными к дейтвию АП, могут быть грам-положительные и грам-отрицательные бактерии и клетки низших грибов (три наиболее обычные группы мишеней), а также некоторые оболочечные вирусы, паразитические протесты, опухолевые клетки, эритроциты и другие клетки позвоночных (Ganz & Lehrer, 1999; Giacometti et al., 1999; Scott & Hancock, 2000; Zasloff, 2002). Есть пептиды, активные в отношении только одной названной группы (дефенсины насекомых, формецин и пр), другие компетентны в атаке на все названные мишени (а-дефенсины млекопитающих). Все эти разнообразные потенциальные объекты действия АП объединяет наличие мембраны. Действительно, АП в качестве амфипатических молекул способны конкурировать с липидами за нахождение в мембране, а обладание большим числом гидрофобных аминокислот, разрешает вхождение в гидрофобный слой мембраны (см. Hancock & Diamand, 2000; Scott & Hancock, 2000).

В высшей степени спорным остается вопрос о достаточности нарушения барьерных функций мембраны для наступления гибели клетки-мишени. Не зависимо от того, играет ли решающую роль деструкция и/или дисфункция мембраны или же связывание каких-то внутриклеточных детерминант, взаимодействие с мембраной является необходимой стадией воздействия на клетку. Учитывая слабую компартментализацию бактериальной клетки, можно заключить, что негативные последствия, связанные с внешним воздействием на мембрану (диссипация мембранного потенциала, в первую очередь), оказываются гораздо более разрушительным для клетки, чем в случае эукариот.

Для некоторых АП (например, цекропинов (Boman, 2000), протегринов (Drin & Temsamani. 2002), тахиплезинов и магейнинов (Anderson & Zasloff, 1999; Matsuzaki, 1999)) было показано, что проявление токсической активности в отношении клеток бактерий связано с неконтролируемым увеличением текучести или нарушением целостности клеточной мембраны. Это, впрочем, не дает оснований экстраполировать данный механизм достижения гибели клетки-мишени на все остальное множество известных АГ1 и их потенциальных мишеней. В ряде случаев было показано, что концентрация пептида, достаточная для увеличения проницаемости мембраны бактериальной клетки, может быть как выше, так и ниже МИК (см. Otvos, 2005). Это говорит о том, что мембранная дисфункция может быть как минимум не единственной причиной смерти клетки, и роль этой составляющей зависит как от особенностей действующего агента (пептида), так и природы объекта этого действия.

Л2−8-3. Селективность действия. В зависимости от способности взаимодействовать с теми или иными мишенями можно разделить все АП на две большие группы: (1) действующие только на прокариотические мишени либо (2) активные в отношении и про-, и эукариот. Факторы, влияющие на принадлежность конкретного пептида к первой или второй группе, будут обсуждаться ниже, здесь объектом рассмотрения являются структурные и функциональные различия, позволяющие части пептидов специфично атаковать клетки бактерий, игнорируя собственные клетки организма-продуцента.

Поскольку, воздействие на мишень необходимо включает взаимодействие с плазматической мембраной, то естественно предположить, что селективность в отношении прокариот определяется спецификой организации их поверхностных структур, клеточной мембраны, в частности. Плазматическая мембрана — достаточно консервативная структура, поэтому возможность воздействия на нее со стороны пептидов затрагивает широкий круг мишеней. Глубокие изменения ее строения извне или со стороны самой клетки могли бы привести к потере клеткой жизнеспособности. Вероятно, это является одним из факторов, ограничивающих появление устойчивых к действию АП линий бактерий (Zasloff, 2002).

Молекулы подавляющего большинства АП при физиологических значениях рН несут положительный заряд, поверхность бактериальных клеток, наоборот, электроотрицательна. Следовательно, между ними возможно электростатическое взаимодействие, которое и определяет специфику действия АП. Отрицательный заряд, привлекающий катиониые All к бактериальной поверхности, может быть связан с компонентами клеточной стенки (тейхоевые кислоты грам-положительных бактерий) или наружной мембраны грам-отрицательных бактерий (липид, А в составе ЛПС). Пептиды преодолевают наружные структуры путем замещения ионов Са2+ и Mg2+ (в силу большей катионпости), что вызывает их разрыхление (т.к. размер пептидов больше ионов металлов) и облегчает проникновение другим молекулам (см. Matsuzaki, 1999; Shai & Oren, 2001).

Плазматическая мембрана бактериальной клетки также притягивает АП, т.к. ее бислой (и наружный, и внутренний листки) содержит значительное количество отрицательно заряженных фосфолипидов: фосфатидилглицерола и кардиолипина. Мембраны клеток растений и животных также могут содержать отрицательно заряженные липиды, но только во внутреннем листке мембранного бислоя. Наружный листок таких клеток содержит исключительно нейтральные липиды, что делает их менее электроотрицательными (см. Matsuzaki, 1999; Hancock & Diamand, 2000; Huang, 2000; Shai & Oren, 2001; Zasloff, 2002).

Еще одна составляющая избирательности электростатического взаимодействия между АП и бактериальными клетками, но не клетками эукариот (многоклеточных эукариот, в первую очередь) — величина трансмембранного потенциала (у). У клеток млекопитающих v)/ в среднем варьирует от -90 до -110 mV, у бактерий в логарифмической фазе роста — от -130 до -150 mV. Причем отрицательно заряжена внутренняя поверхность мембраны, что способствует пенетрации мембраны пептидом (см. Yount & Yeaman, 2005).

О том, что начальное электростатическое притяжение имеет решающее значение для успешности взаимодействия с бактериальной клеткой, косвенно свидетельствует снижение бактерицидной активности АП при увеличении ионной силы раствора (см. Кокряков, 1999) и повышение ее при понижении рН (Hong et al., 2001). На это же указывают контрмеры, развиваемые некоторыми бактериями при контакте с тканями хозяина (например, при попадании в фагосому нейгрофила) — «адаптивные" — или же постоянно выраженные особенности строения клеток, определяющие их пониженную чувствительность к действию All — «врожденные». И те, и другие, различаясь в частных механизмах, принципиально сводятся к введению в состав поверхностных структур (клеточной стенки и мембраны) положительно заряженных группировок (см. Peschel, 2002; Yount & Yeaman, 2005).

Кроме того, свой вклад в селективность действия АГ1 на бактериальные мембраны вносит отсутствие в них холестерола. Холетерол в силу особенностей конфигурации своей молекулы уплотняет гиброфобный слой мембраны, затрудняя пенетрацию мембраны посторонними агентами. Бактериальная мембрана, лишенная холестерола, оказывается более открытой для встраивания в ее состав АП и для негативных последствий этого встраивания.

JI2−8-4. Воздействие па мембрану. Опыты с использованием мембран-активных пептидов, построенных целиком либо из Lлибо из D-аминокислот, показывают, что взаимодействие АП с молекулой-мишенью является не стереоспецифичным, наиболее вероятно, это не белок-белковое, а белок-липидное взаимодействие (Matsuzaki, 1999, Tossi et al., 2000). Действительно, для многих АП было показано взаимодействие с искусственными мембранами, представляющими собой лигшдный бислой, лишенный белковых компонентов (Matsuzaki, 1999; Zhang et al., 2001).

После преодоления надмембранных структур АП получают возможность сорбироваться на поверхности мембраны, связываясь, в первую очередь, с отрицательно заряженными головками фосфолипидов (см. Tossi et al., 2000). ЯМР-исследования положения пептидов в мембране подтверждают, что первоначально пептиды ориентированы параллельно поверхности мембраны (Zhang et al., 2001). Относительно дальнейшего поведения пептидов в мембране существует три основных модели.

Barrel-stave model (Ehrenstein et al., 1977). Эта модель объясняет токсическое действие АП на микробные клетки образованием в мембране постоянных каналов, стенки которых образованы несколькими агрегировавшими пептидами (рис. 4с). Чтобы кооперация пептидов была возможна, пептиды не должны быть сильными катионами (чтобы избежать отталкивания). В таком случае, во взаимодействии с мембраной определяющую роль играют гидрофобные связи (а не электростатические), что снижает специфичность в отношении бактериальных мембран (Shai & Oren, 2001; Dathe et al., 2002).

Требование низкой катионности, высокой гидрофобности и способности к агрегации ограничивает круг пептидов, к которым может быть приложена данная модель. Однако те пептиды, которые действуют в соответствии с ней (такие как пардаксин, аламетицин, мелиттин и др.), действительно, оказываются токсичными не только для клеток прокариот, но и для клеток многоклеточных организмов, например, эритроцитов (см. Tossi et al., 2000).

Toroidal pore model была предложена для описания действия некоторых «-спиральных пептидов (магейнин, PGLa). В данном случае увеличение проницаемости мембраны также достигается за счет формирования трансмембранных пор, но не при агрегации нескольких пептидов, а совместно липидами и пептидами. Такая тороидная пора — надмолекулярный комплекс, ее стенки образованы полярными частями АП и гидрофильными головками липидов (рис. 3, 4b) (Matsuzaki, 1999; Shai & Oren, 2001).

Первичное взаимодействие с головками липидов, как упоминалось выше, стабилизирует амфипатическую структуру а-спиральной молекулы АП. При этом ее гидрофильный домен оказывается связанным с гидрофильной частью бислоя, а гидрофобный — обращенным к окружающему водному раствору. Это последнее обстоятельство будет вынуждать молекулу АП развернуться и встроить свой гидрофобный домен в гидрофобный слой мембраны, что. в свою очередь, приведет к более глубокому погружению всей молекулы в мембрану. При углублении в мембрану пептид несколько «расталкивает» головки прилежащих к нему липидов, вызывая тем самым в наружном листке мембраны на определенной площади вокруг себя (которая зависит от размера гидрофобной части молекулы пептида и размера головки липида) дополнительное напряжение. Когда это напряжение достигает критической величины, наружный листок изгибается внутрь, увлекая за собой встроенные пептиды (рис.3). Тороидные поры — временные структуры, соединяющие наружный и внутренний листки мембраны для распределения избыточного напряжения, возникшего в наружном листке при сорбции на него пептидов (Matsuzaki, 1999).

Carpet model (Pouny et al., 1992). По этой модели АП не образуют в мембране клетки-мишени постоянных каналов или временных пор. Избыточное напряжение, возникающее во внешнем листке бислоя при взаимодействии его с пептидами, приводит к полному вытеснению липидных молекул амфипатическими молекулами АП на ограниченных участках мембраны (рис. 5). Конечным результатом взаимодействия является разрушение мембраны, подобное воздействию на нее детергента (см. Tossi et al., 2000; Shai & Oren, 2001; Zasloff, 2002).

Три изложенных механизма не являются взаимоисключающими. Первый и второй могут комбинироваться с третьим, а также с воздействием на цитоплазматические мишени в зависимости от пептид/липидного соотношения, концентрации солей и прочих условий.

Л2−8-5. Гибель клетки-мишени. После того, как клетка умерла, довольно сложно понять, почему конкретно это случилось, особенно, если причин гибели было несколько, и если тело клетки было разрушено в процессе гибели. Относительно комплекса причин, приводящих к гибели микробной клетки под действием АП, существуют две основные гипотезы. Согласно первой из них, потеря жизнеспособности клеткой-мишеиыо происходит из-за нарушения характерного состояния ее мембраны: изменения текучести липидной части мембраны, нарушения стабильности белковых комплексов в нее встроенных, остановки дыхания, диссипации мембранного потенциала и нарушения общего энергетического баланса клетки, нарушения барьерных функций мембраны, неконтролируемое поступление воды в клетку и утечки жизненно важных метаболитов (см. Matsuzaki el. al., 1996; Westerhoff et al., 1989; Yang et al., 2001; Shai & Oren, 2001). Достигается названный набор эффектов по одному из трех перечисленных механизмов или комбинаций. Однако есть основания предполагать, что. но крайней мере, для некоторых пептидов оказываемое воздействие на мембрану не является достаточным для убийства клетки-мишени. Так, для нескольких пептидов с выраженной мембран-атакующей активностью было показано, что увеличение проницаемости мембраны per se не может привести к гибели клеток Staphylococcus aureus (К.00 et al., 2001). Аналогичным образом МИК против Escherichia coli может быть как выше, так и ниже концентрации, в которой пептид (показано на нескольких пептидах) способен вызвать деполяризацию мембраны клетки-мишени (Wu et al., 1999).

Л2−8-6. Воздействие на цито rui аз. л гатич ее кие мишени. Вторая гипотеза предполагает как основную причину смерти клетки-мишени не собственно воздействие не мембрану, а проникновение АП (с образованием пор или без него) в цитоплазму и связывание ими внутриклеточных структур. Распределение избыточного напряжения между листками мембраны осуществляется за счет включения части липидов и пептидов, с ними связанных, в состав внутреннего листка. С внутреннего листка пептиды могут диффундировать в цитоплазму и связывать какие-то внутриклеточные компоненты (рис. 5) (Matsuzaki, 1999: Shai & Oren, 2001; Zasloff, 2002). Какие именно это компоненты и насколько они разнообразны — вопрос пока окончательно не решенный. Как наиболее привлекательные для катионных АП мишени могут рассматриваться полианионные молекулы нуклеиновых кислот (не компартментализованные в прокариотической клетке) — следствием их связывания является остановка процесса биосинтеза белка (Lehrer et al., 1989; Park et al., 1998).

Для дефенсинов было показано, что образование трансмембраиных пор не является достаточным для летального воздействия на клетку-мишепь. Смерть не наступает до тех пор. пока молекулы АП не проникнут в цитоплазму (Lichtenstein, 1991). Кроме того, существуют пептиды, для которых показано отсутствие мембран-атакующей активности: они способны проницать мембрану и диссоциировать от внутреннего листка в цитоплазму, не вызывая существенных нарушений в функционировании мембраны. Пролин-богатые пептиды — наиболее яркий пример молекул, реализующих такой механизм действия.

Для апидацинов, а потом и для формецина, а также и диптерицина было показано, что они активны в основном против растущих культур. Это указывает на метаболические процессы как мишень действия данных пептидов. Более того, в МИК апидацины не влияют на проницаемость мембраны, апидацин-усгойчивые линии чувствительны к действию порообразующих пептидов, а D-энантиомеры не имеют антимикробной активности — все эти факты подразумевают, что нарушение функциональной и структурной целое гности мембраны не имеет значения для реализации ингибирующей активности (см Otvos et al. 2000). Наконец для пиррокорицина и дрозоципа был определен точный механизм действия: оба они препятствуют созреванию белка на стадии фолдинга, путем связывания бактериального шаперона DnaK (Otvos et al., 2000). Обе молекулы могут быть разделены на две функциональные части: N-концевая обеспечивает связывание DnaK, а С-концевая — * прохождение через мембрану. Причем в С-части возможны аминокислотные замены без потери антибактериальной активности, а в N-части — нет, т.к. она участвует в специфическом белок-белковом взаимодействии (см. Otvos, 2002).

Буфорин-II вызывает смерть клеток Е. coli без разрушения плазматической мембраны. Причем, его минимальная действующая концентрация оказывается на порядок ниже, если пептиды вводятся в клетку искусственно, путем электропорации. То же самое было показано и для порообразующего пептида магейнина. Мутантные линии бактерий, способные к синтезу необычных белков теплового шока, оказываются более устойчивыми к воздействию обоих пептидов, что указывает на важность цитоплазматических взаимодействий АН в многоступенчатом процессе убийства клетки-мишени (Liang & Kim, 1999).

Таким образом, до сих пор не существует единого мнения о том, какое именно воздействие приводит к гибели микробной клетки. Ясно, что воздействие АП на микробную кле1ку вызывает целый спектр негативных последствий, которое из них окажется решающим, определяется свойствами каждого конкретного пептида, вида микроба и условиями протекания реакции.

JI-2−8-7. Соотношение структуры пептида и механизма действия. Этот вопрос, безусловно, далек от состояния полной изученности, и предметом обсуждения в данном случае могут являться лишь некоторые тенденции, показанные на отдельных пептидах. Одна из основных выявляемых тенденций — положительная корреляция между способностью агрессивно воздействовать на мембрану (то есть, менять ее структурные и функциональные парамефы) и низкой селективностью (то есть, способностью взаимодействовать не только с клетками бактерий, но и с клетками эукариот, в первую очередь, клетками млекопитающих). Селективность действия зависит от многих характеристик, главными из которых являются: заряд, общая гидрофобность, общая структурированность молекулы (обычно речь идег об упорядоченности а-спирали) и уровень амфипатичности (Dathe & Wieprecht, 1999; Giangaspero et al., 2001; Zhu et al., 2007).

Виток классической а-спирали включает 3.6 аминокислотных остатка — такая периодичность оптимальна для взаимодействия с биомембранами, если спираль является амфипатичной (см.

Yount, Yeaman, 2005). Причем, чем больше выражена амфипатическая а-спираль и гидрофобный домен в ней, тем более выраженной оказывается мембран-атакующая активность и способность взаимодействовать с электронейтральными мембранами эукариотических клеток (Dathe & Wieprecht, 1999). Одним из характеризующих обилие гидрофобных аминокислот в а-спиральном пептиде параметров является полярный угол. Для разных пептидов было показано: чем меньше полярный угол, тем более выраженной оказывается способность АП формировать поры в мембранах, а также стабильность этих пор (Dathe et al., 1997; Wieprecht et al" 1997; Uematsu & Matsuzaki, 2000).

Опыты с природными и синтетическими пептидами выявляют положительную корреляцию относительной величины гидрофобного домена со способностью перфорировать бислой. не имеющий отрицательно заряженных липидов в наружном листке (например, мембраны эритроцитов), и отрицательную корреляцию с общей селективностью действия (Helmerhorst et al., 1999; Dathe et al., 2002). Для аналогов магейнина показано: при фиксированных заряде, уровне а-спиральности, варьирование гидрофобности не влияет на взаимодействие с мембранами, построенными из анионных липидов (имитация мембраны бактериальной клетки), но при этом увеличение гидрофобности увеличивает аффинность и мембран-атакующую активность в отношении электронейтральиых мембран (имитация мембраны клеток млекопитающих) (Wieprecht et al., 1997). Аналогичным образом увеличение плотности гидрофобных остатков (при сохранении их числа) увеличивает способность перфорировать мембрану (Tachi et al., 2002).

Кроме того, важным параметром является способность к агрегации (self-association) в водной среде (Chen et al., 2007). На примере нескольких пептидов было показано, что последняя зависит от структурированности а-спирали и положительно коррелирует с гемолитической активностью. Так, с использованием мелитгина (который является сильным гемо лиги ком, действующим по barrel-stave-Mexaim3My (Ladokhin & White, 2001)) было показано, что введение в молекулу пептида агентов, разрушающих а-спираль (пролина, например), снижает способность к агрегации и гемолитическую активность (при этом также утрачивается способность вызывать структурные изменения в мембране), но никак не затрагивает противобактериальную активность (Zhu et al., 2007).

Вообще, присутствие пролина в молекуле пептида является чрезвычайно важным. Когда речь идет об «-спиральных пептидах, наличие в молекуле остатков пролина приводит к снижению мембран-атакующей активности: чем больше остатков пролина. тем меньше способность менять проницаемость мембраны (Zhang et al., 1999). То есть, введение пролина в состав молекулы изменяет механизм действия АП в сторону атаки на цитоплазматические мишени. Присутствие пролина способствует диссоциации пептида с внутренней стороны мембраны в цитоплазму. Показано на буфорине-П: нативный пептид не разрушает мембрану, а действует на цитоплазматические мишени. Замена пролина в середине молекулы на аланин меняет механизм действия на мембран-атакующий, причем пептид остается связанным с мембраной (как это делает магейнин, в молекуле которого нет пролина) (Park et al. 2000).

Влияние кагионности на механизм действия прямо противоположно таковому гидрофобности: увеличение катионности позитивно сказывается на селективности и противобактериалыюй активности. На аналогах магейнина (Dathe et al., 2001), и других а-спиральных пептидах (Giangospero et al., 2001), в которых спиральность и гидрофобность оставались на одном уровне, а варьировала только катионность — от +3 до +6, было показано, что ее увеличение ведет к увеличению антимикробной активности в отношении клеток бактерий (в определенных пределах, за которыми может теряться антимикробная активное! ь и увеличиваться токсичность в отношении эукариот — у магейнинов после +6,+7).

МАТЕРИАЛЫ и МЕТОДЫ.

М1. ИДЕНТИФИКАЦИЯ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ.

М1−1. Животные. Сбор материала проводили в августе 2001;2003 годов. Морские звезды Asterias rubens (тип Echinodermata, кл. Asteroidea, отр. Forcipulata, сем. Asteriidae) были собраны в окрестностях МБС СПбГУ (губа Лебяжья, губа Подпахта). До момента использования животных содержали в садках на глубине 0.5−1.5 м, после использования выпускали в районе сбора.

М1−2. Экстракты. Целомическую жидкость (ЦЖ) забирали путем удаления кончика луча: сцеживали в сосуды, содержащие ЭДТА (с конечной концентрацией 30 мМ, рН 7.4 (рН подводили с помощью 1 М NaOH) — для предотвращения коагуляции). Непосредственно после сцеживания ЦЖ центрифугировали (400 g, 10 мин), после чего удаляли надосадочную жидкость, к осажденным целомоцитам добавляли 10% уксусную кислоту для экстракции. Время экстракции — 2−3 недели при температуре 4 °C. По истечении времени экстракции клетки удаляли из экстракта путем центрифугирования (2000 g. 40 мин). Полученный таким образом экстракт рассматривался как нулевой экстракт (т.е. полученный без разрушения целомоцитов) — Эо. Надосадочную жидкость, полученную при центрифугировании нативной ЦЖ (плазма ЦЖ), подкисляли так же, как клетки: добавляли уксусную кислоту в конечной концентрации 10%. Пробы плазмы получали только в 2001 и 2002 гг.

Целомоциты, полученные в 2001 году, после удаления Эо были подвергнуты гомогенизации (тефлоновым пестиком в стеклянном гомогенизаторе) и последующей дополнительной процедуре экстракции, в результате которой были получены еще два экстракта (3i и Э?). Эг. гомогенат помещали в 20% уксусную кислоту, экстракцию проводили в течение 7 дней при температуре 4 °C, при постоянном перемешивании. Экстракт отделяли от частиц гомогената центрифугированием (2000 g, дважды по 40 мин.). Э2: освобожденный от Э, клеточный гомогенат ресуспендировали подкисленным раствором метанола (90% метанол, 10% уксусная кислота). Экстракция и удаление гомогената проводили в тех же условиях, что и для Э|.

М1−3. Диализ. Для тестирования на наличие антимикробной активности плазму ЦЖ диализовали. Для диализа была использована мембрана с номинально отсекаемым размером молекул — 1 кДа (Spectra/pore membrane, Spectrum Laboratories). Диализ проводили при 4 °C против 5% уксусной кислоты при соотношении объемов пробы и буфера 10 мл: 2000 мл в течение 12 часов при постоянном перемешивании.

М1−4. Ультрафильтрация. Перед процедурой ультрафильтрации экстракты разбавляли дистиллированной водой для приведения концентрации уксусной кислоты к 5%. Экстракт фракционировали путем последовательной ультрафильтрации (камера для ультрафильтрации: объем 50 мл, Beckman) под давлением 4 Атм через фильтры с фиксированным диаметром пор (номинально отсекаемый размер молекул 10 кДа или 1 кДа: «Amicon» YM-10 и YM-1, соответственно).

М1−5. Препаративный электрофорез (ПЭФ). Часть Эо, содержащая молекулы массой от 1 до 10 кДа, подвергали препаративному электрофорезу в полиакриламидном геле (Г1ААГ) в кислой буферной системе (рП 2.4) в присутствии мочевины, напряжение 35 В/см при у площади поперечного сечения трубки 10 см и длине 12 см, скорость элюции 24 мл/ч (элюционный буфер 5% уксусная кислота) (Harwig et al., 1993). Состав геля:

Акриламид (Fisher).2.5%.

Ы, Ы-Метилен-бис-акриламид (Fisher).0.325%.

N, N, N, N-TeTpaMeiwi3TmicHflHaMHH (Sigma) 0.025%.

Персульфат аммония (ПСАFisher).0.025%.

Уксусная кислота (Вектон).5.64%.

Мочевина (Sigma).31.7%.

Для ПЭФ была использована установка BioRad (модель AG501-X8). Для удаления ПСА перед нанесением пробы проводили преэлектрофорез в течении 8−12 часов при напряжении 20 В/см. Перед нанесением на электрофорез объем ультрафильтрата уменьшали на вакуумном концентраторе SpeedVac до 1 мл, пробу утяжеляли раствором ЗМ мочевины.

Ml-6. Обратнофазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ).

Для ОФ ВЭЖХ использовали: хроматограф Beckman Gold HPLC System, детектор — Beckman 166A, коллектор Beckman SC, колонки C18 (Altech) и C18 (Vydac). Хроматографию проводили в градиенте ацетонитрила (Вектон) (подкисленного 0.1% трифторуксусной кислотой (Sigma)).

М1−7. Аналитические электрофорезы.

М1−7-1. Электрофорез в кислой буферной системе в присутствии мочевины (Panyim & Chalkley, 1969) проводили на приборе фирмы Hoehfer Р.В. Inc., в ПААГ: 12.5%, толщина 1 мм, длина 10 см, ток 180 вольт (20 вольт на 1 см пластины)).' Состав геля:

Акриламид.12,5%.

1[, 1[-Метилен-бис-акриламид.0.35%.

НМДчЦЯ-Тетраметилэтилепдиамин.0.025%.

Персульфат аммония.0.025%.

Уксусная кислота.5%.

Мочевина.37.55%.

В качестве буферов (катодного и анодного) использовали 5% уксусную кислоту (pH 2.4). Пробы утяжеляли раствором ЗМ мочевиныдля визуального контроля за продвижением белков в геле пробу подкрашивали раствором метиленового зеленого.

М1−7-2. Электрофорез в щелочной буферной системе в присутствии додецилсульфата натрия (SPS) (Schaegger & Von Jagow, 1987) проводился на приборе фирмы Hoehfer P.B. Inc. Гель (толщина 1 мм) представлен двумя частями: 3% ПАА концентрирующий гель верхний, 10 мм- 16% ПАА разделяющий гель — нижний, 70 мм. Для приготовления концентрирующего и разделяющего гелей использовался 0.3% раствор SDS (Fisher) в 3 М трис-HCl буфере, pH 8.45. Состав концентрирующего геля:

Акрил амид.3%.

НМ-Метилен-бис-акриламид.0.1%.

SDS.0.1%.

М, 1 М,]М, М-Тетраметилэтилендиамин.0.25%.

Персульфат аммония.0.035%.

Состав разделяющего геля:

Акриламид.16%.

М, М-Метилен-бис-акриламид.0.53%.

SDS.0.1%.

N, N, N, NТетрам ети л эти лен диамин.0.025%.

Персульфат аммония.0.025%.

Глицерин (Fisher).12.8%.

Для нанесения на электрофорез пробы лиофилизировали, перерастворяли в растворе для проб (2% SDS / 5% /?-меркаптоэтанол / 5% глицерин / 0.075М Трис-HCl (pH 8.83)) и кипятили в течение 2−3 минут для денатурации белков. Катодный буфер: 0.1%) SDS / 0.24М трицин / 0.025М Трис-HCl (pH 8.25). Анодный буфер: 0.2М Трис-HCl буфер (pH 8.9). Ток: 35 мА на пластину. Для определения молекулярной массы белков пробы использовали метод Вебера и Осборн (Weber & Osborn, 1969), в качестве стандартов использовали весовые маркеры для низкомолекулярных белков (Low molecular weight markers, Sigma). Гели окрашивали раствором Кумасси G (1г сухого красителя на 1000 мл водного раствора этанола (метанола) (25.6%) / формальдегида (14.4%)).

Ml-8. Масс-спектрометрия. Молекулярную массу пептидов в пробах определяли с использованием время-пролетного масс-спектрометра (MALDI-TOF: matrix assisted laser desorption/ionization — time of flight, прибор Voyager-DE, Perseptive Biosystem Inc. (Framingham AM)) при любезной помощи ст.н.с., к.б.н. О. В. Шамовой на базе ООО ЦКП «Аналитическая спектрометрия» фонда ТБН. Ионизация тестируемых молекул осуществляли посредством лазерной десорбции с матрицы (а-циано-4-гидрокси-циннамовая кислота (Sigma)) с источником ионов замедленной экстракции в линейном режиме. Ошибка при измерении массы составляет ±20 Да.

М1−9. Антимикробный тест. Изучение антимикробной активности проводили в соответствии с методом, предложенным проф. Р. Лерером (Lehrer et al., 1991). Для проведения теста готовили ночную культуру бактерий (культивирование в 3% триптическом гидролизате сои (TSB (Sigma)) при 37 °C в течение 16−18 часов), которую использовали для получения культуры в логарифмической фазе роста (отбирали аликвоты из ночной культуры и пересеивали в свежую среду для культивирования в течение еще 2.5 часов при тех же условиях). Клетки бактерий из «логарифмических» культур осаждали из питательной среды центрифугированием (4°С, 500 g, 10 мин) и ресуспендировали в 10 мМ натрий-фосфатном буфере (НФБ), pH 7.4. Для культивирования низшего гриба Candida albicans использовали 3% SBA, тестирование проводили против клеток ночной культуры.

Концентрацию клеток (colony forming units, CFU) оценивали по оптической плотности (OD) клеточной суспензии на спектрофотометре СФ-64 (А,=620 нм для бактерий. ^=450 нм для С. albicans). Исходя из количества CFU, клеточную суспензию в определенной пропорции смешивали с 1% агарозой (Type I agarose, Sigma) (43°С) в 10 мМ НФБ (pH 7.4) и помещали в чашки Петри (диаметр 100 мм) из расчета 4×106 CFU на чашку (OD62o=l соответствует 2.5×10* CFU/мл для клеток бактерийOD45o=l соответствует 2.86 X 107 CFU/мл для клеток С. albicans).

Нанесение тестируемых проб на агарозный гель с микробами осуществляли двумя способами.

Л/7−9-7. Антимикробный тест методом наложения геля. Компоненты тестируемой пробы предварительно разделяли путем электрофореза в ПАА-геле в кислой буферной системе в присутствии мочевины. По окончании электрофореза ПАА-гель, несущий тестируемые молекулы, отмывали от уксусной кислоты в 10 мМ НФБ (pH 7.4) дважды по 10 минут и помещали на поверхность агарозного геля в чашке Петри, содержащего клетки бактерий. М1−9-2. Антимикробный тест методом радиальной диффузии. Пробы в 0.01% уксусной кислоте помещали в лунки (радиус 0.9 мм), сделанные в агарозном геле, содержащем клетки бактерий. Объем пробы — 5 мкл. После нанесения проб в лунки (или наложения ПААчеля) чашки с бактериями инкубировали в течение 3 ч при 37 °C для диффузии молекул в агарозном геле. По истечении времени инкубации поверх 1% агарозного геля заливали 6% питательную среду (TSB для бактерий или SBA для С. albicans) с 1% агарозой (предварительно ПАА-гель удаляли), после чего бактерий инкубировали при 37 °C в течение.

16−18 часов. Рост бактерий останавливали добавлением 5% уксусной кислоты. Наличие антимикробной активности в тестируемых пробах оценивали по наличию «зоны лизиса» (участка агарозного геля, свободного от бактерий). В ходе очистки антимикробных пептидов для тестирования антимикробной активности использовали два вида бактерий: Escherichia coli, штамм ML35p (грамотрицательная бактерия) и Listeria monocytogenes, штамм EGD (грамположительная бактерия).

М1−10. Определение аминокислотной последовательности. Перед секвенированием чистоту пептидных проб проверяли путем электрофореза в ПААГ в щелочной буферной системе в присутствии SDS. Далее пробы либо лиофилизировали и отсылали для секвенирования доктору Ф. Буку в Институт клеточной биохимии и клинической нейробиологии Клиники Гамбургского Университета (Германия) (Istitut fur Zellbiochemie und klinische Neurobiology, Universitatsklinikum Hamburg-Eppendorf, Universitat Hamburg). Либо пептиды переносили из ПААГ после электрофореза в присутствии SDS на PVDF-мсмбрапу. Перенос осуществляли на приборе Pharmacia Biotech, модель TEG2 (Hoefer P.B. Inc., USA) в буфере: 9.6 мМ трицин (Sigma) / 10% метанол (Вектон) / 12,5 мМ Трис-HCl pH 8.23. Секвенирование пептидов, нанесенных на PVDF-мембрану, осуществляли в Научно-учебном центре Института биооргапической химии им. М. М Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН (Москва) на секвенаторе 491 Procise (Applied Biosystem).

М2. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ПЕПТИДА ArFln-1.

М2−1. Животные. Целомоциты для молекулярно-биологических исследований получали о г морских звезд Asterias rubens, содержащихся в аквариальной лаборатории на базе ЗИН РАН, с любезного разрешения доц., к.б.н. И. А. Тихомирова.

М2−2. Определение нуклеотидной последовательности транскрипта. Для выделения РНК у нескольких животных была собрана целомичсская жидкость. Забор ЦЖ проводили с помощью стерильных шприцев (диаметр сечения иглы 0.6 мм). Во время забора ЦЖ в шприце смешивали с ЭДТА в конечной концентрации 30 мМ (pH 7.4) для предотвращения активации и коагуляции клеток. Клетки осаждали путем центрифугирования (400 g)" надосадки удаляли, к клеткам добавляли раствор тризола (Sigma). Выделение РНК, синтез кДНК, полимеразная цепная реакция с полученным обратным транскрипгом (ОТ ПЦР), клонирование и секвенирование ДНК были осуществлены фирмой АТГ Сервис Ген, СПб.

М2−3. Определение размера транскрипта. РНК для гибридизации Northern blot выделяли из активированных или неактивированпых целомоцитов. Для выделения РНК была собрана целомическая жидкость у двух групп животных: предварительно иммунизированных и контрольных. Иммунизацию проводили с использованием раствора JIIIC {Escherichia coli, serotype 055: В5- Sigma) в стерильной морской воде (СМВ) в конечной концентрации 20 нг на 1 мл ЦЖ. Контрольным животным вводили эквивалентный обт>ем СМВ. Клетки осаждали путем центрифугирования, надосадки удаляли, к клеткам добавляли раствор тризола (Sigma).

Выделение РНК, синтез кДНК, ОТ ПЦР, секвенирование ДНК, синтез флуоресцентной метки и гибридизация были осуществлены фирмой Amber Company, Санкт-Петербург. Размер транскрипта оценивали в дНТФ (по ДНК размерному маркеру с включенной флуоресцентной меткой) и затем пересчитывали в НТФ (по соотношению ДНК и РНК размерных маркеров). Интенсивность амиплификации оценивали по яркости свечения ПЦР-продуктов в электрофоретическом геле при облучении ультрафиолетом. Для оценки яркости свечения электрофоретических зон использовали программу Video-Test Master 4.0.

М2−4. Синтез пептидных аналогов был осуществлен к.х.п. Н. И. Колодкиным и М. А. Афониной с использованием Вос-технологии в Лаборатории химии пептидов НИИ ОЧБ, Санкт-Петербург. Для сравнения свойств аналогов были использованы методы электрофореза в кислой буферной системе в присутствии мочевины, электрофореза в присутствии SDS, ОФ ВЭЖХдля расчета некоторых характеристик (изоэлектрическая точка, уровень гидрофобности/гидрофилыюсти) была использована программа DNAMAN ^ 4.15, Lynnon BioSoft.

М2−5. Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК).

Оценку широты спектра антимикробной активности ArFln-1 и определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) проводили методом радиальной диффузии. Была протестирована ингибирующая активность в отношении следующих грам-положительпых бактерий: Listeria monocytogenes EGD (штамм предоставлен проф. Р.Лерером. Калифорнийский университет, США (UCLA)), Staphylococcus aureus 209, Staphylococcus aureus ATCC 25 922, Staphylococcus aureus 710A, Enterococcus faecalis L3 (музейные штаммы НИИЭМ РАМН) — грам-отрицательных бактерий: Escherichia coli ML35p (UCLA), Escherichia coli ATCC 25 923, Escherichia coli M15, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27 853 (НИИЭМ РАМН) — а также клеток низшего гриба Candida albicans 820 (UCLA).

При определении МИК на тест наносили серию концентраций пептида (Сп), полученную при последовательном разбавлении 1: 1 раствора пептида в 0.01% уксусной кислоте. По окончании теста измеряли радиус зон лизиса (Rn) и строили кривую зависимости R = f (lgC). по которой восстанавливали уравнение линейной зависимости R = k (lgC) + b и рассчитывали значение Сх при R=0, данное значение и рассматривали как МИК (рис. 34а-Ь). Все минимальные ингибирующие концентрации определялись при pH 7.4. В качестве положительного контроля в антимикробном тесте при определении МИК использовали дефенсин нейтрофилов кролика NP-1 или индолицидин (кателицидин лейкоцитов свиньи).

М2−6. Тест на изменение проницаемости внутренней мембраны бактериальной клетки.

Для теста на проницаемость был использован штамм ML35p Escherichia coli. Метод разработан в лаборатории проф. Р. Лерера (Lehrer et al., 1988). Клетки указанного штамма постоянно экспрессируют в цитоплазме фермент /7-галактозидазу. Уровень увеличения проницаемости мембраны оценивали по степени разложения субстрата, добавляемого во внеклеточную среду и изменяющего при расщеплении оптические свойства (рис. 37). Изменение оптических свойств раствора фиксировали ежеминутно спектрофотомстрически (X = 450 нм) в течение 2 часов на многоканальном термостатируемом спектрофотометре (Molecular devices, Spectra MAX 250).

Для теста на проницаемость использовали бактериальную культуру в логарифмической фазе роста, которая освобождали от питательной среды центрифугированием и помещали в 1-кратный рабочий раствор: 0.03%TSB / 0.01М НФБ (pH 7.4). Концентрацию бактериальных клеток в суспензии оценивали по оптической плотности, рабочая концентрация составляет 8.3 * 107 CFU/мл.

Часть готовой суспензии использовали для получения клеточного лизата (положительный контроль). Клетки разрушали ультразвуком с использованием ультразвукового диспергатора (УЗДН-2Т) на льду, 3 раза по 30 секунд.

По 30 мкл рабочей суспензии (или клеточного лизата) помещали в лунки плоскодонного 96-луночиого планшета (Orange Scientific), уже содержащие по 10 мкл 7-кратного рабочего раствора (0.07% TSB / 0.07М НФБ (рН 7.4)), 50 мкл 2-кратного раствора субстрата для /?-галактозидазы (ONPG, Sigma- 5 мМ раствор в воде) и 10 мкл 10-кратного раствора пептида в 0.01М НФБ (или 10 мкл 0.01М НФБ в качестве негативного контроля). Непосредственно после добавления бактериальной суспензии в планшет начинается измерение оптической плотности.

В качестве контролей были использованы следующие сочетания:

1) бактериальная культура + НФБ + субстрат (негативный контроль);

2) бактериальная культура + протегрин (2 цМ) + субстрат (позитивный контроль I);

3) бактериальная культура + индолицидин (0.78 jiM — 12.5 (хМ) + субстрат (позитивный контроль 2);

4) лизат бактериальных клеток + субстрат (позитивный контроль 3);

5) лизат бактериальных клеток + субстрат + тестируемый пептид (контроль на ингибирование фермента пептидом).

Коэффициент увеличения проницаемости мембраны (в процентах) рассчитывали как: (Эксп — Контр)* 100 / (Лизат — Контр), где Эксп — OD лунок с тестируемыми фракциями, Контр — OD лунок, где вместо тестируемых фракций добавлен фосфатный буфер (негативный контроль), Лизат — OD лунок, содержащих разрушенные ультразвуком клетки бактерий (позитивный контроль 3).

М2−7. Изучение скорости проявления антимикробной активности проводили с использованием метода подсчета колоний. Бактериальную суспензию для подсчета колоний готовили в точности так, как для теста на проницаемость (учитывая 3.3(3)-кратное разбавление в лунке). К 90 мкл готовой суспензии добавляли 10 мкл 10-кратного раствора тестируемого пептида или же Юмкл 1-кратного рабочего раствора в качестве негативного контроля. Полученный раствор тщательно перемешивали. Для каждого случая было сделано по две повторности. Из каждой пробирки с интеравалом 10 или 15 минут отбирали ал и квоту (1/10) и разбавляли 1: 400 в 10 мМ НФБ (рН 7.4). Из разведенной суспензии забирали 1/100 объема, наносили на чашку Петри с питательной средой (3% TSB, 1% агар) и распределяли равномерно по поверхности среды с помощью стерильного микробиологического стеклянного шпателя. Пробы, взятые непосредственно после добавления пептида, рассматривались как пулевые точки, от которых отсчитывали время инкубации бактерий с пептидом.

После нанесения на чашки бактерий инкубировали 14−18 часов при 37 °C. после чего производили подсчет числа колоний. Коэффициент подавления роста бактериальной культуры (в процентах) рассчитывали как:

Контр — Эксп) * 100 / Контр, где Контр — концентрация бактерий (CFlJ/мкл) после инкубации бактерий с буфером, а Эксп — концентрация бактерий (CFU/мкл) после инкубации бактерий с тестируемым пептидом. Эксперимент для каждого из протестированных пептидов в каждой из концентраций был повторен по 5−8 раз.

М2−8. Изучение ингибирующей активности в отношении раковых клеток.

Эксперименты по изучению цитотоксичности в отношении опухолевых клеток проводили в лаборатории Клеточной патологии (ЦИН РАН) при участии ст.н.с. к.б.н. О. В. Шамовой. Токсичность в отношении опухолевых клеток оценивали по подавлению дыхательной активности митохондрий (МТТ-тест, Mossman, 1983). В экспериментах были использованы две суспензионные линии опухолевых клеток: эритромиелоидной лейкемии человека К-562 и гистиоцитарной лимфомы человека U-937. Для инкубации с тестируемыми пептидами были использованы клетки, находящиеся в логарифмической фазе роста. Инкубацию производили в лунках 96-луночных планшетов (Orange Scientific) в среде RPMI-1640 в СОг-инкубаторе. Количество клеток рассчитывали таким образом, чтобы в одной лунке находилось 50 000 клеток в 90 мкл раствора, к которым добавляли 10 мкл раствора пептида (в НФБ, рН 7.4) в различной концентрации. В контрольные лунки добавляли по 10 мкл буфера. Время инкубации 48 часов. За три часа до окончания срока инкубации в лунки планшетов добавляли по 10 мкл раствора МТТ (5 мг/мл в воде), по истечении времени инкубации — по 100 мкл подкисленного изопропанола (изопропанол / 0.04 M НС1). Уровень дыхательной активности оценивали спектрофотометрически на многоканальном спектрофотометре (Multiscan MS, LabSystem): оптическую плотность растворов в лунках измеряли при длине волны 540 нм (вычитая величину оптической плотности при A, = 690 нм, как фоновую).

МЗ. Статистическая обработка данных. Для статистической обработки данных были использованы однофакторный или двухфакторный дисперсионный анализ с повторениями, а также парный t-критерий Стьюдента для среднихусредненные величины характеризовали 95% доверительным интервалом (Microsoft Excel 2000).

РЕЗУЛЬТАТЫ.

На наличие антимикробной активности были исследованы составляющие целомической жидкости: форменные элементы (в виде экстрактов) и плазма целомической 'жидкости (Г1ЦЖ). Перед тестированием антимикробной активности плазма была освобождена от низкомолекулярных соединений (менее 1 кДа) с помощью диализа и использована для проведения антимикробного теста методом наложения геля и радиальной диффузии. Ни в одном случае в ПЦЖ не была выявлена антимикробная активность, поэтому работа велась только с экстрактами, полученными из целомоцитов.

В целомической жидкости А. гиЬеж представлен, главным образом, один клеточный типамебоциты, он выражено доминирует по численности, маскируя присутствие клеток других типов (клеток других типов не более 1−5% от общего числа целомоцитов) (Коренбаум. Воробьев, 1988). Наши собственные наблюдения за свежими и фиксированными мазками целомической жидкости А. гиЬет полностью согласуются с этими данными. Амебоциты морской звезды, А гиЪет — клетки средних размеров с округлым ядром, содержащим хорошо прокрашиваемое ядрышко, цитоплазма может содержать гранулы и крупные вакуоли, может быть целиком прозрачна (рис. 6а). Можно выделить три основные формы распластывания клеток на пластике (рис. ба-с), соответствующие либо клеткам в филоподиалыюй стадии, либо дискоидальным или полигональным клеткам в петалоидпой стадии. Форма растгшастывания амебоцитов, по литературным данным, зависит от способа распределения в цитоплазме актиновых фибрилл (ЕсШз, 1977; ЕсМз, 1979; Ес1с15, 1993; рис. 6с1-е). У всех иглокожих амебоциты характеризуется выраженной способностью к фагоцитозу, и амебоциты А. гиЬет не являются исключением (рис. бР^).

Р1. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСТРАКТОВ.

Экстракты получали трижды из материала, собранного в разные годы (2001, 2002, 2003). при одних и тех же условиях экстракции. Из материала 2001 года было получено три экстракта.

Эо, Э], Э2), состав и уровень антимикробной активности которых были подвергнуты сравнительному анализу. Электрофоретическое разделение в кислой буферной системе в присутствии мочевины или в щелочной буферной системе в присутствии БОЗ показало, что основное количество белка, а также большая часть низкомолекулярных катионпых компонентов (среди которых наиболее вероятно обнаружение пептидов с антимикробной активностью) находятся в Эо (рис. 7а). Антимикробный тест методом наложения геля показал преимущественную приуроченность молекул с антимикробной активностью к этому же экстракту, вследствие чего дальнейшая работа велась только с экстрактом ЭоИз материала 2002 года был получен только один экстракт — Эо. Схожесть результатов ЭФ в щелочной буферной системе в присутствии ЗОБ Эо из материала 2002 и 2003 годов с таковым 2001 года дала основания не проводить дальнейшие экстракции (рис. 7Ь). Экстракты Эо 2001. 2002 и 2003 годов подвергали сходной процедуре очистки.

Экстракт Эо был подвергнут процедуре последовательной ультрафильтрации с отсечением молекул сначала меньших 1 кДа, затем — ЮкДа. Таким образом Эо разделялся на части, содержащие высокои пизкомолекулярные (не более 10 кДа) компоненты: (рис. 8а). Наличие антимикробной активности выявлялось в обоих полученных частях (рис. 8Ь-с). Обширность зон лизиса указывает на присутствие нескольких активных компонентов как в высоко-, так и в низкомолекулярной частях экстракта. Из результатов ЭФ в щелочной буферной системе в присутствии БОБ видно, что высокои низкомолекулярные части экстракта перекрываются по составу (рис. 8а) (что может объяснять наличие активности в высокомолекулярной части экстракта, которое, кроме того, обусловлено присутствием антимикробных компонентов с молекулярной массой выше 10 кДа, в частности, лизоцима: на электрофореграмме высокомолекулярной части экстракта имеется четкая полоса, соответствующая приблизительно массе лизоцима, А гиЬет — 15.5 кДа (рис. 7Ь и 8а)).

Поскольку целевым объектом поиска являлись пептиды (т.е. молекулы с весом менее 12 кДа), то дальнейшую работу по идентификации антимикробных компонентов вели только с низкомолекулярной частью. Указанную часть экстракта фракционировали посредством препаративного электрофореза (ПЭФ, рис 9а-с). Фракции, полученные в результате ПЭФ, тестировались па присутствие антимикробных компонентов методом радиальной диффузии против грамположительной (L. monocytogenes) и грамотрицательной (Я. coli) бактерий. Антибактериальная активность наблюдалась в широком спектре фракций (рис. 9d-e). что указывает на присутствие в экстракте многих молекул с антимикробной активностью.

Р2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ.

Процесс идентификации антибактериальных молекул в активных фракциях ПЭФ включал одно или несколько хроматографических разделений методом ОФ ВЭЖХ. После каждого разделения полученные фракции лиофилизировали, перерастворяли в 0.01% уксусной кислоте и тестировали на наличие антибактериальной активности методом радиальной диффузии. Состав активных фракций оценивали путем ЭФ в ПААГ в щелочной буферной системе в присутствии SDS и масс-спектрометрии MALDI TOF. Повторную хроматографию проводили с изменением крутизны градиента ацетонитрила (MeCN) в 0.1% 'ГФУ и дробности сбора фракций до получения активного пептида в чистом виде (по результатам электрофореза и MALDI TOF).

Анализ состава активных фракций ВЭЖХ позволил идентифицировать восемь активных компонентов: 1839 Да, 2021 Да, 2238 Да, 2263 Да, 2375 Да, 2598 Да, 4156 Да и 4667 Да. Все восемь компонентов обязательно присутствовали в активных фракциях, полученных при работе с материалом всех трех лет сбора (за исключением пептида 4156 Да, который не был идентифицирован в материале 2001 года). Все восемь пептидов были выделены в чистом виде, хотя и не обязательно из материала каждого года.

Материал 2001 года. В ходе ПЭФ-2001 было собрано 125 фракций по 3.5 мл (рис. 9а). Измерение оптической плотности (к 280 нм) полученных фракций показало, что количества белка сравнительно невысокие (максимальная экстинкция — 0.039 в 41, 42, 43 фракциях). После антимикробного теста активность проявили следующие фракции:

43−69 против L. monocytogenes-, максимальная активность в 54−56 фракциях- 43−85 против Е. coliмаксимальная активность в 54−56 фракциях (рис. 9d). В силу невысокого содержания белкового материала разделению на ОФ ВЭЖХ (колонка Cs: градиент MeCN 0%-60%, 1% в минуту) были подвергнуты только шесть фракций (с максимальной активностью и высокими экстинкциями), объединенные по три: (49+50+51) и (52+53+54).

Материал 2002 года. В ходе Г1ЭФ-2002 было собрано 120 фракций по 3.5 мл (рис. 9Ь)&bdquoэкстипкции — более высокие, чем во фракциях после ПЭФ-2001 (максимальная 0.122 в 71, 72 фракциях). Активные фракции:

46−66, 84−96 против L. monocytogenes, максимальная активность в 50−55 фракциях: 40−84 против Е. coli, максимальная активность в 50−55 фракциях (рис. 9е). Разделению методом ОФ ВЭЖХ (колонка С)8- градиент MeCN 0%-60%, 1% в минуту) были подвергнуты следующие фракции (соответственно объединению перед нанесением на колонку): (47+48+49), (50+51), (52+53), (54), (55+56), (57+58), (59+60), (61+62).

Материал 2003 года. В ходе ПЭФ-2003 было собрано 98 фракций по 4.8 мл (рис. 9с), экстинкции приблизительно соответствуют таковым во фракциях ПЭФ-2002 (максимальная 0.141 в 44 фракции). Активные фракции:

26−40, 46−56 против L. monocytogenes, максимальная активность в 26−32 фракциях- 20−51 против Е. coli, максимальная активность в 24−36 фракциях (рис. 9f). Разделению методом ОФ ВЭЖХ (колонка Cisградиент MeCN 0%-60%, 1% в минуту) были подвергнуты следующие фракции: (26+27), (28+29), (30+31), (32+33), (34+35), (36+37).

Р2−1. Идентифицированные пептиды, которые были секвеиированы.

Р2−1-1. Пептид 1839 Да (АгАс1−1). Пептид со средней молекулярной массой по 15-ти измерениям 1838.8 ± 2.3 Да (разброс 1830—1844 Да входит в ошибку прибора) был выявлен как один из компонентов в следующих фракциях: 26(49+50+51)-01- 28−30(47+48+49)-02: 33(54)-02- 34(57+58)-02- 18(30+31)-03.

26-ая фракция после ОФ ВЭЖХ объединенных фракций 49−51 ПЭФ-2001 (26(49+50+51)-01) вместе с фракциями (30−32)(47+48+49)-02 (рис. 10а) была разделена методом ОФ ВЭЖХ (МеСЫ 15−45%, 0.5% в минуту) (рис. 10Ь). Среди активных фракций 52 и 53 (собраны с 25.5 по 26.5 минуты, которым на хроматограмме соответствует четкий пик) содержали искомый пептид в чистом виде 1842 Да, рис. 10с-е). Пептид из 52-ой фракции был лиофилизирован и в дальнейшем секвенирован.

Фракция 29(47+48+49) была объединена с фракциями 32(52+53) и 32(55+56) (на основании присутствия пептида 2728 Да во всех названных пробах) и подвергнута разделению методом ОФ ВЭЖХ (МеСМ 15−45%, 0.5% в минуту) (рис. 11а). Из полученных в результате разделения фракций антибактериальную активность проявили 7−9 и 11−12. Электрофорез в присутствии ЭБЭ и масс-спекгрометрия показали присутствие в 9-ой фракции (9-ая минута на хроматограмме) только одного компонента — пептида с молекулярной массой 1841 Да (рис. 11Ь), которому на хроматограмме соответствует четкий пик.

Р2−1-2. Пептид 2021 Да (АгР1п-1). Присутствие пептида со средней молекулярной массой по 18 -ти измерениям 2020.7 ± 2.4 Да (разброс 2014;2030 Да входит в ошибку прибора) было выявлено в следующих фракциях: 31 -32(49+50+51)-01- 35(47+48+49)-02- 32(52+53)-02- 34(54)-02, 35−36(55+56)-02.

Для нанесения на хроматографическую колонку некоторые фракции были объединены, в частности: 32(49+50+51)-01 и 35(55+56)-02 (МеСЫ 15−45%, 0.5% в минуту, рис. 12а).

Противобактериальная активность была выявлена в трех фракциях: 16. 18, 21 (табл. 1), собранных на соответствующих минутах. В составе 18-ой фракции был выявлен только один компонент — пептид с молекулярной массой 2023.6 Да (рис. 12Ь).

Табл. 1. Результаты антимикробного тестирования (радиальная диффузия) фракций после хроматографическот разделения {32(49+50+51)-01 + 35(55+56)-02).

Радиус зоны лизиса, мм Молекулярная масса основных компонентов, Да фр. пюпосу1о^епех Е.соИ.

16 2,1? ? много различных компонентов: 2222, 2733 и др.

18 1,6 0 пептид 2024.

21 1,9 0 доминирующий компонент — пептид 2595.

3,9 4,0.

Из фракций, полученных в результате ОФВЭЖХ пробы 34(54)-02 (рис. 1 За) (MeCN 15−45%. 0.5% в минуту, рис. 13Ь), только одна (31, соответствующая 31-ой минуте) оказалась активной (рис. 13с) (ей соответствует ясный пик на хроматограмме). Электрофорез в щелочной буферной системе в присутствии БОБ и МА1Т)1 ТОР показали присутствие в составе фракции только пептида 2020.9 Да (рис. 13с1-е). Пептид из этой фракции был лиофилизировап и секвенирован.

Также в чистом виде данный пептид был идентифицирован в активной 31-ой фракции после ОФ ВЭЖХ объединенных фракций {(36+37)(55+56)-02} (МеСЫ 15−45%, 0.5% в минуту. МУ 2018 Да, рис. 14а-с), в 82-ой и 83-ой фракциях после ОФ ВЭЖХ объединенных фракций {(33+34)(50+51)-02)+((34+35)(52+53)-02} (МеСЫ 15−35%, 0.33% в минуту, 2022 Да. рис. 15а-е), а также в 29-ой фракции после ОФ ВЭЖХ (30+31)-03 (МеСИ 15−45%, 0.5% в минуту. 2022 Да, рис. 16а-с).

Р2−1-3. Пептид 2238 Да (АгАс1−2). Пептид со средней массой по 27-ги измерениям 2237.7 ± 2.4 Да (разброс 2224—2248 Да входит в ошибку прибора) был идентифицирован в составе следующих фракций: 28−29(49+50+51)-2001; 27−28(52+53+54)-01- 31−36(52+53)-02- 31−36(54)-02- 31−36(55+56)-02- 30−34(57+58)-02- 22(28+29), 20−22(30+31)03.

Изучение фракции 28(52+53+54)-01 показало, что единственным составляющим является пептид 2237.1 Да (рис. 17а-с). После электрофореза в щелочной буферной системе в присутствии БОБ пептид был перенесен на РУБР-мембрану и отослан на секвенирование.

После ОФ ВЭЖХ объединенных фракций 36(50+51) и 36(52+53) (МеСК 15−45%, 0.5% в минуту) пептид 2232 Да был получен в чистом виде в 23-ей фракции (МУ 2231, рис. 18а-с).

Кроме того, указанный пептид в чистом виде находится в активной 32-ой фракции после ОФ ВЭЖХ объединенных фракций {(36+37)(55+56)-02} (МУ 2224 Да, рис. 14Ь-с- 19), в 59-ой и 60-ой фракциях (МУ 2245 Да) после ОФ ВЭЖХ многих объединенных фракций, содержащих искомый пептид как один из компонентов после первичных и вторичных хроматографий (поэтому данное разделение было обозначено «2237» (МеСЫ 15−35%, 0.33% в минуту, рис. 20а-с).

Р2−1-4. Пептид 2264 Да (АгН81−1). Пептид со средней молекулярной массой по 18-ти измерениям 2263.5 ± 2.2 Да (разброс 2254—2269 Да входит в ошибку прибора) был обнаружен в составе следующих фракций: 35(49+50+51)-01- 28(47+48+49)-02- 27(50+51)-02- 28−29(52+53)-02- 29−31(55+56)-02- 30(57+58)-02- 33−34(26+27)-03.

Исследование состава 8-ой фракции после ОФ ВЭЖХ фракции 28(47+48+49)-2003 (МеСЫ 15−45%, 0.5% в минуту) показало наличие единственного компонента — пептида с молекулярной массой 2263 Да (рис. 21а-с).

После ОФ ВЭЖХ объединенных фракций 28(49+50+51 >01, 31(55+56)-02 и 30(57+58)-02 (МеСЫ 15−45%, 0.5% в минуту, рис. 22а) антибактериальная активность выявлялась в 8−11 фракциях (рис. 22Ь). В 11-ой фракции (11-ая минута) был идентифицирован пептид 2254 Да в чистом виде (рис. 22с).

В результате первичной ОФ ВЭЖХ объединенных 26-ой и 27-ой фракций ПЭФ-03 (?4eCN 15−50%, 1% в минуту первые 10 минут, далее — 0.5% в минуту) антибактериальная активность выявлялась в широком спектре фракций (24−42), однако электрофорез и МАЬ01 ТОБ показали, что содержимое только одной из них является гомогенным: 17-ой минуте соответствует выраженный пик на хроматограмме и 34-ая фракция, содержащая пептид 2265.3 Да в чистом виде (рис. 23а-ё). Пептид был лиофилизирован и ссквенирован.

Р2−1-5. 2375 Да (ЛгНм1−2). Пептид со средней массой по 14-ти измерениям 2375.4 ± 4.7 Да (разброс 2364—2383 Да входит в ошибку прибора) присутствует в следующих фракциях: 35(49+50+51)-01, 28−29(47+48+49)-02, 32(52+53), 32(55+56)-2003, 34(57+58)-2003.

31-ая фракция после первичной ОФ ВЭЖХ фракции 54 ПЭФ-02 была подвергнута вторичной хроматографии при более пологом градиенте ацетонитрила (МеСЫ 15−45%, 0.5% в минуту), из полученных фракций антимикробную активность проявили 12−16. Состав всех фракций оказался гетерогенным, за исключением 14-ой, содержащей единственный компонент с молекулярной массой 2367.5 Да (рис. 24а-с).

Как было указано, пептид 2264 Да был, в частности, идентифицирован в чистом состоянии во фракции 8 из ОФ ВЭЖХ-разделения 28(47+48+49) (рис. 21а-с). Из 9-ой фракции, полученной после этого же разделения был идентифицирован в чистом виде пептид с молекулярной массой 2381.4 Да (рис. 25). Пептид из данной пробы был лиофилизирован и отправлен на секвенирование.

Электрофорез в присутствии ЭБЭ и МА1Л31 ТОР-исследования фракций, полученных после ОФ ВЭЖХ 28-ой и 29-ой фракций ПЭФ-03 (МеСЫ 15−45%, 0.5% в минуту), показали, что одна из активных фракций — 18-ая — содержит только один компонент — пептид с молекулярной массой 2381 Да (рис. 26а-с).

выводы!

1. Целомическая жидкость морской звезды Asterias rubens характеризуется присутствием выраженной антимикробной активности, связанной с ее форменными элементами, но не плазмой. Указанная активность обусловлена присутствием многих различных молекул, из числа которых в части экстрактов, содержащей низкомолекулярные (< 10 кДа) компоненты, было идентифицировано восемь пептидов с молекулярными массами 1839 Да, 2021 Да, 2238 Да, 2263 Да, 2375 Да, 2598 Да, 4156 Да и 4667 Да.

2. Пять из восьми пептидов являются производными цитоплазматических или ядерных белков. Два пептида — фрагменты молекулы /?-актина и представляют один и тот же участок ДНКаза-1 связывающей петли с разницей в длине пептида 4 аминокислоты на С-конце фрагмента. Два других пептида — фрагменты молекулы гистона I12A, они также представляют один участок молекулы с разницей на одну аминокислоту на N-конце фрагмента. Один из пептидов (ArFln-1) — фрагмент Ig-подобпого домена актип-связывающего белка филамина.

3. Продукция пептидов с антимикробной активностью путем протеолиза белков в норме выполняющих иные функции (гистонов, в частности) можно рассматривать как универсальный механизм, распространенный среди представителей различных филогенетических ветвей целомических животных (Ecdysozoa, Lophotrochozoa, Deuterostomia). Наиболее вероятным способом освобождения выделенных пептидов в ходе защитного ответа (по аналогии с другими подобными пептидами) является разрушение целомоцитов в месте повреждения покровов или микробной инвазии (при формировании клеточного сгустка в ходе реакций гемостаза или инкапсуляции).

4. В целомоцитах А. гиЪет — присутствуют пять различных транскриптов, кодирующих соответствующую пептиду АгР1п-1 последовательность: 4000 нт, 3000 нт, 2200 нт, 1600 пт и 1150 нт. Уровень экспрессии всех пяти транскриптов увеличивается в ответ на инъекцию ЛПС в полость тела, что указывает на важность продуктов данных транскриптов для развития защитного ответа организма.

5. Пептид АгР1п-1 проявляет ингибирующую активность в отношении широкого круга объектов: прокариотических клеток (грам-положительных и грам-отрицательных бактерий в приблизительно равной степени) и эукариотических клеток (клеток низших грибов в несколько меньшей степени, чем против бактерий, а также опухолевых клеток млекопитающих). Минимальные ингибирующие концентрации против микробных клеток сравнимы с таковыми, характерными для большинства других антимикробных пептидов.

6. Реализация губительного действия АгР1п-1 на клетки бактерий в минимальной ингибирующей концентрации требует не более 10 минут, она не связана с нарушением барьерных свойств мембраны клетки-мишени, и достигается, следовательно, за счст связывания цитоплазматических мишеней. Для прохождения через мембрану без задержки в ней решающим оказывается, вероятно, наличие в молекуле пептида остатков пролина.

7. В концентрациях, превышающих МИК (> 3 цМ), эффективность бактерицидного действия АгР1п-1 возрастает. Увеличение эффективности наблюдается после латентной фазы (продолжительность 30−45 минут) и связано, вероятно, с накоплением пептида (в силу высокой гидрофобности) в мембране клетки мишени в количестве, достаточном для изменения се свойств, в частности, увеличения проницаемости.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Проведение нашего исследования было не возможно без участия целого ряда людей, которым автор хотел бы выразить свою благодарность: в первую очередь, это руководитель лаборатории, в которой была проведена основная часть работ, В. Н. Кокряков — за терпение и за предоставленное автору количество степеней свободыа также один из ведущих сотрудников этой лаборатории Г. М. Алешина, под ее руководством были освоены базовые методы исследований. Многие аспекты, связанные с использованием сложных технологий, не получили бы в нашей работе освещения без сотрудничества Т. В. Овчинниковой (ИБОХ. секвенирование пептидов), О. В. Шамовой (НИИЭМ, масс-спектрометрия), Н. И. Колодкина (НИИ ОЧБ, химический синтез пептидов). Молекулярно-биологические исследования проводились с использованием животных из Морской аквариальной лаборатории на базе ЗИН РАН, что было бы невозможно без содействия И. А. Тихомирова. Неоценимую дружескую помощь в сборе экспериментальных животных в условиях Белого моря оказала Е. А. Голикова. Кроме того, автор выражает свою глубокую признательность тем людям, которые изо дня в день поддерживали его в исследовательской работе в ИЭМе (в первую очередь, это Т. В. Абрамова, М. Н. Берлов, Е. С. Кораблева, А.Д.Краснодембская), а также преподавателям и студентам кафедры зоологии беспозвоночных СПбГУ (А.В.Гришанкову. О. Н. Котенко, Г. Г. Паскеровой, Е.С.Хоменко), которые находили в себе силы для оказания моральной поддержки автору, чем, безусловно, содействовали успешному развитию нашего исследования.