Молекулярно-филогенетическое исследование камбалообразных рыб (Pisces, Pleuronectiformes) дальневосточных морей России по нуклеотидным последовательностям генов цитохрома B и цитохромоксидазы 1

Актуальность. Систематика камбал изучена слабо и классификация представителей в пределах отряда камбалообразные, как и в других отрядах рыб, в основном базировалась на морфо-анатомических признаках. Имеется лишь несколько работ (Berendzen, Dimmick, 2002; Pardo et al., 2005; Azevedo et al., 2008), выполненных с использованием молекулярных маркеров и, в частности, последовательностей нуклеотидов (далее для краткостипоследовательностей), представляющих основной инструментарий* данной' работы. Чаплау (Chapleau, 1993) в своей ревизии, основанной на морфологических признаках, указал, что предшествующие классификации могли быть интуитивными, упрощенными и филогенетически не состоятельными. С другой стороны, филогения камбалообразных рыб отряда, Pleuronectiformes на основании молекулярных данных была ограничена малым количеством видов и/или семейств и в основном заключалась в рассмотрении^ взаимоотношений между семействами (Pardo et al., 2005; Azevedo et al., 2008). Берендзен и Диммик (Berendzen, Dimmick, 2002) представили наиболее полное исследование филогении по данным, основанным на последовательностях митохондриальной ДНК (мтДНК). Однако, хот-, большинство семейств отряда и были включены в работу, число видов и их взаимосвязи в пределах семейств представлены не полностью (Pardo et al., 2005).

В представляемой диссертационной работе основной акцент сделан на исследование семейства (сем.) камбаловые (Pleuronectidae) как наиболее распространенного в водах Дальнего Востока России и Тихого океана в целом.

Таксономические отношения камбал сем. Pleuronectidae до сих пор остаются предметом многочисленных исследований. Вследствие использования различных методик, в настоящее время известно несколько вариантов классификации камбаловых рыб, предложенных разными авторами (Norman, 1934; Sakamoto, 1984; Линдберг, Федоров, 1993; Cooper,.

Chapleau, 1998). Родовая принадлежность разных видов семейства часто пересматривается, порой без достаточных для этого оснований, число родов в подсемействе Pleuronectinae меняется, что вызывает определенную критику (Расс, 1996). Подобная ситуация указывает нато, что понимание таксономических отношений, как собственно в семействе камбаловых рыб, так и в отряде камбалообразные, требует более глубокого анализа. Одной из конкретных проблем является большая синонимия и, соответственно, необходимость прояснения таксономического статуса ряда представителей-рассматриваемого семейства. Это касается, например, валидности нескольких представителей рода палтусовидных камбал Hippoglossoldes, таких как H. dubius, H. robus tus, H. ellassodon (Фадеев, 1978; Коваль, Богданов, 1082- Винников, 2003; Винников и др., 2006) и камбал рода Pseudopleuroriectes, например, Р: schren/d, P. yokohamae и других (Cooper, Chapleau, 1998; Воронина, 2001; Винников и др., 2006).

Филогенетические взаимоотношения родов и видов внутри сем. камбаловые изучены слабо. Палеонтологические находки весьма редки (Pardo et al., 2005) и не дают ясного представления о последовательности происхождения видов в группе.

В последние десятилетия для анализа системы таксономических" отношений (систематики) и филогении рыб и других животных чаще всего используется сравнительный анализ митохондриального генома и входящих в него генов митохондриальной ДНК (мтДНК).

МтДНК животных характеризуется рядом свойств, делающих ее подходящей для этих целей (Avise, 2000). К ним относится небольшой размер молекулы (Attardi, 1985), в 5−10 раз более высокая скорость эволюции последовательностей митохондриальных генов по сравнению с ядерными локусами (Brown et al., 1979), гаплоидное материнское наследование и отсутствие (Hayashi et al., 1985; Birky, 2001) или очень большая редкость (Eyre-Walker et al., 1999; Hagelberg et al., 1999) рекомбинаций. Это позволяет эффективно оценивать дифференциацию таксонов различного ранга по последовательностям генов мтДНК и даже анализировать внутривидовую дивергенцию. Спонтанные мутации в мтДНК, приводящие к заменам нуклеотидов в последовательностях генов, и дальнейшая дивергенция последовательностей у видов позволяют не только различать или дифференцировать таксоны, но и ретроспективно: реконструировать. историю возникновения таксонов и внутривидовых групп или выяснить их филогенез (Avise,.2000):. , —, '.

В данной работе для филогенетических исследований были выбраны два гена мтДНК — это ген субъединицы. 1 цитохромоксидазы с (цитохромоксидаза 1, Со-1) и ген цитохрома b- (Cyt-b). В последние десятилетия эти гены наиболее популярны в молекулярной фплогенетике и < обычно, используются для анализана уровне вид-семейство (Johns. Avise, 1998; Hebert et al., 2004; Картавцев, Ли, 2006; Kartavtsev. 2009а, h).- - - • ' Таким образом, существующие проблемы в филогении ш систематике-камбалообразных рыб определилицель данной работы — - исследование: генетической изменчивостифилогенетических отношений и дивергенции камбалообразных рыб дальневосточных^ морей России на основё анализа нуклеотидных последовательностей генов Со-1 и Cyt-b: •.

В соответствии с заявленной целью были поставлены следующие задачи:

1) определить первичные нуклеотидные последовательности (далеепоследовательности) и нуклеотидный состав генов Со-1 и Cyt-b исследуемых представителей камбалообразных рыб;

2) выяснить, как ' соотносятся уровни внутрии межвидовой дивергенцииу исследуемых представителей различных таксонов камбалообразных рыб;

3) провести реконструкцию филогенетических взаимоотношений исследуемых видов камбалообразных рыб с использованием в качестве молекулярных. маркеров генов Со-1 и Cyt-b].

4) провести сравнительный анализ филогении сем. камбаловые и других семейств, полученных с использованием различных митохондриальных маркеров и морфологических данных;

5) подтвердить или опровергнуть монофилетичность сем. Pleuronectidaeи его подсемейств;

6) уточнить таксономический статус видов рода HippoglossoidesН: robhstus, Н. elassodon wH: dubius.

Научная новизна. Впервые с помощью молекул ярно-филогенетических методов установлены эволюционные взаимосвязи между видами внутри сем. Pleuronectidae.

Уточнены уровни: внутрии межвидовой! дивергенции исследуемых видовВыдвинута гипотеза о преобладающем способевидообразованиякамбалообразных рыб. '.

Установлен монофилетичный статус сем: Pleuronectidae и представленных висследовании'- подсемейств (Pleuronectinae, Hippoglossoidinae иHippoglossinae). Сделано оригинальное. предложение исключить трибу Microstomini из подсемейства Pleuronectinae.

Показана полифилетичность рода Limanda. Впервые: сделано предложение рассматривать виды, Limanda sakchalinensis и L. limanda как самостоятельные таксоны родового ранга в составе подсемейства Hippoglossoidinae.

Уточнена филогения рода Hippoglossoides. Рекомендована синонимизация выделенных ранее таксонов Hippoglossoides robusius и Н. elassodon со сведением их, согласно приоритету, к виду Hippoglossoides elassodon Jordan, Gilbert, 1880.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Представленные, генетические маркеры Со-1 и Cyt-b могут быть применены для идентификации видов камбалообразных рыб в таксономических, эволюционных и рыбохозяйственных целях, а также использованы в Международном проекте по штрихкодированию рыб на основе ДНК, FishBOL (http://www.fishbol.org/).

Работа послужит основой для дальнейших исследований в области систематики и филогении сем. Pleuronectidae и в целом отряда Pleuronectiformes.

За время работы были определены и депонированы в международную базу данных (GenBank, NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 132 нуклеотидные последовательности представителей сем. Pleuronectidae для двух генов мтДНК Со-1 и Cyt-b.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на российских и международных конференциях: «Modern Achievements in population, Evolutionary and Ecological Genetics: International Symposium» (Владивосток — МБС «Восток», 2007), «Штрих-кодирование видов рыбРоссии на основе ДНК. Интеграция в глобальную программу FishBOL». Рабочее совещание (Владивосток, 2007), «Second International Barcode i of Life Conference» (Тайпей, Тайвань, 2007), «DNA Barcoding and Molecular Phylogenetics: The International Workshop» (Владивосток, 2007), «Школа-конференция молодых ученых „Секвенирование полных геномов“» (Иркутск, 2009), «Modern Achievements in Population, Evolutionary, and Ecological Genetics: International Symposium» (Владивосток — МБС «Восток», 2009), «The 2nd International workshop on DNA barcoding of Northeast Asian Fishes: Population, Species, and Phylogeny» (Сеул, Корея, 2010), на ежегодных конференциях Учреждения Российской академии наук Институте биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН (Владивосток, 2008, 2009).

По материалам диссертации опубликовано 17 работ, из них 6 статей в рецензируемых международных и российских журналах- 4 входят в текущий список ВАК.

Личный вклад автора. Автором были собраны образцы камбалообразных рыб из залива Восток (Японское море), выделена ДНК, проведены ПНР реакции и реакции циклосеквенирования, разработаны специфические праймеры для гена Со-1 камбалообразных рыб, проведен анализ нуклеотидных последовательностей. Статистический анализ данных проводился с помощью научного руководителя.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 162 страницах, иллюстрирована 13 рисунками, содержит 5 таблиц и приложение с 5 таблицами.

Список литературы

содержит 149 наименований.

выводы.

1. На основании представленных данных по первичным последовательностям нуклеотидов двух отдельных генов Со-Г, Су1-Ь, а также по объединеннымданным для этих генов сем. Р1еигопеси<1ае следует считать монофилетичным. Монофилетичными являются и три других представленных в исследовании семейства: 8сорЬга1т1ёае? БоЫёае. и Суш^1о5з1с1ае, за исключением семейств РагаНсМЬутёае и СШ1апс1ае, которые были описаны ранее как полифилетичные.

2. Молекулярно-филогенетические данные, полученные по первичным последовательностям нуклеотидов генов Со-1 и СЧ-Ь, показывают, что подсемейства Hippoglossoidinae и Hippoglossinae являются монофилетичными, подсемейство Р1ешхтес1: тае также можно считать монофилетичным, если исключить из него трибу МюгоБйтит и рассматривать род Ьергёорзейа в составе трибы Р1еигопес1нп. Таксономический статус ЫтапсЬ яаксЬаНпет'^ и ?. Итапс1а остается не вполне ясным. Можно предложить ревизию этого таксона с приданием ему родового ранга.

3. Таксоны Hippoglossoides гоЬиМт и Н. е1аххоЛоп являются синонимами, с предпочтением к видовому названию Н. еаязойоп. Положение Н. йиЫж требует уточнения.

4. Идентификация видов по индивидуальным последовательностям генов Со-1 и СуиЪ является высокоэффективной в силу низкой внутривидовой и высокой межвидовой изменчивости этих маркеров и может служить основой штрихкодирования видов (Ьап^^).

5. Значения /"-расстояний показывают возрастание уровня дивергенции с увеличением ранга таксона. Это позволяет сделать вывод, что среди представителей отряда камбалообразные преобладает географическая модель видообразования с накоплением случайных генетических изменений в течение длительного периода времени формирования подвидов, а затем видов и дальнейшей независимой эволюцией филетических линий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В отличие от любых морфологических признаков, которые специфичны для каждой группы организмов, молекулярные признаки обладают универсальностью (есть у всех или у подавляющего большинства организмов и присутствуют на всех стадиях жизненного цикла). И в этом их особая привлекательность как для единой идентификкционной системы: ДНК-штрихкода, так и для построения единого древа жизни (Абрамсон, 2009). Основное преимущество молекулярных методов изучения изменчивости заключается в том, что они генерируют огромные наборы дискретных признаков, причем не только тех, которые находятся под давлением отбора, но и селективно нейтральных (Банникова, 2004).

На топологию получаемых филогенетических деревьев значительное влияние оказывает выбор молекулярного маркера (Абрамсон, 2007). Для данного исследования было выбрано два митохондриальных гена — это. ген Со-1, который широко используется в программе ДНК-штрихкодирования рыб (Hebert et al, 2003, 2005; Ward, 2005; Kartavtsev et al., 2008), и ген Cyt-b, который активно используется для оценки филогении рыб на внутрии межродовом уровне, а также на уровне различных семейств и более крупных таксонов (Шедько, 2002; Банникова, 2004; Абрамсон, 2007, 2009; Kartavtsev et al., 2008).

Последовательности этих двух генов были включены в анализ, как по отдельности, так и объединены для повышения достоверности полученных топологий (Банникова, 2004).

Анализ нуклеотидного состава, выполненный для генов Со-1, Cyt-b, показал отклонение от пропорции 1:1:1:1 и отклонение в соотношении (Т+С):(А+Т). что хорошо описано в литературе для многих белок-кодирующих генов (Kim et al., 2004). В представленном исследовании это отклонение хорошо документировано статистически.

Оценка ¿-«-расстояний для различных этапов эволюционной истории показала увеличение нуклеотидного разнообразия с возрастанием ранга таксона по данным для нуклеотидных последовательностей генов Со-1 и Cyt-b. Выявляются также различия. между самими генами в степени дивергенции на четырех проанализированных уровнях, хотя суммарные средние расстояния по двум генам статистически значимо не отличаются. Таким образом, полученные результаты согласуются с многочисленными литературными данными о разной скорости эволюции этих и других генов, их различных участков и неоднородности темпов эволюции (Картавцев, Ли, 2006; Li, 1997; Абрамсон, 2009).

Известно, что таксоны высшего ранга существуют дольше, чем таксоны бол-зе низкого ранга (Simpson, 1961; Nei, 1987). Таксономисты, за редким исключением, согласны с тем, что высшие таксоны (более или менее крупные группировки видов) представляют собой результат эволюционной дивергенции (изменений в ходе филогенеза) (Майр, 1971). Таким образом, учитывая оценки между внутривидовым и межвидовым уровнями, можно объяснить эти данные, как характеризующие определенную модель видообразования. В частности, данные по^{-расстояниям} позволяют сделать вывод, что среди представителей отряда камбалообразные преобладает географическая модель видообразования с накоплением случайных генетических изменений в течение длительного периода времени формирования подвидов, а затем видов и дальнейшей независимой эволюцией линий (Dobzhansky, 1955; Ayala et al., 1974; Bush, 1975; Templeton, 1981; Mayr, 1982; King, 1993, Harrison, 1998).

Один из центральных постулатов филогеографии состоит в том, что внутривидовые монофилетичные группировки (ветви), разделенные значительными генетическими расстояниями, как правило, возникают в результате длительных внешних (биогеографическнх) преград свободному потоку генов между популяциями (Avise et al., 1987). Ряд таких факторов, как подразделение популяций вида географическими преградами, расширение ареала и расселение, оказывают непосредственное влияние на характер внутривидовой генетической изменчивости (Абрамсон, 2007). Генетические различия приобретаются постепенно, в сформированных изолированных популяциях или их группах. В дальнейшем процесс дивергенции продолжается, диверсифицируются полувиды, близнецовые виды, роды и т. д. Таким образом, чем больше времени прошло с момента изоляции, тем большие генетические расстояния приобретаются между соответствующими таксонами (Картавцев, Ли, 2006). Представленные сравнительные данные по первичным последовательностям генов Со-1, Cyt-b и белковым маркерам позволяют твердо говорить о реализации этого процесса до уровня семейства (Картавцев, Ли, 2006) и даже отряда (Kartavtsev et ai., 2009а, b).

Одно из наиболее серьезных возражений против использования генетической дивергенции для определения видовых границ у разных 1 таксонов состоит в том, что длительная изоляция близкородственных групп, индикатором которой' служит величина дивергенции или /"-расстояния, сама по себе не является обязательным условием (а только предпосылкой) образования новых видов (Ferguson, 2002).

Анализ филогенетических отношений выполнен на основании генных деревьев. Представленные деревья показали' следующие принципиальные свойства: (1) обособленное положение таксонов внешней группы, (2) разделение на кластеры, включающие отдельные семейства Pleuronectiformes, и (3) разделение на отдельные подсемейства внутри Pleuronectidae, (4) наличие кластеров, которые представляют различные роды, (5) существование кластеров, объединяющих особей одного вида в пределах одного рода.

В качестве внешней группы для исследуемых камбалообразных использовали представителей отряда трескообразные (Gadiformes). Это связано с тем, что сестринская группа для Pleuronectiformes остается не выясненной, а их происхождение от Perci formes подвергается сомнению. Трескообразные показывают хорошее разрешение на построенных деревьях, формируя обособленный кластер.

Все деревья, построенные по трем различным наборам данных (гены Со-1, Cyt-b и объединенные последовательности), показывают, что семейства, представленные в работе, формируют монофилетичные ветви. Однако достоверно можно говорить только о монофилетичности сем. PIeuronectid?2, что’хорошо поддерживается данными по генам Со-1, Cyt-b, 12Sи 16S рРНК и морфологическим исследованием филогении (Cooper, Chapleau, 1998):

Все представители сем. Pleuronectidae формируют монофилетичные ветви. Основные представители подсемейств Hippoglossoidinae, Hippoglossinae собраны в обособленные кластеры. Подсемейство Pleuronectinae также можно считать монофилетичным, если исключить из него трибу Microstomini и рассматривать род Lepidopsetta в составе трибы Pleuronectini.

Полученные молекулярно-филогене'шческие данные поддерживают монофилию большинства родов сем. Pleuronectidae. Однако филогения представителей родов внутри семейства, особенно внутри подсемейства Pleuronectini остается неясной и требует дальнейшего исследования.

Род Pseudopleuronectes. На дереве, построенном по последовательностям гена Со-1 вид P. yokohamae формирует полифилетичный кластер с видами P. obscurus и P. herzensteini. На деревьях, построенных на основании гена Cyt-b и объединенных последовательностей эти виды объединены в монофилетичную группу (хотя кластеризация видов внутри груты отличается). Однако принадлежность этих видов к одному роду согласуется с последней таксономической ревизией, основанной на морфо-анатомических критериях Купера и Чаплау (Cooper, Chapleau, 1998), на особенностях строения сейсмосенсорной системы (Воронина, Евсеенко, 2001; Винников, 2007) и на сравнении электрофоретических спектров белков (Коваль, Богданов, 1982), а также с результатами сравнительного изучения морфологии икринок, эмбрионального и постэмбрионального развития личинок и предличинок дальневосточных камбал (Перцева-Остроумова, 1961).

Род Limanda. монофилия этого рода не была подтверждена, как и в сравнительном анатомическом исследовании Купера и Чаплау (Cooper, Chaplean, 1998) что может свидетельствовать о целесообразности дальнейшего подробного исследования этого таксона.

Валидность остальных представленных в исследовании родов сем. Pleuronectidae полностью поддерживается нашими данными.

Отдельные кластеры формируют практически все последовательности, принадлежащие к одному роду, и все особи, принадлежащие к одному виду также кластеризуются отдельно, за исключением видов Hippoglossoides robustus, Н. elassodon, Н. dubius, составляющих один объединенный кластер. На основании данных представленных в анализе виды Hippoglossoides elassodon и Н. robustus следует рассматривать как синонимы (Винников, 2006; Kartavtsev et al., 2007). Это предположение согласуется и с морфологическими данными (Ivankov et al., 2002; Картавцев и др., 2002; Vinnikov, 2003). По первоописанию предпочтение следует отдать видовому названию//, elassodon (Jordan, Gilbert, 1880).

В дальнейшем необходим анализ новых видов и больших геномных участков. Это даст лучшее понимание взаимоотношений среди различных таксонов камбал.