Механизм ингибирования уридинфосфорилазы из Salmonella typhimurium (stuph) и homo sapiens (huphi) 2, 2`-ангидроуридином по результатам рентгеноструктурного анализа и компьютерного моделирования

Множество лекарственных препаратов, используемых в настоящее время, взаимодействует с белками-ферментами. Это относится как к непосредственному механизму действия препарата (фармакокинетика), так и к превращению и разрушению лекарственных средств в организме и в очаге патологического процесса (фармакодинамика). Модулируя активность белков-ферментов, можно повысить эффективность лечения и снизить побочные эффекты. Одним из таких интересных с фармакологической точки зрения, белков является уридинфосфорилаза.

Уридинфосфорилаза (УФазаUPhЕ.С. 2.4.2.3) с участием иона фосфата катализирует реакцию превращения уридина в урацил [1]. Фермент участвует в ре-синтезе пиримидиновых оснований. Уридинфосфорилаза как объект исследования представляет интерес для многих областей медицины. Этот фермент играет решающую роль в так называемом быстром клиренсе, то есть выведении из организма избытков плазменного уридина. Внутривенное введение частично очищенной бактериальной уридинфосфорилазы приводит к быстрому фосфоролизу уридина плазмы и ингибированию активности «реутилизационного» пути на 65−92% [2].

В организме человека уридинфосфорилаза принимает участие в метаболизме противоопухолевых препаратов — антиметаболитов пиримидинов, которые, несмотря на высокую токсичность, остаются основным средством химиотерапии некоторых видов опухолей, например, плоскоклеточного рака прямой кишки [3]. Противоопухолевый препарат 5-фторурацил (5ФУ) является антиметаболитом урацила из-за конкуренции за тимидилатсинтетазу. В результате действия 5ФУ нарушается синтез нуклеиновых кислот и достигается остановка пролиферации и/или гибель опухолевых клеток. 5ФУ — важнейший компонент современной химиотерапии — успешно применяется при раке толстой кишки, молочной железы, органов пищеварения, мочеполовой системы, а также при опухолях кожи. M. Iigo и соавт. [4] показали, что ингибиторы уридинфосфорилазы способствуют увеличению активности 5ФУ при химиотерапии индуцированного рака молочной железы у мышей линии BDFj и трансплантатов плоскоклеточного рака толстой кишки человека у безтимусных мышей. В опытах на мышах линии CD8Fi установлено, что введение ингибитора уридинфосфорилазы — бензилациклоуридина (BAU) (240 мг/кг) позволило уменьшить дозу 5ФУ в 1.5 раза при той же терапевтической эффективности [5]. Тем самым показана возможность изменения активности 5ФУ специфическими ингибиторами уридинфосфорилазы с целью снижения токсичности основного препарата.

Перспективным является применение ингибиторов уридинфосфорилаз не только для борьбы с онкологическими заболеваниями, но и с некоторыми инфекционными, вызванными бактериями и простейшими, так как ре-синтез уридина, протекающий преимущественно с участием уридинфосфорилазы и урацилфосфорибозилтрансферазы, чрезвычайно важен для жизнедеятельности микроорганизмов. Роль УФазы в обмене уридина у высших организмов менее значима, чем для микроорганизмов, так как большая часть пиримидиновых оснований в клетках высших организмов синтезируется де ново, и только значительно меньшая синтезируется путем ресинтеза [6]. Клетки же многих микроорганизмов лишены тимидинфосфоралазной активности, и именно уридинфосфорилаза катализирует в них фосфоролиз как рибо-, так и дезоксирибопиримидин нуклеозидов. Инактивация фермента-хозяина не будет столь существенна для высших организмов в целом, как инактивация единственного фермента для паразита. Ингибирование УФазы, как показали опыты in vivo, летально для некоторых паразитов (например, Giardia lamblia, Schistosoma mansoni), являющихся возбудителями заболеваний человека [7−9]. Основой создания новых антипаразитических препаратов и антибиотиков могут быть структуры атомного разрешения комплексов ферментов-мишеней прокариот и высших организмов с низкомолекулярными химическими соединениями (лекарство).

Однако нерациональное применение ингибиторов фосфорилаз, особенно с недостаточно высокой тканеспецифичностью, может вызвать осложнения. Исследования на смешанной культуре клеток астроцитов с нейронами и на реперфузированном мозге показали, что уридин защищает клетки от гибели. Степень повреждения клеток в этих опытах контролировали как морфологически, так и по активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) — маркера клеточного повреждения при ишемии. Кроме того, этой группой исследователей показано, что в протекторном (защитном) действии уридина принимает участие уридинфосфорилаза нейронов и астроцитов. Для выяснения роли уридинфосфорилазы в защитном действии уридина было определено, насколько блокирование УФазы влияет на протекторный эффект уридина в ишемизированных нейронах [10]. Таким образом, ингибирование уридинфосфорилазы в клетках мозга (нейронах и клетках астроцитарной нейроглии) и кардиомиоцитах может ухудшить состояние тканей при ишемии. Однако, по-видимому, существует способ снижения негативных последствий приема ингибиторов уридинфосфорилаз путем конструирования ингибиторов, не способных проникать через гистогематические барьеры, в частности, гемато-энцефалический барьер.

Коиш М.Н. с соавторами показал, что соединения класса 2,2'-ангидроуридинов являются эффективными ингибиторами для большинства уридинфосфорилаз клеток бактерий и простейших [11, 12]. В связи с этим, из широкого класса ингибиторов УФазы был выбран ингибитор — 2,2'-ангидроуридин.

Разработка новых лекарственных препаратов-ингибиторов ферментативной активности невозможна без понимания механизма ингибирования на атомно-молекулярном уровне. Под механизмом ингибирования мы понимаем структурно-функциональные особенности взаимодействия фермент-ингибитор, такие как структура сайтов связывания ингибитора, характер взаимодействий атомов ингибитора с атомами фермента, структурно-функциональные изменения, происходящие при образовании комплекса фермент-ингибитор. Для этого необходимо детальное исследование пространственной организации макромолекулярных комплексов уридинфосфорилаз бактерий и высших организмов методами рентгеноструктурного анализа при атомном разрешении и компьютерного моделирования. На основании результатов этих исследований можно предложить структурно-функциональный аспект механизма ингибирования данного белка-мишени, что, в свою очередь, позволяет конструировать химические соединения-ингибиторы, более комплиментарные сайтам связывания ферментов и, возможно, более эффективные в качестве лекарственного препарата.

Целью данной работы было изучение пространственной организации молекулы уридинфосфорилазы из Salmonella typhimurium (AUPh) и уридинфосфорилазы человека (ЯСРЫ) в комплексах с разными лигандами и установление структурной основы ингибирования этих уридинфосфорилаз 2,2'-ангидроуридином (ANU) методом рентгеноструктурного анализа. Компьютерное моделирование оптимальных ингибиторов (аналогов 2,2'-ангидроуридина) уридинфосфорилазы человека и бактерий.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

• определение атомных структур комплексов iS/UPh с 2,2'-ангидроуридином, ионом фосфата и калия методом рентгеноструктурного анализа биомакромолекул;

• решение структуры комплекса 7/UPhI с 2,2'-ангидроуридином методом молекулярного моделирования;

• анализ структур комплекса «фермент-ингибитор» для /TUPhl и StUPh;

• молекулярно-динамическое исследование iiUPhl и «SVUPh;

• компьютерное конструирование потенциальных ингибиторов уридинфосфорилаз.

Выводы.

• Методом рентгеноструктурного анализа впервые решены и уточнены с высокой достовернотью пространственные структуры атомного разрешения следующих биомакромолекул:

— комплекса ЛиРЬ с 2,2'-ангидроуридином (ингибитором уридинфосфорилазы — модулятором активности химиотерапевтических препаратов) и ионом калия (эффектором уридинфосфорилазы) при разрешении 2.38 А (Ягасюг = 20.80%- К^е = 25.80%, БР1= 0.267 А, Я.М.8.Б. = 0.007 А для длин связей и К.М.З.Б. = 1.154° для валентных углов- 99.5% аминокислотных остатков находятся в наиболее благоприятных и разрешённых областях статистики Рамачандрана;

— комплекса ^/иРЬ с 2,2'-ангидроуридином и ионом фосфата (субстратом уридинфосфорилазы) при разрешении 2.11 А (Красин- = 18.10%, Я&ес = 21.90%, БР1= 0.168 А, Я.М.8.Б. = 0.007 А для длин связей и К.М.8.Б. = 1.499° для валентных углов- 99.7% аминокислотных остатков находятся в наиболее благоприятных и разрешённых областях статистики Рамачандрана;

— комплекса 5ШР11 с 2,2'-ангидроуридином, ионами фосфата и калия при разрешении 1.86 А (Я^ = 17.60%, Я&ее = 20.60%, БР1= 0.132 А, Я.М.8.Б. = 0.007 А длин связей и Я.М.8.Б. = 1.066° для валентных углов- 99.5% аминокислотных остатков в наиболее благоприятных и разрешённых областях статистики Рамачандрана;

— нелигандированной уридинфосфорилазы 5*. ¿-уркутигшт при разрешении 1.80 А (Я^ = 16.08%- 11^=20.01%- БР1= 0.115 АЯ.М.8Х>= 0.006 А для длин связей и Я.М.8.Б.= 1.042° для валентных углов- 99.7% аминокислотных остатков в наиболее благоприятных и разрешённых областях статистики Рамачандрана;

— комплекса Л11РЬ с ионом фосфата при разрешении 1.5 А (Б^асюг = 16.60%, К&ее = 21.20%, БР1= 0.098 А, Я-М-БЛ). = 0.007 А длин связей и Я. М^.О. = 1.094° для валентных углов- 99.5% аминокислотных остатков в наиболее благоприятных и разрешённых областях статистики Рамачандрана. Координаты атомов пространственных структур вышеприведённых пяти макромолекулярных соединений и соответствующие им наборы экспериментальных модулей структурных факторов депонированы в международный банк белковых структур (РОВ). Им присвоены следующие идентификационные номера ГО РБВ: ЗБРБ, ЗС74, тЛ, ЗОБО, ЗР? Р соответственно.

• Впервые выявлено место и характер связывания 2,2'-ангидроуридина с ЛиРЬ (ферментом-мишенью). Взаимодействия между ферментом и ингибитором осуществляются посредством водородных связей, ван-дер-ваальсовых контактов и стэкинг взаимодействий. На основании экспериментальных и литературных данных сделан вывод о том, что 2,2'-ангидроуридин является конкурентным ингибитором уридинфосфорилаз и его действие обратимо.

• Методом молекулярного докинга впервые определена структура комплекса уридинфосфорилазы человека с 2,2'-ангидроуридином и ионом фосфата. Четвертичной структурой указанного комплекса является гомодимер. Установлены аминокислотные остатки /ШРЫ, связывающие 2,2'-ангидроуридин. Показаны различия ферментов //ЫРЫ и ЛиРЬ в гидрофобной области сайта, связывающего гетероциклический компонент 2,2'-ангидроуридина. Механизм ингибирования /ГОРЫ и 5ШРЬ 2,2'-ангидроуридином аналогичен. Полученные данные можно использовать для рационального дизайна новых перспективных ингибиторов бактериальных и человеческих уридинфосфорилаз, являющихсяхимиотерапевтическими и противомикробными препаратами.. ' .

• Ме годом рентгепос груктурного анализа впервые показано, что г в ком п л ексеу ри ди н ф о с ф ор и л аз б*. ¡-уркуп г г тит с 2,2'-ангидроуридином и ионом фосфата состояниегактивногощентращредпочтительно чоакрытое"-, в то время как для' комплекса: только с 2,2'-ангидроуридином наблюдаются. как «закрытое" — так-и5"промежуточное» состояния., .

• Методом молекулярной динамики было установлена влияния иона калияна структурную стабилизацию молекулы бЖРК:. Особенно эти измененияприходятся на минокислотные остатки петли Е9 и начального участкач спирали" Н8. Отмечено?" увеличениеплотностиконтактов в-• области •• межсубъединич11 ого взаимодействия в ^ димерах, в присутствии иона1, калия. Методами молекулярной! динамикипоказано, 1 что петля Е9 активного центра ферментов 5ШР11 и //ЦРЫ меняет свою конформацию и положение в гтростанстве '.

В первые проведено конструирование т $Шсо молекулы высокоафинного ингибитора какдля //ИРЫ, так и для 6711РЬ на основе 2,2'-ангидроуридина. Они являются 5-замещенными!или 6-замещенными 2,2'-ангидроуридинами, где в качестве заместителявыступает короткая алифатическая насыщенная цепочка с ароматической группой на конце. Для 5-замещенных 2,2'-ангидроуридинов имеются* отличия? в предпочтительномтипе ароматической группы ингибитора //ЦРНГ: (пиридиновая, группа) и б'/иРИ (имидазольная группа), что объясняется различным аминокислотным окружением активного центра фосфорилаз из разных источников при высокой гомологии сайтов связывания-. Для 6-замещённых 2,2'-ангидроуридинов имеются лишь, отличия в длине углеводороднойщепочки высокоафинного заместителя.

Благодарности.

Автор выражает искреннюю признательность:

• сотрудникам группы A.M. Михайлова Лаборатории белковой кристаллографии Института кристаллографии им. A.B. Шубникова РАН — в.н.с., к.ф.-м.н. Н. Е. Жухлистовой, с.н.с., к.ф.-м.н. А. Г. Габдулхакову, к.б.н. Ю. С. Савочкиной, к.б.н. М. В. Донцовой, н.с., к.х.н. A.B. Ляшенко, к.х.н. Б. Ф. Павлюк, инж. Т. А. Серёгиной, инж. Ю. Н. Жуковой, инж. С. Е. Сотниченко и инж. И. И. Прокофьеву — за помощь и дружескую поддержку, которая в огромной степени способствовала исследованию пространственной организации биомакромолекулярных комплексов уридинфосфорилаз методом рентгеноструктурного анализа;

• коллективу лаборатории моделирования биомолекулярных систем Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН за помощь в компьютерном моделировании структуры биомакромолекул;

• д.б.н., профессору Миронову A.C., к.б.н. Савочкиной Ю. А. и к.б.н. Донцовой М. В. за предоставление препарата «SVUPh для кристаллизации;

• Серёгиной Т. А. и Донцовой М. В. за помощь при кристаллизации биомакромолекулярных комплексов;

• проф. X. Бетзелю (Christian Betzel, DEZY, Hamburg, Germany) и к.ф.-м.н. Г. С. Качаловой за предоставленную возможность работы на белковых станциях синхротрона DEZY (Hamburg, Germany);

• к.ф.-м.н. Габдулхакову А. Г за помощь в экспериментальной и расчетной частях исследования;

• к.ф.-м.н. Жухлистовой Н. Е. и д.м.н. Штилю A.A. за критическое обсуждение результатов работы;

• д.ф.-м.н., профессору Ефремову Р. Г. и к.ф.-м.н., доценту Михайлову A.M. за предложенную тему, руководство работой, неоценимую помощь и поддержку.

1У.8.

Заключение

.

1) Основной эффект ингибирования уридинфосфорилазы 2,2'-ангидроуридином заключается в установлении связей 2,2'-ангидроуридина с аминокислотными остатками нуклеозид-связывающего сайта активного центра S/UPh. Как показано нами выше, определяющую роль в связывании 2,2'-ангидроуридина, так же как и субстратов, играет связь с рибозным компонентом ингибитора, который располагается в активном центре. Остатки Thr94/B, His8/D, Glul98/B (рис. 12, 22) образуют водородные связи с атомами ингибитора, аналогичные связям с рибозным компонентом уридина. Кроме того, в связывании 2,2'-ангидроуридина принимает участие Argl66/B, образуя контакт с атомом 04 рассматриваемого ингибитора.

Glu198/B.

Рисунок 22. Сравнение положения 2,2'-ангидроуридина (оранжевый) и уридина (красный) по отношению к ключевым остаткам нуклеозид-связывающего сайта активного центра Л11РЬ. Сплошными линиями показаны водородные связи.

В случае с уридином остатки С1п166/5/11РЬ и А¹⁶⁸/ЛиР11 в акте ферментативной реакции стабилизируют обмен электронами между атомом.

04'-рибозы и атомами пиримидинового кольца. В результате ион оксокарбения стабилизируется отрицательно заряженным ионом фосфата. Ион фосфата связывается на а-стороне рибозного кольца, где его расположение позволяет участвовать в 8>Д нуклеофильной атаке С1'- позиции [191].

По сравнению с уридином, в случае связывания 2,2'-ангидроуридина Ы-гликозидная связь остается стабильной как за счет фиксации пиримидинового кольца в син-положении атомом 02, так и за счет иного, чем в случае с субстратами уридинфосфорилазы, взаимного расположения урацильного кольца и остатков в1и168 и А¹⁶⁶ (рис. 20).

Следует учитывать и то, что молекула 2,2'-ангидроуридина имеет меньше вращательных степеней свободы, чем уридин. Меньшее число степеней свободы приводит к уменьшению энтропийной составляющей свободной энергии комплекса фермент-ингибитор. При практически неизменной энтальпии комплексов, определяемой связями фермент-ингибитор, эффект уменьшения энтропийной составляющей увеличивает «время жизни» и уменьшает вероятность распада комплекса фермент-ингибитор и вероятности его самопроизвольного распада.

Исходя из аналогичности пространственной организации активных центров 5>иРЬ и /ШРЫ, как было показано нами ранее, полагаем и идентичность ингибирования 2,2'-ангидроуридином этих уридинфосфорилаз.

2) Сгенерированы структуры соеденений — потенциальных лекарственных препаратов на основе высокоселективных ингибиторов уридинфосфорилаз. Они являются 5-замещенными или 6-замещенными 2,2'-ангидроуридинамы, где в качестве заместителя выступает короткая алифатическая насыщенная цепочка с ароматической группой на конце. Для 5-замещенных 2,2'-ангидроуридинов имеются отличия в предпочтительном типе ароматической группы ингибитора /ШРЫ (пиридиновая) и бШРИ (имидазольная группа), что объясняется различным аминокислотным окружением активного центра фосфорилаз из разных источников при высокой гомологии сайтов связывания. Для- 6-замещённых 2,2'-ангидроуридинов имеются лишь, отличия, в длине углеводородной цепочки оптимального заместителя.

IV.9. Перспективы.

Ввиду ухудшения экологической обстановки и изменения образаt жизни людей, проблема онкологических заболеваний в ближайшей-перспективе, будет острее, чем на данный момент. В то же время намечается тенденция адаптации новых злокачественных образований и микроорганизмов — паразитов человека — к лекарственным препаратам^ уже применяющимся в медицинской практике. Создание новых биологически активных соединений требует описания на-молекулярном уровне взаимодействий «лиганд-рецептор». Создание новых лекарственных препаратов, взаимодействующихс белками' обмена нуклеотидов, к которым относится уридинфосфорилаза, представляется автору перспективным направлением, молекулярной фармакологии.

Автором в работе исследованы структурные основы1 ингибирования уридинфосфорилаз бактерий и человека перспективнымпрепаратом 2,2'-ангидроуридином. 1 и сделан первый шаг на пути рационального конструирования препаратов нового поколения на основе 2,2'-ангидроуридина. В дальнейшем автор предполагает проведение экспериментального исследования физико-химических свойств новых соединений — ингибиторов уридинфосфорилаз1 различных эукариот и прокариот методами аналитической знзимологии и биохимии, а также исследования структурных особенностей взаимодействия новых соединений с уридинфосфорилазами методами рентгеноструктурного анализа. Представляется интересным всестороннее исследование биологических свойств новых ингибиторов на культурах клеток in vitro и доклинические испытания in vivo.