Морфологическая гетерогенность колоний Alcaligenes eutrophus и Photobacterium leiognathi: По данным электронной микроскопии

Вопросы гетерогенности бактериальных популяций довольно широко освещаются в литературе. Описание морфологической гетерогенности популяций чаще всего касается жидкой бактериальной культуры (Иванов, Угодчиков, 1984: Печуркин и др.1990; Милько, Егоров, 1991), лишь небольшая часть исследований посвящена изучению гетерогенности, возникающей в процессе роста и развития бактериальных колоний (Высоцкий и др., 1984; Бакулина, 1985; Бондаренко и др., 1987; Павлова и др., 1990; Mendelson, Salhi, 1996). Интерес к этой проблеме объясняется возможностью параллельно с изучением гетерогенности популяции исследовать фундаментальные аспекты роста и морфогенеза микроорганизмов (Shapiro, 1995). Микробную колонию следует рассматривать с разных точек зрения. Во-первых, это исходный посевной материал для микробиологических, генетических, биотехнологических целей. Во-вторых, колония это простейшее микробное сообщество, обладающее способностью к самоорганизации Исследование архитектоники колоний (совокупность данных об ультраструктуре клеток, их взаимодействии, ориентации и распределении в определенных областях колонии) предоставляет уникальную возможность комплексного изучения фундаментальных аспектов морфогенеза и роста бактериальных популяций. Наконец, колония является простейшим примером реализации генетической программы построения сообщества из одной клетки на твердой поверхности.

В настоящее время наблюдается явный разрыв между данными о гетерогенности бактериальной популяции и интерпретацией экспериментальных результатов по изучению структуры колонии. Так, цитоморфологическое разнообразие популяций признается закономерным и определяющим высокую выживаемость вида в меняющихся условиях среды обитания (Бакулина, 1985; Высоцкий и др., 1985; Новик, Высоцкий, 1996; Shapiro, 1995). Однако вопросы структурной организации и формирования колоний, условия расщепления исходных бактериальных популяций на варианты с различными свойствами остаются недостаточно исследованными.

Электронно-микроскопическое изучение колоний позволяет наглядно продемонстрировать ультраструктурное разнообразие и дифференцировку бактерий в процессе роста, их локализацию и ориентацию в биомассе колонии, различные способы взаимодействия клеток, что дает возможность составить представление о гетерогенности на популяционном и клеточном уровнях.

Электронно-микроскопическое исследование бактериальной хромосомы дает представление о гетерогенности на субклеточном уровне. Использование бактерий различных таксономических групп в качестве простого и легкодоступного объекта исследований важно для понимания процессов изменчивости микроорганизмов в постоянно меняющихся условиях обитания и их роли в эволюции прокариот.

Актуальность проблемы.

Морфология колоний является одним из важных таксономических признаков, широко используемых в микробиологии. Этот признак можно рассматривать как некую наследственную морфогенетическую структуру на поверхности агара, являющуюся потомством одной клетки, размножающейся простым делением. Долгое время считалось, что все 106−108 клеток, составляющих колонию, одинаковы, однако в последние годы получены данные, свидетельствующие о наличии в колонии нескольких субпопуляций, различающихся по морфологическим и физиологическим признакам (Бакулина, 1985; Shapiro, 1995). Предположительно гетерогенность в колонии возникает вследствие градиента питательных веществ и продуктов метаболизма в разных ее участках (Криг, Герхардт, 1983; Шлегель, 1987; Wimpenny, 1989). Интерес к данным проблемам не ослабевает, что вызвано различными задачами микробиологической практики и биотехнологии, а также имеет и чисто теоретический аспект.

Для решения вопросов гетерогенности микробных колоний в принципе применимы разные подходы, начиная от классических микробиологических, генетических и кончая управляемым культивированием и математическим моделированием популяции (Перт, 1978; Печуркин и др. 1990; Милько, Егоров, 1991; Белова и др. 1995; Брильков, 1996; Shapiro, Higgins, 1989). В их числе находятся и физические методы исследования биообъектов, среди которых подавляющим преимуществом обладает электронная микроскопия. Разнообразные методы электронной микроскопии позволяют оценить гетерогенность с позиций клеточной биологии, биохимии, генетики и биофизики (Шапиро, 1988; Лихошвай, Христолюбова, 1988), т. е. одновременно наглядно продемонстрировать гетерогенность на субклеточном, клеточном и популяционном уровне.

Известные к настоящему времени данные об ультраструктурной организации бактериальных колоний свидетельствуют в пользу представления о колонии как многокомпонентной, но определенным образом организованной на твердой поверхности структуре и даже «многоклеточном» организме (Бакулина 1985; Shapiro, 1988,1995; Shapiro, Higgins, 1989). Этот аспект является важным для понимания физиолого-биохимической, генетической активности колонии или любой бактериальной популяции на поверхности. С другой стороны, показателем активности генома, а, следовательно, и популяции в целом, является уровень организации хромосомы. В области исследования структурной организации хромосом эукариот достигнуты значительные успехи, прокариоты же в этом плане изучены недостаточно. Небольшие размеры бактериальных клеток и, соответственно, ДНК не позволяют изучать их на уровне светового микроскопа. Всестороннее рассмотрение структурной организации бактериального хроматина, а также цитоморфологических характеристик отдельных субпопуляций колоний стало возможным только с привлечением электронно-микроскопических методов.

Изучение бактериальной нуклеоплазмы, в частности, морфологическими методами приобретает значимость не только в изучении ДНК различных таксономических групп прокариот, но и в связи с исследованием геномов митохондрий и хлоропластов эукариот, имеющих свою белоксинтезирующую систему, подобную бактериальной. Кроме того, бактерии предоставляют уникальную возможность исследования ДНК, находящуюся в неактивном состоянии длительное время (ДНК спор) и готовую начать метаболизировать в течение нескольких минут при наличии подходящих условий окружающей среды.

Актуальность и необходимость изучения А1са^епез еМгоркт 21 и Рко^Ьас1егшт eiognathi шт. 54 объясняется их практической значимостью на современном этапе развития науки и производства. Исследованные светящиеся бактерии являются потенциальным источником люциферазы, используемой для биолюминесцентного анализа. Водородокисляющие бактерии являются модельным объектом изучения автотрофии микроорганизмов, потенциальным продуцентом белка одноклеточных и полимера поли-(3-оксимасляной кислоты.

Цель и задачи исследования

Цель исследования заключалась в развитии представлений о структуре и гетерогенности бактериальных колоний на примере водородокисляющих А1са^епез еъйгоркш 21 и светящихся бактерий РкоЮЬаМегшт 1ею^шМ шт. 54, возможности использования полученных морфологических характеристик как управляемых параметров популяции. В конкретные задачи работы входило:

1. Развитие метода приготовления целых бактериальных колоний для электронно-микроскопических исследований светящихся и водородокисляющих бактерий.

2. Оценка влияния физико-химических факторов среды на морфологические характеристики клеток и их пространственную локализацию в объеме колоний вариантов Р.1ею§ па1:Ы шт.54 и А. еийгорЬш шг.2.

3. Сравнительный анализ архитектоники колоний как параметра, характеризующего штамм, вид, род и т. д.

4. Определение роли метаболической активности клетки, действия декомпактизующих ДНК факторов, Ни белка в гетерогенности бактериального хроматина.

Научная новизна работы и практическое значение. Настоящая работа является комплексным исследованием, в результате которого получены новые данные и сформированы новые представления о цитоморфологической гетерогенности популяций и структурной организации бактериальной колонии, зависимости фенотипических характеристик от факторов среды. Результаты работы являются существенным продвижением в развитии представлений о временной и пространственной организиции биологических систем, в частности, принципов самоорганизации бактериальных колоний как сообщества на твердой поверхности.

Впервые на примере А. еийорЬиз Ъ и Р.1ею§ па1:Ы 54 проведено исследование архитектоники бактериальных колоний с применением метода, позволяющего сохранять целостность колонии. При анализе панорамных (обзорных) снимков больших участков колоний, полученных с помощью просвечивающего электронного микроскопа, получены принципиально новые данные о существовании морфологически гетерогенных субпопуляций бактерий в составе одной колонии и их определенной пространственной локализации.

Впервые изучено тонкое строение микроорганизмов в колониях диссоциантов водородокисляющих и светящихся бактерий. По ультраструктурной организации идентифицированы определенные морфотипы данных бактерий. Показано, что морфологические признаки колоний определяются сочетанием составляющих ее морфотипов клеток.

Исследование структуры нуклеоида водородокисляющих бактерий показало необычайно высокую степень компактизации хроматина, стабильность обнаруженных уровней упаковки на препаратах выделенной ДНК. Результаты исследования степени компактизации бактериальной хромосомы водородокисляющих бактерий расширяют аналогии в структурной организации геномов прои эукариот, подтверждают представления о зависимости структурной организации хроматина от физиологического состояния бактериальной клетки.

Впервые проведенная для A. eutrophus Z1 и P. leiognathi 54 на электронно-микроскопическом уровне иммуноцитохимическая локализация гистоноподобного белка HU на хроматине бактерий in situ свидетельствует об участии данного белка в организации вторичной структуры бактериальной ДНК.

Полученные результаты о фенотипических характеристиках популяций водородокисляющих и светящихся бактерий, о функциональной активности генома могут найти приложение в изучении микробного разнообразия, экологии микроорганизмов, в изучении динамики структуры популяции, механизмов действия на нее внешних факторов. Отсюда вытекает возможность прогнозировать изменение состава популяции и тем самым управлять ею. Кроме того, полученные результаты могут иметь практическое значение при создании штаммов-продуцентов биологически активных и ценных веществ, получении тестовых систем на основе бактерий.

Положения, выносимые на защиту.

1. Колонии светящихся и водородокисляющих бактерий являются неоднородными по структуре составляющих их клеток. По мере развития колонии идет дифференцировка клеток по определенной программе.

2. Архитектоника колоний повторяема, т. е. наследственно закреплена.

3. Структурная организация хроматина водородокисляющих бактерий характеризуется высокой степенью компактизации и стабильностью выделенных уровней при различном метаболическом состоянии клетки.

4. Гистоноподобный белок HU участвует в поддержании нуклеосомоподобного уровня организации ДНК (на примере A. eutrophus Z1 и P. leiognathi шт.208).

Апробация работы.

Материалы исследований были доложены на Всесоюзной конференции «Структурно-функциональная организация клеток микроорганизмов» (Пущино, 1987), XIII Всесоюзной конференции по электронной микроскопии (Звенигород, 1988), заседании Красноярского отделения Всесоюзного микробиологического общества (Красноярск, 1987), заседании Московского отделения Всесоюзного микробиологического общества (Москва, 1990), Всесоюзной школе «Электронная микроскопия в биологии и медицине «(Звенигород, 1990), Всесоюзной конференции «Биотехнология и биофизика микробных популяций» (Алма-Ата, 1991), Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы» (Пермь, 1996), конференции «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 1996), VIII Европейском конгрессе по биотехнологии (Будапешт, 1997).

Структура и объем работы.

В первой главе анализируются литературные данные по данной проблеме. В главе 2 описываются материалы и используемые методы. Главы 3, 4, 5 посвящены изложению и обсуждению полученных результатов. Глава 6 -заключение и выводы. Работа изложена на 128 стр., включает 7 таблиц, 36 иллюстраций. Список цитируемой литературы содержит 141 наименование, из них 65 зарубежных.

выводы.

1. Метод приготовления целых бактериальных колоний адаптирован для электронно-микроскопического исследования колоний А. еиТторЬш Ъ и РЛею^аЙи шт.54. Это позволило повысить информативную ценность ультратонких срезов большой площади при изучении архитектоники колоний и гетерогенности популяций.

2. Показано, что популяции Би Явариантов колоний А. еи^орЬиБ вне зависимости от факторов внешней среды, являются бинарными и отличаются по ультраструктуре составляющих клеток.

3. Впервые идентифицировано 8 типов клеток, в различных сочетаниях составляющих колонии 8- и Явариантов РЛе^паЙи шт.54. Обнаружено, что структура колоний определяется составляющими ее субпопуляциями бактерий. При этом установлено, что степень гетерогенности колонии возрастает при увеличении интенсивности биолюминесценции.

4. Показано, что колонии РЛе^паЙи шт.54 и А. еШгорЬш Ъ являются пространственно гетерогенными, о чем свидетельствует зависимость между морфотипами и пространственными координатами объема колонии.

5. Выявлено, что на степень гетерогенности хроматина А. еШхорЬш Ъ оказывает влияние фаза и условия роста культуры. Обнаруженная высокая степень компактизации хромосомы может свидетельствовать о неактивном состоянии большей части ДНК данных микроорганизмов в исследуемых условиях.

6. Установлено, что гистоноподобный белок НИ локализован в компактизованных участках ДНК водородокисляющих и светящихся бактерий, что подтверждает его участие в поддержании компактного состояния хроматина прокариот.

ГЛАВА 6.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Анализ строения бактериальных колоний, изменение их архитектоники в процессе развития способствует более полному пониманию жизнедеятельности популяции. Наличие изогенных вариантов дает уникальную возможность исследования дифференциальной экспрессии генов, позволяя, в частности, наблюдать за развитием колоний, обладающими стойкими отличительными характеристиками.

Как в случае изучения водородокисляющих бактерий, так и в случае фотобактерий, в зависимости от условий культивирования исходная культура расщепляется на варианты. В классической микробиологии этот процесс называется диссоциацией и определяется плейотропными изменениями в геноме. Диссоциация объединяет два взаимосвязанных процесса: изменения в геноме и селекцию возникших мутантов. Диссоцианты всегда отличаются по таким интегральным показателям обмена как скорость роста, интенсивность дыхания. В микробиологической практике часто используют оба процесса, оптимизируя параметры культивирования для получения быстрорастущего или высокопродуктивного штамма (Милько, 1990).

В исследуемых видах светящихся и водородокисляющих бактерий Я-форма фигурировала как исходная. Это можно объяснить тем, что в предшествующие годы в культуре водородных бактерий отбирался вариант с высокой скоростью роста в автотрофных условиях и высоким содержанием белка, а у светящихся бактерий шел отбор по свечению и скорости роста. В результате в том и другом случае у исследователей оказался Я-вариант.

Анализируя цитоморфологические отличия вариантов светящихся бактерий и процесс формирования колоний, а также физиолого-биохимические характеристики вариантов и их взаимные переходы (Шендеров и др.1989; Луцкая и др., 1991), можно, например, предположить, что исходным в природных условиях являлся темновой вариант, при росте на твердых средах образующий колонии гладкого типа (S). Колонии темнового варианта 541 P. leiognathi состоят из одного типа клеток с гомогенной цитоплазмой и без включений (обозначенный ABC). Этот тип бактерий обнаруживается, наряду с другими, во всех выделенных вариантах. Кроме того, только такие клетки составляют молодые колонии (18 часов роста) наиболее гетерогенных по составу ярко светящихся вариантов 54 исх. и 54V, когда их (колонии) уже можно увидеть глазом, но они еще не светятся. Жидкая периодическая культура в начале экспоненциальной фазы также представлена клетками этого морфотипа. Можно предположить, что именно этот тип клеток является родоначальным и из него в последующем в процессе роста колонии дифференцируются другие типы, в определенном сочетании формирующие колонии всех выделенных вариантов. Если колония состоит только из клеток типа ABC, то она не светится. Процесс дифференцировки бактерий в колонии, по-видимому, идет быстро после 18 часов роста, так как суточные колонии у гетерогенных вариантов (54 исх. и 54-V) содержат практически весь набор клеток, и у некоторых колоний уже сформирована лизисная зона, состоящая из деградирующих форм клеток (клетки с признаком А') (табл.4). Чем больше интенсивность люминесценции варианта, тем больше лизисных клеток, локализованных в определенной части колонии. Первоначально колонии светящихся бактерий на твердой питательной среде описывались как гладкие, блестящие, прозрачные или полупрозрачные (Чумакова, Гительзон, 1975), и изначально в коллекции ИБСО P. leiognathi штамм 54 был гладким, а затем по свечению был отселектирован шероховатый вариант. Скорее всего, в естественной среде обитания преобладает гладкий вариант, о чем свидетельствуют описания колоний свежевыделенных светящихся бактерий (Nealson, Hastings, 1979). Видимо, темновой S-вариант, состоящий из «недифференцированных» клеток, имеет значение для сохранения и стабилизации вида, а Я-варианты, более дифференцированные по клеткам и ярко светящиеся, для расселения вида.

Процесс диссоциации, наблюдаемый в культуре А. еЩгорЬдз Ъ укладывается на первый взгляд в классическую схему — при действии неблагоприятных факторов существенно возросло имевшее место эпизодическое расщепление на варианты. Возникшие варианты отличались скоростью роста, устойчивостью к действию физико-химических факторов. Однако Б формы не давала реверсии в исходную форму или другие варианты. Оказалось, что Яи Бварианты представлены клетками, значительно различающимися по ультраструктуре. По сравнению со светящимися бактериями у А. еЩгорЬиБ Ъ не наблюдается одного морфотипа, который присутствовал бы во всех вариантах. Многочисленные работы, приводимые в литературном обзоре по диссоциации микроорганизмов, описывают, в лучшем случае, изменения в клеточной стенке, другие же ультраструктурные изменения, происходящие у вариантов, не упоминаются. Возможно, в результате расщепления возникли варианты, баланс скоростей образования которых значительно сдвинут в сторону Яформы. О генетических механизмах этого явления пока можно предполагать. Известно, что большую роль в диссоциативных переходах играют внехромосомные элементы. Действительно, в Я-варианте исследованного штамма присутствует плазмида размером близким к 100 кЬ, а Бвариант не содержит плазмиды (Капцова, 1991).

Полученные результаты исследований водородокисляющих и светящихся бактерий показывают, что колония является популяцией определенным образом организованных клеток. Повторяемость этой организации позволяет воссоздавать каждый раз внутреннюю однотипную структуру, что и проявляется на макроуровне как постоянство формы, плотности, цвета и других характеристик, которые служат таксономическими признаками при росте колоний на однотипных средах. Важную роль в постоянстве внутренней организации микробных колоний играют генетические факторы и физико-химические факторы окружающей среды. Возможно, что упорядоченность регулируется прямыми клеточными контактами, взаимодействием цитоскелетов клеток и образованным ими цитоскелетом колонии, где передача информации осуществляется через межклеточный матрикс. Последний участвует в поддержании целостности колонии, образуя упорядоченный пространственный остов (Springer, Roth, 1972; Stahl et al., 1983; Высоцкий и др., 1984; Новик, Высоцкий, 1995).

Следует подчеркнуть, что структура колоний светящихся бактерий соответствует существующим давно представлениям микробиологовактивная периферия и лизисный центр. А структура колоний водородокисляющих бактерий отличается — активно растущие клетки располагаются по всему объему колонии. Аналогичная картина была получена нами на колониях Rhodococcum rubropertinctus (Могильная и др., 1994). Колонии эрвиний содержали две зоны лизированных клеток, их локализация также не соответствовала классическим представлениям — в середине объема колонии и по верхней границе (Тикк, 1984). Привлекая имеющиеся литературные данные и собственные результаты исследования организации колоний представителей разных таксономических групп (P.leiognathi, P. phosphoreum, E. coli, Erwinia herbicola, A. eutrophus и R. rubropertinctus) можно сказать, что такой признак как наличие лизисной зоны с определенным местоположением является характеристикой штамма и не зависит от изученных факторов среды. Однако недостаточное количество экспериментальных работ по изучению организации бактериальных колоний не позволяет сделать подобный вывод на уровне вида, рода и далее (рис.36). штамм § вид род семейство.

Рис. 36. Наличие лизисных зон (заштрихованные участки) в колониях бактерий, принадлежащих к различным таксономическим группам.

Таким образом, изучение архитектоники колоний различных микроорганизмов необходимо для создания более полного представления о функционировании и морфогенезе бактериальных сообществ на твердой поверхности.

Обобщая наблюдения по архитектонике колоний и ультраструктуре бактерий Яи 8-вариантов А. еи^орИш Ъ, а также изогенных вариантов светящихся бактерий Р.1ею§ пайи 54 можно сказать, что полученные результаты согласуются с выводами Н. А. Бакулиной (1985), которая предположила, что существование субпопуляций в одной колонии является результатом того, что при образовании колоний уже на первых генерациях идет дифференциация дочерних клеток на клоны, обладающие дополнительными, отличительными от материнских, признаками, и обеспечивающими виду выживаемость. Наши исследования подтвердили, что архитектоника колоний закладывается первыми поколениями клеток. Кроме того, возникновение субпопуляций в определенное время развития колоний может говорить о том, что имеется пул недифференцированных особей, которые начинают функционировать при определенных условиях (накопление биомассы, накопление метаболитов). Повторяющаяся картина в строении колоний говорит о том, что их формирование и развитие является регулируемым наследственно закрепленным процессом.

Из полученных данных по изучению морфологической гетерогенности бактериальных колоний исследованных видов, действию на нее внешних факторов можно сделать следующие заключения, немаловажные для практического использования:

1. Варианты РЛею^аЙи 54, образующие колонии гладкого типа, являются более гомогенными по клеточному составу, поэтому для решения определенных задач использование их в качестве посевного материала более оправдано, поскольку можно создать определенный набор морфотипов клеток, меняя внешние факторы. Следует учитывать также, что в популяциях R-вариантов в большом количестве присутствуют лизисные формы. Для A. eutrophus ZI такое заключение сделать нельзя.

2. Варианты P. leiognathi 54 и A. eutrophus ZI, образующие колонии шероховатого типа из-за изменений в липидном составе клеточной стенки и, соответственно, ее проницаемости, более пригодны для создания коллекций штаммов с повышенной чувствительностью к различным классам токсичных веществ. Изменяя факторы среды (например, источник углерода), можно повысить чувствительность к токсичным веществам.

3. Управлять выходом продукта, например, люцифераз, можно задавая определенную структуру популяции (по клеточным морфотипам).

Гетерогенность популяции бактерий проявляется и на субклеточном уровне. Пространственная организация ДЕК в бактериальной клетке имеет важное значение в регуляции работы генов и регуляторных систем. Ориентация участков ДНК в пространстве относительно друг друга, их сближение или удаление влияет на взаимодействие белков, связывающихся с различными участками ДНК. Все исследования показывают, что бактериальная нуклеоплазма не является статичной, а очень динамична и значительно меняет свою форму в течение роста и активного метаболизма клетки (Robinow, Kellenberger, 1994).

В настоящей работе проведено комплексное изучение структурно-функциональной организации хроматина водородокисляющих бактерий на разных стадиях роста бульонной периодической культуры, а также культуры, растущей на твердой среде в виде колоний. Показано, что структура хроматина в большей степени определяется фазой роста и прочностью связей ДНК с белками. Кроме того, характер выделения и расправления ДНК из клеток может свидетельствовать о гетерогенности популяции бактерий. Полученные данные согласуются с результатами работ по исследованию организации ДНК в нуклеоиде других микроорганизмов: Bacillus licheniformis (Sloof et al., 1983), Streptomyces fradia (Киселева и др., 1988), E. coli (Лихошвай, 1988), что указывает на существование общих принципов упаковки ДНК в геноме прокариот, значительно различающихся по физиологическим и функциональным характеристикам. Следует отметить сохранение компактного (суперспирализованные ДНП-фибриллы, нуклеомерои нуклеосомоподобные глобулы, частицы типа хромомер эукариот), а значит и метаболически не активного, состояния большей части ДНК на всех стадиях жизненного цикла водородокисляющих бактерий. Такое состояние можно объяснить не только прочностью связей ДНК с белками, но и, возможно, узкой специализацией данных микроорганизмов. Это позволяет предположить, что в лабораторных условиях не реализованы заложенные природой потенциальные возможности водородокисляющих бактерий.

Наличие гистоноподобного белка HU в клетках водородокисляющих и светящихся бактерий в плотно компактизованных участках выделенной бактериальной ДНК и на тонких фибриллах, содержащих нуклеосомоподобные глобулы свидетельствует скорее всего, о его участии в поддержании компактных образований хроматина.

Таким образом, проведенные на электронно-микроскопическом уровне исследования позволили получить новые сведения об архитектонике бактериальных колоний двух видов бактерий с разными путями метаболизма, процессе дифференцировки клеток в ходе развития колонии, а также особенностях диссоциации популяции и структурной организации хроматина.

Полученные сведения важны для понимания функционирования и морфогенеза колоний, различных аспектов гетерогенности популяции. Эти результаты могут быть использованы в изучении процессов колонизации поверхностей, актуальных в медицине и технике.