Механизмы нарушения цитокинопосредованной кооперации эозинофилов и иммунокомпетентных клеток при лимфопролиферативных заболеваниях системы крови

Актуальность проблемы. В последние годы внимание исследователей привлечено к синдрому эозинофилии с позиции изучения патогенеза аллергических заболеваний и паразитарных инвазий [Фассахов Р.С. и соавт., 1992; Логинов А.С.и соавт., 1998; Джальчинова В. Б., Чистяков Г. М., 1999; Озерецковская Н. Н., 2000; Hamelmann Е., Gelfand E.W., 2001; Коровина Н. А. и соавт., 2002; Семенкова Е. Н. и соавт., 2004; Das A.M. et al., 2005]. Однако I известно, что с явлением гиперэозинофилии ассоциирован целый ряд опухолевых заболеваний (рак желудка, гипернефроидный рак почки, рак легких, поджелудочной железы, толстой кишки, шейки матки, яичников и др. [Гриншпун Г. Д., Виноградова Ю. Е., 1983; Мокеева Р. А. и соавт., 2000; Воробьев А. И., 2003; Caruso R.A. et al., 2004; Ольшанская Ю. В. и соавт., 2005]. Наряду с этим имеются многочисленные описания гиперэозинофилии при злокачественных новообразованиях системы крови, среди которых особое внимание привлекают миелои лимфопролиферативные заболевания [Merz Н. et al., 1991; Хорошко Н. Д. и соавт., 1998; Чучалин А. Г., 2003; Семенкова Е. Н. и соавт., 2004; Абдулкадыров К. М., 2006]. В настоящее время актуальной остается проблема интерпретации причин возникновения и последствий синдрома гиперэозинофилии у больных с гемобластозами.

Исследованиями последних лет показано, что эозинофил является одной из наиболее агрессивных эффекторных клеток воспаления [Анаев Э.Х. и соавт., 1994; Беклемишев И. Д., 1998]. Эозинофильные гранулоциты служат источником большого количества цитотоксических продуктов, повышенное содержание которых обусловливает формирование высокого микробицидного потенциала, направленного не только в отношении инородных субстанций, но и окружающих тканей, что способствует возникновению различных осложнений длительной гиперэозинофилии (эозинофильные васкулиты, эндокардиты, гастроэнтериты и др.) [Джальчинова В.Б., Чистяков Г. М., 1999; Воробьев А. И. и соавт., 2000; Dvorak A.M., Weller P.F., 2000; Волкова М. А., 2001; Чучалин А. Г., 2003; Ешану B.C., 2004]. Однако в современной литературе эозинофильные гранулоциты рассматривают не только в качестве клеток-эффекторов, но и как важный фактор поддержания тканевого и иммунологического гомеостаза [Минеев В.Н. и соавт., 2000; Воробьев А. И., 2002; Бережная Н. М. и соавт., 2005]. Эозинофилы обладают способностью экспрессировать на своей поверхности разнообразные рецепторные структуры и продуцировать широкий спектр биологически активных веществ. Лейкоциты эозинофильного ряда за счет секреции иммунорегуляторных цитокинов — интерлейкина (IL)-4, IL-6, IL-2, IL-10 — участвуют в регуляции функций иммунокомпетентных клеток [Джальчинова В.Б., Чистяков Г. М., 1999; Волкова М. А., 2001; Ешану B.C., 2004].

Учитывая новые аспекты физиологического значения эозинофилов, особый интерес представляют данные об их способности взаимодействовать с иммунокомпетентными клетками макроорганизма. Следует отметить, что исследование природы кооперативных взаимодействий между иммуноцитами и другими клетками макроорганизма является принципиальным аспектом в изучении пусковых механизмов развития любого патологического процесса. Важнейшую роль в установлении и стабилизации контактов между клетками играет цитокин-рецепторная сеть. Именно посредством цитокинов, синтезируемых и секретируемых клеткой, осуществляются лиганд-рецепторные взаимодействия за счет связывания растворимых веществ с аффинным рецептором на клеточной поверхности [Кашкин К.Е., 1998; Ярилин А. А., 1999, 2001; Кетлинский С. А., 2002; Симбирцев А. С., 2002, 2004]. Так, иммунокомпетентные клетки, продуцируя IL-3, IL-4, IL-5, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), регулируют процессы пролиферации, дифференцировки и активации лейкоцитов эозинофильного ряда [Gulbenkian A.R. et al., 1992; Беклемишев И. Д., 1998; Минеев В. Н. и соавт., 2000; Намазова JI.C. и соавт., 2000; Nagase Н. et al., 2001; Воробьев А. И., 2002; Lampinen М. et al., 2004; Бережная Н. М. и соавт., 2005]. Существующая между клетками иммунной системы и эозинофилами взаимонаправленность эффектов обусловлена как иммуномодулирующим действием иммунокомпетентных клеток, так и способностью лейкоцитов эозинофильного ряда активировать иммуноциты и вызывать поляризацию иммунного ответа в ту или иную сторону за счет секреции иммунорегуляторных молекул. Дизрегуляция данных эффектов может обусловливать сдвиг процессов созревания, дифференцировки и активации эозинофилов, что приводит к их длительному пребыванию в периферической крови.

Цель исследованиях установить роль нарушений цитокинопосредованной кооперации эозинофилов и мононуклеарных лейкоцитов в механизмах формирования синдрома эозинофилии при лимфопролиферативных заболеваниях системы крови.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Оценить морфо-функциональные свойства эозинофильных гранулоцитов периферической крови у пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями системы крови (лимфогранулематоз, множественная миелома и неходжкинские лимфомы), ассоциированными с синдромом эозинофилии.

2. Определить уровень эотаксина в сыворотке крови и установить особенности продукции мононуклеарными лейкоцитами периферической крови цитокинов (IL-3, IL-4, IL-5 и GM-CSF), регулирующих процессы пролиферации, дифференцировки и активации эозинофильных клеток, при гемобластозах, сопровождающихся синдромом эозинофилии.

3. Оценить состояние цитокин-рецепторного аппарата эозинофильных гранулоцитов (рецепторов к IL-3, IL-5 и эотаксину) у больных лимфопролиферативными заболеваниями системы крови, сопровождающимися выраженной эозинофилией. •.

4. Исследовать функциональный потенциал эозинофильных гранулоцитов в отношении экспрессии рецепторов к эозинофилстимулирующим цитокинам при инкубации клеток, полученных у пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями системы крови, сопровождающимися синдромом эозинофилии, с рекомбинантными формами IL-3, IL-5 и эотаксина in vitro.

Научная новизна. Впервые с привлечением культуральных, иммунологических и молекулярно-биологических методов исследования проведена комплексная оценка цитокинопосредованной кооперации эозинофилов и мононуклеарных лейкоцитов периферической крови при гемобластозах, сопровождающихся эозииофилией. Установлено, что механизмы формирования синдрома эозинофилии, осложняющего течение лимфопролиферативных заболеваний системы крови, сопряжены с нарушением кооперативного взаимодействия эозинофильных гранулоцитов и мононуклеарных клеток, что выражается в увеличении продукции мононуклеарами IL-3, IL-5 и GM-CSF и повышении уровня эотаксина в сыворотке крови при возрастании экспрессии эозинофилами IL-3R, IL-5R и CCR3 в условиях дефицита Т-клеточного звена иммунной системы и сниженной секреции IL-4 мононуклеарными лейкоцитами периферической крови. Получены новые данные, касающиеся снижения резервной способности эозинофильных гранулоцитов презентировать рецепторы к IL-3 и IL-5 при инкубации in vitro клеток с рекомбинантными формами одноименных цитокинов. У пациентов с лимфогранулематозом, множественной миеломой и неходжкинскими лимфомами, сопровождающихся синдромом эозинофилии, впервые выявлены однотипные изменения морфо-функционального статуса эозинофильных гранулоцитов (увеличение содержания внутриклеточных катионных протеинов и пероксидазы, усиление фагоцитарной активности, наличие клеток с признаками дегрануляции и цитолиза). Установлено, что при лимфопролиферативных заболеваниях системы крови, ассоциированных с выраженной эозинофилией, интенсификация кислороднезависимых и кислородзависимых процессов микробицидности опосредует формирование высокого цитотоксического потенциала эозинофильных гранулоцитов, что может обусловливать негативное влияние длительной гиперэозинофилии крови при гемобластозах.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные фундаментального характера о нарушении цитокинопосредованной кооперации эозинофилов и мононуклеарных лейкоцитов периферической крови при лимфопролиферативных заболеваниях системы крови раскрывают новые патофизиологические аспекты формирования синдрома эозинофилии. Результаты исследования могут быть положены в основу разработки патогенетически обоснованных молекулярных технологий коррекции дизрегуляции кооперативного взаимодействия эозинофилов и иммунокомпетентных клеток при гемобластозах, ассоциированных с выраженной эозинофилией, с целью лечения и профилактики осложнений длительной гиперэозинофилии крови.

Положения, выносимые на защиту:

1. Механизмы формирования синдрома эозинофилии при лимфопролиферативных заболеваниях системы крови сопряжены с нарушением цитокинопосредованной кооперации эозинофилов и мононуклеарных лейкоцитов.

2. Механизмы нарушения кооперации эозинофилов и мононуклеарных клеток при синдроме эозинофилии, осложняющем течение лимфопролиферативных заболеваний системы крови, опосредованы повышением продукции цитокинов, являющихся ключевыми в регуляции гомеостаза эозинофильных клеток (IL-3, IL-5, GM-CSF и эотаксина), при дисбалансе экспрессии эозинофилами комплементарных им рецепторов (IL-3R, IL-5R и CCR3) в условиях дефицита Т-клеточного звена иммунной системы и сниженной секреции IL-4 мононуклеарными лейкоцитами.

3. При лимфопролиферативных заболеваниях системы крови (лимфогранулематоз, множественная миелома и неходжинские лимфомы), ассоциированных с синдромом эозинофилии, эозинофильные гранулоциты претерпевают выраженные однотипные нарушения морфологических и цитотоксических свойств.

Апробация и реализация работы. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на Международном конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» (Москва, 2005), I Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (Сочи, 2005), 5-й научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2006), VIII Конгрессе «Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении» (Москва, 2006), XII Межгородской научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2006), Российском медицинском форуме-2006 «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006), Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной памяти профессора Н. Н. Кеворкова «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (Пермь, 2006).

В работе приводятся результаты исследований, поддержанных Советом при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ РФ, «Молекулярные основы нарушения гомеостаза клеток крови при актуальных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы» (НШ-4153.2006.7), а также результаты научно-исследовательской работы «Роль нарушений межклеточной кооперации в механизмах формирования больших эозинофилий крови» (Государственный контракт № 02.442.11.7056 от 26.10.2005), выполненной в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 20 022 006 годы».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, из которых 5 -в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 9 рисунками и 13 таблицами. Библиографический указатель включает 252 источника (105 -отечественных и 147 — иностранных).

ВЫВОДЫ.

1. Эозинофильные гранулоциты у пациентов с лимфогранулематозом,.

W и 1 множественной миеломои и неходжкинскими лимфомами, сопровождающимися синдромом эозинофилии, претерпевают выраженные однотипные нарушения морфологических и цитотоксических свойств.

2. Морфологические изменения как интактных, так и индуцированных антигеном Opisthorhis felineus эозинофильных гранулоцитов, полученных у больных лимфопролиферативными заболеваниями системы крови, ассоциированными с синдромом эозинофилии, характеризуются нарушением структуры ядра и цитоплазмы клеток, их дегрануляцией и макроцитозом.

3. Индукция кислороднезависимых и кислородзависимых механизмов микробицидности при синдроме эозинофилии, осложняющем течение лимфопролиферативных заболеваний системы крови (лимфогранулематоз, множественная миелома и неходжкинские лимфомы), приводит к усилению цитотоксического потенциала эозинофильных гранулоцитов.

4. Механизмы формирования синдрома эозинофилии при лимфогранулематозе, множественной миеломе и неходжкинских лимфомах сопряжены с нарушением кооперации эозинофилов и мононуклеарных лейкоцитов, опосредованной цитокинами, регулирующими процессы пролиферации, дифференцировки и активации эозинофильных клеток.

5. Нарушение кооперации эозинофилов и мононуклеарных клеток у больных лимфопролиферативными заболеваниями системы крови, ассоциированными с синдромом эозинофилии, связано с повышением продукции мононуклеарами IL-3, IL-5 и GM-CSF и увеличением уровня эотаксина в сыворотке крови при возрастании экспрессии эозинофилами комплементарных им рецепторов (IL-3R, IL-5R и CCR3) в условиях дефицита Т-клеточного звена иммунной системы и сниженной секреции IL-4 мононуклеарными лейкоцитами периферической крови.

6. При дополнительном воздействии на эозинофильные клетки, полученные у пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями системы крови, сопровождающимися развитием синдрома эозинофилии, in vitro рекомбинантных форм IL-3, IL-5 и эотаксина снижается функциональный потенциал эозинофильных гранулоцитов в отношении экспрессии IL-3R и IL-5R при неизменной способности эозинофилов презентировать рецептор к эотаксину.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

На сегодняшний день эозинофильный гранулоцит занимает одно из центральных мест при изучении патогенеза аллергических заболеваний и паразитарных инвазий: при аллергической патологии эозинофилы рассматриваются как основные компоненты ее развития, а при гельминтозахкак бесспорные факторы защиты. В то же время представления о роли эозинофилов и эозинофилии при формировании опухолевого процесса существенно ограничены.

Общеизвестно, что эозинофил является одной из наиболее агрессивных эффекторных клеток воспаления. Эозинофильные гранулоциты служат источником большого количества цитотоксических продуктов, повышенное содержание которых обусловливает формирование их высокого микробицидного потенциала [Джальчинова В.Б., Чистяков Г. М., 1999; Минеев В. Н. и соавт., 2000]. В современной литературе эозинофильные клетки также принято рассматривать в качестве регуляторов тканевого и иммунологического гомеостаза. Именно благодаря способности секретировать широкий спектр биологически-активных веществ и экспрессировать на своей поверхности разнообразные рецепторные структуры, лейкоциты эозинофильного ряда принимают участие в регуляции функций иммунокомпетентных клеток, в процессах клеточной репар&ции, свертывания крови и др. [Воробьев А.И., 2003; Бережная Н. М. и соавт., 2005].

Следует подчеркнуть, что одним из наиболее развивающихся направлений биомедицинских исследований в настоящее время становится изучение молекулярных аспектов нарушений межклеточных взаимодействий в патогенезе различных заболеваний. Очевидно, что межклеточная кооперация, осуществляя ключевую роль в регуляции гомеостаза клеток, определяет их развитие, направление дифференцировки, а также осуществление многих эффекторных клеточных функций [Ярилин А.А., 1999; Иванов А. А. и соавт., 2005]. Важную роль в становлении и стабилизации контактов между взаимодействующими клетками макроорганизма играет цитокин-рецепторная сеть. Посредством цитокинов, синтезируемых и секретируемых клеткой, осуществляются лиганд-рецепторные взаимодействия за счет связывания растворимых веществ с аффинным рецептором на клеточной поверхности [Ярилин А.А., 2001; Кетлинский С. А., 2002; Симбирцев А. С., 2002, 2004]. Изучение цитокинового профиля и способности клеток экспрессировать на мембране соответствующие рецепторы позволяет оценить характер межклеточных взаимодействий, дизрегуляция которых может обусловливать формирование патологического процесса.

Полученные нами результаты исследования свидетельствуют о том, что синдром эозинофилии, осложняющий течение лимфопролиферативных заболеваний системы крови, сопровождается увеличением продукции ключевых цитокинов, регулирующих процессы пролиферации, дифференцировки и активации эозинофилов (IL-5, IL-3 и GM-CSF), мононуклеарами и уровня эотаксина в периферической крови на фоне количественного дефицита Т-клеточного звена иммунной системы и сниженной секреции IL-4 мононуклеарными лейкоцитами. В то же время у всех больных гемобластозами, ассоциированными с эозинофилией, зарегистрировано повышенное количество эозинофильных клеток, несущих рецепторы к IL-3, IL-5 и эотаксину. При дополнительном воздействии на эозинофильные клетки, полученных у пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями системы крови, сопровождающимися эозинофилией, in vitro рекомбинантных форм IL-3, IL-5 и эотаксина установлено снижение функционального потенциала эозинофильных гранулоцитов в отношении экспрессии IL-3R и IL-5R при неизменной способности эозинофилов презентировать рецептор к эотаксину. Кроме этого, у всех пациентов с гемобластозами, ассоциированными с синдромом эозинофилии, было выявлено напряжение кислороднезависимых и кислородзависимых процессов микробицидности, что обусловливает формирование высокого цитотоксического потенциала эозинофильных гранулоцитов.

Активация ангиогенеза опухоли н формирование опухолевого микроокружения.

Рис. 9. Схема нарушения кооперации иммунокомпетентных клеток и эозиофилов в механизмах формирования синдрома эозинофилии при гемобластозах (по данным А. И. Воробьева, 2002; Н. М. Бережной и соавт., 2005 и результатам собственных исследований (выделено)) ИКК — ишу, но компетентная клетка, Эо — эозинофил, БОП — большой основной протеин, ЭКП — эозинофилъный катионный протеин, ЭП — эозинофильная пероксидаза, ЭК — эпителиальная тетка, «+» ¦ положительное значение, «-» — отрицательное значение.

Таким образом, избыточная продукция цитокинов, являющихся ключевыми в регуляции процессов клеточного гомеостаза эозинофилов, мононуклеарными лейкоцитами, с одной стороны, и дисбаланс экспрессии рецепторного аппарата эозинофильных гранулоцитов, с другой, на наш взгляд, могут обусловливать нарушение кооперации изученных клеток и являться одним из механизмов, лежащих в основе пролонгированного пребывания эозинофилов в периферической крови при лимфогранулематозе, множественной миеломе и неходжкинских лимфомах. Выявленное нами увеличение цитотоксического потенциала эозинофильных гранулоцитов, действие которого может реализоваться не только в отношении антигенных структур, но и клеток макроорганизма, позволяет сделать предположение о негативном влиянии длительной эозинофилии крови, сопровождающей гемобластозы (рис. 9).

В целом анализ молекулярных механизмов цитокин-рецепторной кооперации иммунокомпетентных клеток и эозинофильных гранулоцитов значим не только с точки зрения вскрытия природы этих механизмов. Он необходим для понимания патогенеза синдрома эозинофилии, развивающегося при лимфопролиферативных заболеваниях системы крови, с целью поиска патогенетически оправданных путей его коррекции.