Изучение основных биологических свойств живой сибиреязвенной антибиотикоустойчивой вакцины СТИ-ПР в процессе длительного хранения

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. На территории Российской Фелераиии имеется значительное количество стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов (Черкасский Б.Л., 1999; Жуков, А Н. с соавт, 2000; Нрсмснхо ЕЛ с соавт, 2001). В стране ежегодно регистрируются случаи заболевания людей и животных сибирской язвой (Монисоа А. А с соавт, 1997; Черкасский Б. Л., 2002; Онншеихо ГГ., 2003). При этом, отличительной особенностью сибиреязвенного микроба является чрезвычайная устойчниосгь и длительная сохраняемость его спор в почве, что создает реальную угрозу заражения животных и людей, тем самым может способствовать осложнению злизоотологической и эпидемиологической ситуации (Соркнн ЮИ, РолзиховскнЙ А.В. 1997. Ипатснют Н, Г., Выдрнн B. R, 1998; Черкасский БJI, 1999; Бакулов И Ас еоант, 2001, Pini Р,(19%- Hauwacrt Th, t 2002) Возбудитель данного заболевания еще со времен Л мировой войны считается одним нз вероятных агентов бактериологического оружия. События в США с появлением писем со спорами сибирской язвы подтвердили факт, что Bacillus anihracis может использоваться для локальных бногеррактов (Тихонов ЯГ., Лнпиицкнй, А В., 2000; Черкасский Б Л. 2002, Berche Р., 1998. Lamb А, 2001. Dcnun Ph, 2001, Perkin В., 2003).

Важным противоэпидемическим звеном в борьбе с этим особо опаасым инфекционным заболеванием принадлежит иммунопрофилактике, в частности вакнннам (Бакулов И А, с соавт, 2001, Пименов Е В, с соавт., 2002; Ivins Е В. et aJ, 1994, Tumbull Р clal, 200l).

Анализ данных литературы отечественных и зарубежных авгорон свидетельствует о разноплановом изучении средств специфической профилактики сибирской язвы усовершенствование существующих аилов живых вакцин путем получения их антибиогикоустойчнаыч вариантов {Буравцева НП, 1991, Pomerantsev АР, 1995, Пименов Е В с соавт, 2002), сочеганное применение живых вакиин с неспецифнческнмн нммуномодуляторамн (Шляхов Э.Н., Кику В. Ф, 1984, Когогкова О. И., 1989.

2000, 2004), экспериментальное изучение химических вакцин (Fellows P.F. et at, r 1998, 2001″ Knedlander A. 2002), а также получение вакшш методами генной инженерии (Tang D ct at. 1992; Price В ct al 2001, Hahn U K ct al., 2003; Galloway & et al, 2003).

Живые вакцины, в отличие от других видов вакцин, имеют ряд преимуществ рентабельность нх промышленного производства (Буравцева Н.П., 1991), индукция более продолжительного иммунитета {Ivms В.Е., Wclkos S L" 1988). Несмотря на то, что по безопасности живые вакцины уступают химическим, они легко контролируются применением информативных методов оценки нх остаточной вирулентности, генетической стабильности н однородности производственных штаммов микроорганизмов (Бекгнмнрон Т.Д., 1997). Данный вид вакцин характеризуется сохранением основных феиотнпических и генетических свойств их клеточной популяции, а том числе иммунологической активности {Буравцсва Н.П., 1991),.

Однако живые сибиреязвенные вакцины. в частности вакцина СТИ, невозможно использовать одновременно с антибиотиками, как средствами экстренной профилактики. Это явилось основанием к проведению многолетних исследований, в результате которых в СтавНИЛЧИ была создана живая антибнотихоустойч и вая сибиреязвенная вакцина СТИ-ПР (Буравцева HJL. 1987).

Приоритстиость проведения сочетанной спсщ|фнчсской и экстренной профилактики в системе противоэпидемических мероприятий определяется необходимостью купирования инфекционного процесса у потенциально инфицированных и скорейшего создания иммунной прослойки, прежде всего среди групп с наибольшим риском заражения {Рыжко ИВ с соавг. 2003; Молдаван И. А., 2005).

В СтавНИЛЧИ имеется целый ряд серий вакцины СТИ-ПР. лнофкльно высушенных на различных средах в различные годы, изучение которых представляет не только научный интерес, но имеет н практическое значение, гак как одной из важных проблем современной вакиинвлогни является периодический кош-роль за стабильностью сохранения основных фенотнпических. генетических. в т. ч. нммутюгснных свойств живых вакцин (Марнннн Л И. с еоавт, 1999. 2003).

К настоящему времени накопилось значительное количество современных, в основном, негру доем к их н легко воспроизводимых экспериментальны к методов изучения различных фенотнпических и генетических свойств сибиреязвенного микроба, использование которых, на наш взгляд, является весьма перспективным и может быть существенным дополнением к ныне действующим Методическим указаниям «Основные требования оценки вакцинных штаммов сибиреязвенного микроба дня иммунизации людей» (Саратов, 2002) Так, разработана питательная среда для определения продукции экзотоксина и капсулообразования сибиреязвенного микроба (Еременко F, И, 1997). Предложен штамм В anlhracts 81/1 в качестве типичного вирулентного тест-заражаюшсго иггамма для определения нммуногенкости живых сибкреязвстгых вакцин (Буравцева Н.П. с соаат., 1999) Эксперимагтально апробирован метод определения иммуногенностн живых сибиреязвенных вакцин, но двум лозам заражения данным нпаммом вакцинированных морских евниок (Буравпева НП, 199]).

В качестве информативного метола определении уровня специфического антнтелообразоваиия предложен непрямой метод реакции иммунофлуорсспенпнн (Буравцева Н. Г1. с соавт. 1998). Показано, что при поствакцнкадыюм противосибнреязвенном иммунитете наиболее информативным параметром клеточных факторов несмецнфическон рстистетггностн является кислородзависимая функция нейгрофнлов крови, регистрируемая в тесте восстановления ннтроеннего тетраэолия, гуморальных фаюоров — лизоцим (Коготкова О.И., Буравцева Н. П., 1993). В последнее десятилетне существенным дополнением к характеристике возбудителя сибирской язвы служат данные полнмерашой цепной реакции (Ramisse V. а а! 1996; Kennel al. 2000).

Сказанное выше убедительно свидетельствует о широком диапазоне э кс пер им енгал ьи о-м стодим с схих подходов к гаучению возбудителя сибирской язвы и живых дикции против данного заболевания. Однако анализ данных литературы показал, что сведения по изучению стабильности сохранения основных свойств вакцин после их длительного хранения носят единичный н разобщенный характер (Гннсбург Н И. с соавт, 1964, Салтыков, А А с совет, 1976; IНенцев ИВ с соавт, 198]. Шереметьева ЮВ, с еоаат, 2004), что побудило нас к систематизации и разработке алгоритма изучения и получения живых сибиреязвенных вакцин как в условиях in vitro, так и в условиях m vivo Исследования решено было выполнить на примере различных серий антибжлнкарегнететной живой сибиреязвенной вакцины СТИ-ПР, так как в доступной литературе имеются единичные сообщения о свойствах данной вахиины (Буравцева ШТ., 199!, 2002, Pomerantsev, А Р et al t1995).

ЩЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: изучил" основные биологические свойсгва различных серий, усовершенствовать методы оценхн и повышения нчмуногенносгн живой сибиреязвенной аитнбиотнкоустойчивой вакцины СТИ-ПР.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1 Изучить стабильность сохранения основных биологических свойств различных серий вакцины СТИ-ПР после длительного хранения.

2 Разработать алгоритм исследования живых сибиреязвенных вакцин в эксперименте.

3. Получить новые экспериментально-производственные серии вакцины СТИ-ПР.

4 Определить протсктивное действие сочетанного применении вакцины СТИ-ПР с иммуномодулятором ликопндом.

5 Определить иммунологическую эффективность вакцины СТИ-ПР при ее сочетанием применении с антибиотиками и ликопндом.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

В результате впервые проведанного комплексного анализа дана сравнительная характеристика биологических свойств различных серий вакцины СТИ-ПР после их длительного хранения, а также изученных клеточных популяций, выделенных из них и вновь полученных экспериментально-производственных серий данной вахпины установлена однородность клеточных популяций по фснотипическому. биохимическому, генетическому признаку, а также аятнбнотикоустойчнвосгн.

Доказана стабильность сохранения основных феиотипнческих, генетических н иммунологических свойств вакцины СТИ-ПР на протяжении 25 лет хранения (срок наблюдения], что иллюстрирует и подтверждает значительное преимущество живых вакцин над другими видами.

В результате впервые проведенного анализа плазмндного и генного профиля различных серий вакцины СТИ-ПР после длительного хранения и сравнительного анализа их генетической вариабельности по разным л оку сам, установлено, что генетическая однородность ив уровне отдельных серий вакцины СТИ-ПР подтверждена принадлежностью к 4 VNTR-категор ни культур, выделенных из различных серий данной вакцины, по локусу vrrA.

Впервые выявлена высокая устойчивость вакцины СТИ-Г1Р к карбеннциллину (10 ООО мкг/мл).

Установлено, что лккопкд. введенный в схему однократной подкожной иммунизации усиливает протсктивный эффект вакцины СТИ-ПР.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Экспериментально доказана возможность увеличения срока годности вакпины СТИ-ПР с 2−3 лет до 5−8 лет.

Результат исследований свидетельствуют о необходимости усовершенствования существующих и поиска новых сред бактериологического контроля за специфической стерильностью препарата.

Хромосомная детерминация антнбнотнкореэнстентностн к бензилпенициллину, ампициллину, оксацкллнну, мстнцнллину, рифамницину. а также стабильность сохранения основных биологических свойств вакцины СТИ-ПР на протяжении длительного времени характеризуют последнюю как перспективное средство иммунопрофилактики сибирской язвы.

Определены критерии для скрининга наиболее иммуногенных клеточных популяций живых сибиреязвенных вакцин.

Разработанный алгоритм изучения живых сибиреязвенных вакцин может служить научно-методической основой для дальнейшею усовершенствования существующих и разработки новых видов живых сибиреязвенных вакцин.

При изучении иммунологической эффективности вакцины СТИ-ПР на морских свинках экспериментально доказана возможность снижения иммунизирующей дозы с 5*107 спор до МО6 спор при однократном подкожном методе введения.

В соавторстве разработаны методические рекомендации «Определение иммуногенности живых сибиреязвенных вакцин по двум дозам тест-заражающего вирулентного штамма». утвержденные директором СтавНИПЧИ профессором В. И Ефременко, протокол заседания Ученого совета 6 от 25 июня 2004 г. и методические рекомендации- «Изучение стабильности сохранения устойчивости к антибактериальным препаратам у аитибиотикоустойчнвых штаммов В anthraca в процессе хранения*, утвержденные директором СтавНИПЧИ профессором В-И. Ефрсменко. протокол заседания Ученого совета № 5 от 27 мая 2005 г.

Матернаны диссертации вошли в заключительный отчет по научно-исследовательской работе «Изучение жизнеспособности спор, стабильности сохранения устойчивости к антибиотикам и иммуногенных свойств вакцины СТИ-ПР после длительного хранения, совершенствование ее понуллцнонного состава и определение эффективности сочстанного применения вакцины с табельными антибиотиками и ИММу*"модуляором ликопндом» (2002;2004 гг), являющейся составной частью по теме «Разработка н совершенствование средств и методов профилактики и лечения опасных и особо опасных инфекционных заболеваний» Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки гю приоритетным направлениям науки и техники» на 2002;2СЮ6г г., блок 2 «Понсково-лриклалные исследовании и разработки», раздел «Технология живых систем», подраздел «Защита or патогенов», где автор был исполнителем.

Раздел 4.1. выполнен совместно со старшим научным сотрудником лаборатории сибирской яшм СтаяНИПЧИ, кандидатом медицинских наук, Цыганковой О.И.

Раздел 5 1 выполнен совместно с ведущим научным сотрудником лаборатории диагностических препаратов особо опасных и других инфекций, доктором биологических наук. Жэрниковой И В., за что автор выражает им искреннюю благодарность.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1 Изученные серии вакцины СТИ-ПР стабильно сохранили свои основные биологические свойства после их длительного хранения.

2 Алгоритм определения нммуиогекиости живых сибиреязвенных вакцин.

3 Ликопнд, вводимый однократно подкожно одновременно с вакциной СТИ-ГТР оказывает иммуностимулирующий эффект при постаакцннальном противосибиреязвенном иммунитете.

4 Иммунологическая эффективность вакцины СГИ-Г1Р повышается при сочстаниом введении антибиотиков широкого спектра действия и ликопида.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Материалы диссертации были представлены на юбилейной научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе Итоги и перспективы», посвященной 50-летию Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (Ставрополь, 2002), на конференции с международным участием «Современные средства иммунолналюсгики. имыунон экстренной профилактики актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2004), ни Всероссийской научно-практической конференции^{Медицинская} микробиологияXXI век" (Саратов, 2004), на межлабораторных научных конференциях СтавНИЛЧИ (2002;2005).

ПУБЛИКАЦИИ.

Основное содержание диссертации отражено в 11 опублихованных работах.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

.

Работа изложена на 145 странице машинописною текста и состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследовании, заключения, выводов и списка литературы, включающего 197 работ, in них 112 отечественных и 85 зарубежных авторов. Материалы иллюстрированы 8 рисунками, 29 таблицами.

121 ВЫВОДЫ В течение 13−25 лет хранения лнофнльно высушенные экспериментальные и эспериментально-прои-заодстяенные серии вакцины СТИ-ПР стабильно сохранили свои культурально-морфолошческне, биохимические, иммунологические свойства и устойчивость к антибиотикам бетидпен И1шллнну, ампициллину, оксацнллнну, меткцнллнку и рифампипину Установлена высокая устойчивость вакцины СТИ-ПР к карбенншшшну.

2 Состав среды для лиофнльного высушивания су щественно влияет на продолжительность сохранения жизнеспособности спор вакцины Оптимальными консервирующими свойствами для вакцины СТИ-ПР обладают тномочевнновая и сахарозо-желатн новая среды высушивання, па которых через 8 лет хранения регистрируется до 50−58% жизнеспособных спор от исходного уровня, что дает основание увеличить срок годности с 2−3 лет до i-8 лет и внести соответствующие изменения в регламет" производства.

3 Все изученные серии вакцнны СТИ-ПР сохранили гены, ответственные за токсинообразование и не содержат гены, регулирующие капсулообразованне Культуры всех серий вакцины в полнмеразиой пепной реакции дают ампликоны размером 166 п, н, и относятся, как и коммерческая вакцина СТИ, к наиболее распространенной в мире 4 VNTR категории, что на молскулярно-гснстнчсском уровне иллюстрирует стабильность сохранения основных биологических свойств вакцины СТИ-ПР.

4 Алгоритм исследования и получении живых антнбиогикоустойчнаых сибиреязвенных вакцин должен включать отбор клеточных популяций на среде СОПЭК,.

— получение споровой культуры, изучение процесса спорообразования и определение концентрации спор,.

— изучение основных биологических свойств in vitroопределение наличия генов токсинов и капсулы. изучение чувствительности к антибиотикам, определение нммуногснности in vivo по двум дозам заражения и индексу иммунитета,.

— изучение действия вакцины на клеточные и гуморальные факторы нсспспифической резистентности и специфического иммунитетаполучение экспериментально-производственной серии вакштны и изучение ее свойств;

— заключение н рекомендации по усовершенствованию и разработке вакцин.

5, Ликопид обладает самостоятельным пролонгированным нммуномодулируюшим действием при поегинфекинонном протнвоенбиреязвенном иммунитете.

6. При иммунизации животных вакциной СТИ-ПР с одновременной антибиотикотерапиен рнфампнцнном нммуногенность вакцины не снижается.

7 Под действием лнкопида повышается протективный эффект одновременного проведения иммунопрофилактики вакциной СТИ-ПР и антибиотике терапии рнфампнцнном.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Высокая патогенность возбудителя сибирской язвы, его способность поражать как людей, так и сельскохозяйственных животных, доступность массового производства. чрезвычайная устойчивость и окружающей среде, возможность его распространения аэрозольным путей, трудность прижизненной диагностики и лечения возникающей в этом случае висцеральной формы заболевания служат основанием считать В. anihracis одним из наиболее вероятных и опасных агентов биологического оружия (Черкасский Б Л. 2002).

В общем комплексе противоенбнреязвенных мероприятий существенная роль принадлежа вакпннопрофилактике Многолетнее применение вакцины С1″ И в нашей стране обеспечило значительное снижение заболеваемости сибирской язвы среди людей и животных (Бакулов И. А, 2000).

Однако в ентуаиин, связанной с использованием спор возбудителя сибирской язвы в качестве агента биотерроризма альтернативой иммунопрофилактики является экстренная профилактика антибиотиками. При этом курс приема препаратов в среднем составляет 60−90 дней при ингаляционном способе заражения и чреват развитием осложнений, связанных с длительным их введением Оптимальной схемой профилактики сибирской язвы в данном случае является использование вакцины, устойчивой к антибиотикам, на фоне более краткого курса введения антибактериальных препаратов, к которым вакцина у стойчива.

Это явилось основанием к проведению многолетних исследований, в результате которых в СтавНИПЧИ была создана живая шггнбнотнкоустойч нвая сибиреязвенная вакцина СТИ-ПР (Буравиева П. П., 1991).

В настоящей работе изучено 17 экспериментальных серий и 4 производственные серии вакцины СТИ-ПР после 25 лет нх хранения в лаборатории сибирской язвы СтавНИПЧИ.

Анализ данных литературы по га умению сохранения основных свойств различных сибиреязвенных живых вакцин после ддктелшкмо хранения указывает на актуальность выбранного исследования (Гннсбург Н.Н. с соавт ., 1964, Салтыков А. А, с соавт., 1976, Шснцсв И В. с соавт., 1981, Мариннн Л. И. с соавт, 2003, Шереметьева Ю В. с соавт. 2004).

В результате проведенных нами исследований установлено, что после 25 дет хранения все серии вакннны СТИ-ПР стабильно сохранили высокую однородность клеточной популяции по морфологии роста на жидких и плотных питательных средах, отсутствию фосфатазной. лецитнназной, гемолитической активности, наличию претеолнтической активности по отношению к яичному альбумину, способности гндролиювать желатин и казеин, положительной пробе с сибиреязвенным бактериофагом «Гамма А-26», а также по отрицательной пробе на пепнциллиназу в тесте «жемчужного ожерелья».

Вместе с тем, выявлено снижение количества жизнеспособных спор по сравнению с исходным уровнем по мере увеличения срока хранения, а также зависимость количества жизнеспособных спор от состава среды, на которой они были лнофшптзированы Лучшими консервирующими свойствами обладали тиомочевиновая и сахарозд-жедотиновоя среды высушивания. Препараты, приготовленные с их использованием, через 5 лет хранения имели 57−66% жизнеспособных спор, через 8 лет — 50−58% от исходного уровня, «по дает основание для увеличения срока годности данной вакцины.

В процессе хранения вакцины встает вопрос о стабильности сохранения устойчивости к антибактериальным препаратам При проверке чувствительности вакцины СТИ-ПР к антибиотикам было отмечено, что се устойчивость к бензил пенициллину, ампициллину, оксацнллнну, мстнщтллину и рифам пицнну после 25 лет хранения осталась на прежнем уровне Экспериментально выявлена высокая устойчивость данной вакцины к карбеннцнллину Различные серии вакцины СТИ-ПР оказались умеренно устойчивыми к цсф алексину. эритромицину, олсандомнцину, лкнкомнцнну, левом нцеткиу и ванкомнинну.

В процессе исследования нами были разработаны методически с рекомендации «Изучение стабильности сохранения устойчивости к антибактериальным препаратам у антибиотикоусгойчнвых штаммов В anihracis в процессе хранен кя», согласно которым целесообразно использовать не вегетативную культуру, а споровую взвесь, тем самым сокращая метод исследования с 48 ч до 24 ч.

Стабильность и длительная сохраняемость резистентности к пенициллину н рнфампнцнну может быть следствием хромосомной детерминации устойчивости к ннм и метода ее получения. Д. Г1. Померанцев с соавт отмечает, что в основе действия рнфампииина лежит связывание и ингибирование РНК-полнмеразы бактериальной клетки Резистентность к рнфампнцнну обычно связана с мутациями в р-субъеднннце РНК-полнмеразы, кодируемой геном rpo-В Следствием этих мутаций являются изменения в рнфампицнн-связываюшеч участке, а также разнообразные фснотнпнчсскне изменения бактериальной клетки (Pcrcy-Fine S. et al., 1999. Dtng, J.J., Gross C.A., 1986). Стабильность сохранения устойчивости вакцины СТИ-ПР к пенициллину и рифамннцину if мест преимущество перед ноднрезистеитнымн вакцинами, устойчивыми к тетрациклину Данный признак опосредован генами плазм ид, способными к элиминации при переходе к спорообразованию и хранению в вегетативном состоянии на питательных средах без добавления антибиотика.

При изучении иммуногснности 1 и 2 производственных серий н 10, 17 экспериментальных серий вакцины СТИ-ПР после длительного хранения отмечено, что 2 и 10 серии по ИИ несколько уступали вакцотгс СТИ. В то же время индекс иммунитета у 17 серии равнялся 79 против 45 для вакцины СТИ, у 1 производственной серии — 200 (р<0,05).

Вакцинный штамм должен содержать пдазмиду рХ01 или клонированные гены, ответственные за синто ПА Плазмида рХ01 (ПО МД) кодирует синтез сибиреязвенного экзотоксина, состоящего из нротектнвного антигена, легального фактора н отечного фактора ПА является основным иммуногенным фактором сибиреязвенных вакцин (Методические указания «Основные требования опенки вакцинных штаммов сибиреязвенного микроба для иммунизации людей», 2002).

Данные по анализу генома дают основание говорить о целесообразности качественного определения продукции токсина in vitro, наличия генов ПА н cap, а также генотнпнровання, возможно, по большему числу локусов, для получения предварительных данных об нммуногенности и безвредности вакцинных штаммов, необходимых для скрининга н контроля различных серий вакцин.

Полученные данные о жизнеспособности спор, в сочетании с данными по сохранению устойчивости к антибиотикам и нммуногснносги дают основание для внесения изменений в нормативно-техническую документацию относительно сроков годности живых сибиреязвенных вакцин Вместо 2*3 лет хранения, заложенных в регламент производства, можно увеличить срок хранения вакцин до 5−8 лет прн условии использования для лнофилнзацин препарата с&харозо-жслатиновой или тномочевнновой среды высушивания.

Научный интерес представляют данные, которые могут быть получены прн дальнейшем изучении основных биологических свойств вакцины прн последующем хранении в условиях непостоянного температурного режима.

Проведенные исследования свидетельствуют о соответствии генотипа штамма СТИ-ПР представлениям о генотипе вакцинных штаммов — наличие генов, детерминирующих токсинообразоваине, и отсутствие генов капсулообразоваиня, а так же об однородности генотипа всех серий вакцины № В. anthracis СТИ-ПР Несмотря на сохранение штаммом СТИ-ПР, а целом основных наиболее важных дня вакшны фено типических свойств и генетических характеристик, наблюдалась и некоторая гетерогенность попу ляпни. Так, терн посеве пасен спор на среду СОПЭК, среди подавляющего большинства крупных плоских шероховатых колоний с классическими «локонами» по краю, встречались мелкие выпуклые колонии с более гладкой поверхностью и почти ровным краем, так же образующие линии преципитации. Отдельные колонии не давали линий преципитации Вышесказанное послужило поводом для скрининга наиболее иммуногенных клеточных популяций с целью дальнейшего получения новых серий вакцины СТИ-ГГР.

На примере вакцины СТИ-ПР нами разработан алгоритм изучения живых сибиреязвенных вакцин в эксперименте, состоящий из двух этапов проведение нс-слсдовэний в условиях in vitro и проведение исследований в условиях in vivo.

Первый этап включает скрининг in vitro наиболее иммуногенных клеточных популяций различных серий вакцины СТИ-ПР, изучение m vino устойчивости сибиреязвенных культур к антибиотикам Второй этап включает изучение in vivo иммуногенных свойств различных серий вакцины по двум дозам заражения типичным тест-заражшощнм штаммом В. anthracis 81/1 и по индексу иммунитета.

Был подобран наиболее оптимальный состав среды СОПЭК. Для отбора клеточных популяций на этой среде брали 2, 10, II. 17 экспериментальные серии вакцины СТИ-ПР и I, 2 производственные серии. Все они, но способности обраэонывать токсин и давать по две линии преципитации оказались однородными, Различия заключались в разнице расстояний от края колоний до линий преципитации. В результате было отобрано 9 клеточных генераций из различных серий вакцины СТИ-ПР, у которых линии преципитации находились на большем расстоянии от края колонии.

Спорообразование у отобранных культур достигало 90−95% к 5 сут инкубации, что характерно для всех сибиреязвенных штаммов Как ухазываст Буравцева Н, П. (1991 важным моментом для сохранения резистентности к антибиотикам является спорообраюванне Отбор клеточных генераций с полноценным спорообразованием является гарантией для их длительного хранения без изменения исходных свойств.

На разных этапах работы нами проверялась такая важная характеристика вакцины СТИ-ПР как устойчивость к антибиотикам При определении чувствительности к цефачоегюринам мы исходили ш данных, полученных ранее Буравиевой Н П. с соавт (2001), что к некоторым нефалоспорннам (исфотакснму, цефтачнлнму, нефтрнаксону, исфуроксиму) микроб сибирской язвы устойчив Было интересно сравнить устойчивость к этим антибиотикам типичных вирулентных нггаммов и клеточных популяций, полученных из вакцнны СТИ-ПР Оказалось, что чувствительность к цсфалоспоринам у выделенных клеточных популяций и вакцины СТИ-ПР была аналогичной таковой у типичных штаммов сибиреязвенного микроба, за исключением цсфтриакссиа, цефотаксима и цсфурокснма, к которым выявлена тенденция к снижению чувствительности по сравнению с вирулентными штаммами.

С учетом результатов реакции нммуноднффузин на среде СОПЭК, фенотипнческнх и генетических свойств, устойчивости к антибиотикам, полноты спорообразования и концентрации жизнеспособных спор, выращенных hi клеточных популяций различных серий вакцнны СТИ-ПР для дальнейшей работы мы отобрали четыре клеточные популяции: две из 10 экспериментальной серии, одну — из 17 экспериментальной серии н одну — из I производственной серии вакцины СТИ-ПР.

В условиях in vivo изучена их нммуногенность Для этого нами разработан метод определения нммуногенпости живых сибиреязвенных вакцин по результатам заражения вакцинированных морских свинок двумя дозами типичного тест-заражающего вирулентного сибиреязвенного штамма 81/1 (Методические рекомендации «Определение иммуногсиностн живых сибиреязвенных вакцин по двум дозам тссг-заражаюшсго вирулентного штамма», 2004).

С использованием этого метода поставлены эксперименты по определению нммуногенных свойств отобранных чегырех клеточных гюпулвиий № 1 н № 2 из 10 экспериментальной серии, Лз 5 — из I экспериментально-производственной серии, № 9 — ю 17 экспериментальной серии Наилучшие иммуногенныс свойства были выявлены у животных, вакцинированных клеточными популяциями X" I № 2 и № 5 При заражении морских свинок, иммунизированных клеточными популяциями Nt 1, Hi 2, № 5 в дозе 10 Ш" выжито по (00% животных, в ipynnc, иммунизированной I производственной серией вакцины СТИ-ПР — 40% морских евннок. Иммунизация животных клеточной популяцией № 1 защитила 40% морских евннок от последующего заражения В. anihracis 81/1 в дозе 100 LDso, клеточной генерацией № 2 — 80%, Ns 3 — 90%, 1 пронзводстветюй сериейвсего 20% животных.

Таким образом, для полного н всестороннего изучения выделенных клеточных популяций с целью их дальнейшего использования в качестве маточных культур для приготовления новых серий вакцины СТИ-ПР необходимо придерживаться общих критериев оценки нх свойств: феногнпнческие н генетические свойства должны соответствовать требованиям, предложенным в методических указаниях «'.Основные требования оценки вакцинных штаммов сибиреязвенного микроба для иммунизации людей» (2002), наличие 2 четких линии кммунопрегшпнтацин (первая линия должна быть удалена от края колонии не менее чем на 2 мм, вторая на — 4 мм): образование 90% спор к 4 сут роста на агаре Гладстона-Фнлдса, наличие не менее 50% жизнеспособных спор, выявляемых методом высева на агаровые пластинки, у стойчивость к пенициллину не менее 10 ООО- 5 000 мкг/мл, к рифампишшу — не ниже 250 ел/мл, выживаемость более 50% иммунизированных животных от заражения дозой 10 DCL (Р 10s) спор и менее 50% от дозы 100 DCL (1−10*) спор

Исходя in вышеперечисленных критериев, мы отобрали клеточные популяции, иг которых было приготовлено 7 новых экспериментально-производственных серий вакцины СТИ-ПР. После лнофнльного высушивания во всех сериях вакцины исследовали культурально-морфологнческне свойства, концентрацию жизнеспособных спор, специфическую стерильность препарата, сохранение резистентности вакцины к антибиотикам.

Безвредность определяли у двух вновь полученных экспернментально-пронзйодствснных серий вакцины — № 20 и № 25 Критериями для отбора именно этих серий явились высокая иммуногенность исходных клеточных генераций, типичная морфология роста на твердых и жидких питательных средах, высокая устойчивость к антибиотикам, достаточная концентрация жизнеспособных спор в ампуле (до 510* спор/мл). Объектом исследования служили морские свинки и кролики.

Все (вменения, наблюдаемые нами у вакцинированных животных, соответствовали требованиям методических указаний «Основные требования оценки вакцинных штаммов сибиреязвенного микроба дня иммунизации людей» (2002). На основании полученных данных установлено, что 20 н 25 экспериментально-производственные серии вакцины мало рсактогенны и безвредны для морских свинок н кроликов.

Иммуногенность этих же серий вакцины определяли в экспериментах на морских евннках по ИИ. Результаты заражения животных показали, что иммуногенность 25 серии вакпнны СТИ-ПР была в 4 раза выше иммунопенности 20 серии и в 1,5 раза выше чем у коммерческой вакцины СТИ (р<0,05),.

Одной нз задач наших исследований явилось изучение возможности повышения эффективности иммунопрофилактики сибирской язвы путем сочетанного введения вакшшы СТИ-ПР с иммуномолулятором ликопидом. Ликоннд (333 мкг/кг) вводили в одном шнрнце с 25 серией вакцины СТИ-ПР в субнммунизирующсй дозе (МО6) стюр, что способствовало увеличению ИИ в 2 раза (р<0,05) по сравнению с животными, иммунизированными одной вакциной СТИ-Г1Р и в 3 раза по сравнению с вакшшой СТИ (р<0,05).

Особо следует отмстить, что лнкопнд. вводимый самостоятельно однократно за 21 сут до заражения позволил повысить ИИ в 5 раз (р<0,05) по сравнению с интактнымн животными из группы контрольного заражения.

Пол действием данного иммуномодулятора происходило более активное распространение вакцинного штамма в организме морских свинок, сто более длительное пребывание и более длительное выделение из печени, что косвенно свидетельствует о более выраженной нммуиоморфологнческой перестройке в организме морских свинок по сравнению с группой, получавшей только вакцину.

По мнению ряда ученых неспецифические реакции в организме, развивающиеся в ответ на введение вакцины, являются юн платформой, на которой в дальнейшем формируются специфические реакции (Покровский В.И., 1983, Bypiacoa ГШ., Румянцев С. П., 1985). Это побудило нас ислсдоватъ специфические и неспецифические реакции макроорганнзма для оценки формирования иммунитета к сибирской язве при сочетанном введении вакцины СТИ-ПР с ликопидом.

В результате выполненных исследований установлено, что лнколнд в той же степени что и вакцина СТИ-ПР, способствовал активизации интралейкоцнгарной кнелородзавненмой системы ПЯЛ повышал функцию оксидаэ, ответственных за восстановление кислорода в аннон супероксида и обладающих при этом большей бактсрнцндностъю У животных, иммунизированных вакциной СТИ-ПР с ликопидом, наблюдалась тенденция к значительно большему количеству формазан-положитсльных клеток, выявляемых в нндуцнрованном НСТ-тссте по сравнению с морскими свинками, получавшими одну вакцину Наши результаты оказались аналогичны данным, полученным при сочетанном применении вакцины СТИ с ликопидом (КоготковаО И с соавт, 2004).

Кроме того, нами отмечено статистически достоверное снижение содержания дизоцнма в сыворотке крови с фонового уровня, составившего 4,4×0,5 мхг/мл до 2.1 ±0,2 мкг/мл (р<0,05) на 14 сут после иммунизации морских свинок одной вакциной В то же время в группе животных, получавших наряду с вакциной иммуномодулятор. данный показатель имел тенденцию к понижению (р>0,05).

К 21 сут после иммунизации в обеих группах зарегистрировано достоверное возрастание уровня лнзоцнма в сыворотке крови морских свинок. В этот' срок в lpynnc животных, иммунизированных вакциной СТИ-ПР с лнколидом. ошечена тенденция к большему повышению лнзоцима в сыворотке крови, но сравнению с морскими свинками, не поручавшими иммуномодулятор

Прн анализе специфического ангителообраэовання в сыворотке крови на 14 сут после иммунизации под действием ликоннда выявлена тенденция к более высокому уровню антител в сыворотке крови.

Ликопнд оказал существенное действие на клеточное звено гсротивоенбнреязвенного иммунитета, увеличив на 40% количество животных, положительно реагирующих в кожио-аллсргической пробе с сибиреязвенным аллергеном, по сравнению с морскими свинками, иммунизированными одной вакциной.

Таким образом, экспериментально доказано наличие иммуностимулирующего действия ликопнда, вводимого морским свинкам и подтверждена существенная роль клеточных факторов, в частности гнперчувствнтельности замедленного типа, в формировании специфического протнвоенбнреязвенного иммунитета, индуцируемого живой вакциной.

Нами изучено действие ликопнда при одновременном проведении иммунопрофилактики сибирской язвы вакциной СТИ-ПР н антибнотикотерапин рифам]шинном или ампициллином.

При совместном использовании антибиотиков и вакцины СТИ-ПР рнфампинина ИИ у морсхнх свинок увеличился в 2 рала, имннщшшш — в 9 раз, но сравнению с одной вакциной (р<0,05).

При сочетанием введении вакцины СТИ-ПР с ампициллином и л икон ню v нами не выявлены иммуностимулирующие свойства последнею (р>0,05) — Сочетанное применение вакцины СТИ-ПР с лнкопидом и рнфаминцином способствовало возрастанию ИИ в 3,7 раз, вакцины СТИ-ПР и лнкопнда в 1,8 раю, по сравнению с контрольными группами (р<0,05).

Таким образом, материалы исследований, представленные в данной работе, существенно дополняют и расширяют сведения об основных биологических свойствах живой сибиреязвенной штгибнотнкорезисгектгной вакцины СТИ-ПР, о стабильности их сохранения в процессе д/нгтельного хранения (срок наблюдения 25 дет), о возможности повышения ее нммуногенностн под действием ликопида, о значительном протсктнвном эффекте данного нммуномодулятора при одновременном проведении иммунопрофшактики вакциной СТИ-ПР н ашибнотнхотерапнн рнфаминцином Дальнейшее изучение основных биологических свойств вакцины СТИ-ПР в процессе длительного хранения, а также разработка огггнмальных схем иммунопрофилактики сибирской язвы вакциной СТИ-ПР в сочетании с антнбнотнкотсрапнсй и введением ликопида, на наш взгляд, являются перспективными направлениями научных исследований с целью их последующего внедрения в практическое здравоохранение.