Молекулярно-генетические подходы к микробиологическому мониторингу в системе эпидемиологического надзора за риккетснозами группы клещевой пятнистой лихорадки и бартонеллёзами

Актуальность темы

.

Риккетсии и бартонеллы относятся к возбудителям «новых» и «возвращающихся» инфекций. Отмечается активизация природных очагов эндемических риккетсиозов в разных странах мира, причины которой требуют всестороннего изучения.

Клещевой риккетсиоз зарегистрирован на 18 административных территориях азиатской части РФ. В последние годы в очагах клещевого риккетсиоза и на территориях с отсутствием заболеваемости этой инфекцией выявлен ряд патогенных риккетсий и риккетсий с неустановленной патогенностью, что требует разработки новых подходов к эпидемиологическому надзору за природными очагами (Шпынов С.Н., Рудаков Н. В., 2004). Имеющиеся данные о гетерогенности антигенных и генетических свойств риккетсий привели к необходимости комплексного использования классических и современных молекулярно-генетических методов исследования (Балаева Н.М., 1991; Roux V, Fournier Р-Е, Raoult D, 1996).

В связи с циркуляцией в природных очагах различных альфа-протеобактерий и схожестью клинических проявлений вызываемых ими заболеваний существенную актуальность имеет совершенствование методов и алгоритмов лабораторной диагностики заболеваний, вызываемых риккетсиями группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ), бартонеллами и другими клещевыми альфа-протеобактериями. Одним из перспективных и недостаточно разработанных подходов является использование технологий, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рестрикционном анализе, как более простой и доступной в практических лабораториях альтернативе технологиям ПЦР-секвенирования. Указанный подход может быть использован для повышения эффективности эпидемиологического надзора и лабораторной диагностики риккетсиозов группы КПЛ, дифференциации R. sibirica от других видов риккетсий группы КПЛ, прежде всего от наиболее распространенной в клещах рода Dermacentor Rickettsia raoultii sp. nov. Молекулярно-генетические исследования с использованием ПЦР-рестрикционного анализа для дифференциации циркулирующих на территории РФ патогенных и непатогенных риккетсий в иксодовых клещах и в материалах от больных ранее не проводились. Широкое применение молекулярно-генетических методов позволило выявить, что бартонеллы являются этиологическими агентами целого спектра инфекционных болезней. Однако эпидемиологическая значимость членистоногих переносчиков и млекопитающих в качестве резервуара бартонелл в РФ изучена недостаточно.

Цель работы.

Цель — повышение эффективности эпидемиологического надзора и лабораторной диагностики риккетсиозов и других инфекций, вызываемых клещевыми альфа-протеобактериями, на основе подбора и совершенствования адекватных молекулярно-генетических подходов.

Задачи.

1. Провести комплексный анализ структуры и уровней заболеваемости инфекций, передаваемых клещами, в территориальном и временном аспектах по федеральным округам РФ и административным территориям Сибирского федерального округа.

2. Отработать алгоритмы лабораторной дифференциации риккетсий группы КПЛ (R.sibirica, R. raoultii) с использованием ПЦР-рестрикционного анализа на музейных штаммах риккетсий.

3. Провести сравнительный анализ этиологической структуры и распространенности риккетсий в переносчиках и в материалах от пациентов на эндемичных по клещевому риккетсиозу территориях (Алтайский край) и территориях, свободных от этой инфекции (Омская область).

4. Провести скрининг заражённости бартонеллами диких мелких млекопитающих и клещей с использованием ПЦР.

5. Обосновать алгоритмы лабораторной диагностики риккетсиозов и детекции бартонелл и риккетсий с использованием технологий, основанных на ПЦР и рестрикционном анализе, в системе эпидемиологического надзора.

Научная новизна.

Впервые в территориальном и временном аспектах проанализирована структура заболеваемости клещевыми инфекциями в разрезе федеральных округов РФ и административных территорий Сибирского федерального округа. Увеличение в структуре заболеваемости клещевыми инфекциями ИКБ связано, в первую очередь, с уменьшением регистрируемой заболеваемости КЭ. Преобладание ИКБ в структуре заболеваемости отмечено в Центральном ФО, КЭ — в Уральском ФО, в Сибирском ФО регистрируются все три наиболее распространенные инфекции (КЭ, ИКБ, КР), КР преобладает в Дальневосточном ФО. На территориях, смежных с Омской областью, отмечается наиболее разнообразная структура заболеваемости клещевыми инфекциями.

С использованием комплекса лабораторных методов исследования установлена циркуляция на территории Омской области инфекционных агентов не только официально регистрируемых заболеваний (клещевого энцефалита и иксодового клещевого боррелиоза), но также возбудителей новых инфекций — R. raoultii (потенциальный патоген человека, вызывающий заболевание, сходное с синдромом TIBOLA) и Bartonella spp.(возбудители широкого спектра инфекций, объединяемых термином «бартонеллёзы»).

Осуществлена сравнительная оценка инфицированности риккетсиями переносчиков, собранных на эндемичных по клещевому риккетсиозу и свободных от этой инфекции территориях.

Впервые получены данные ПЦР-скрининга ДНК бартонелл в иксодовых клещах и мелких млекопитающих в Омской области, свидетельствующие об их широком распространении в Западной Сибири.

Впервые разработаны и апробированы технологии молекулярно-биологических исследований, основанные на ПЦР-рестрикционном анализе, для дифференциации основных видов риккетсий, выявляемых в природных очагах Западной Сибири.

Впервые обосновано применение ПЦР-рестрикционного анализа для дифференциации патогенных (R.sibirica) и условно-патогенных (генотипы Rraoultii) риккетсий в иксодовых клещах и в материалах от больных. Отработаны алгоритмы дифференциации риккетсий основных видов и лабораторной диагностики риккетсиозов у пациентов, основанные на ПЦР-рестрикционном анализе.

Практическая значимость работы и внедрения.

Обосновано введение в систему эпидемиолого-эпизоотологического надзора микробиологического мониторинга за риккетсиями группы КПЛ и бартонеллами.

В результате проведенных исследований отработана тактика применения ПЦР-рестрикционного анализа в комплексе методов, применяемых для молекулярно-биологической дифференциации альфа-протеобактерий в природных очагах.

Разработанные алгоритмы лабораторной диагностики на основе ПЦР-рестрикционного анализа использованы для совершенствования эпидемиологического надзора в природных очагах трансмиссивных инфекций.

По результатам проведенных исследований опубликованы статьи методического характера.

Подготовлено учебное пособие «Молекулярно-генетические методы диагностики риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки».

Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре микробиологии, иммунологии и вирусологии ОмГМА и в научно-исследовательской деятельности Омского БИИПОИ.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Выявлены существенные отличия в структуре и уровнях заболеваемости инфекциями, передаваемых клещами, в территориальном и временном аспектах по федеральным округам РФ и административным территориям Сибирского федерального округа, являющиеся отражением пространственной и функциональной структуры природных очагов.

2. Население Омской области подвержено риску заражения при присасывании клеща не только возбудителями регистрируемых инфекций (клещевой энцефалит и иксодовый клещевой боррелиоз), но и возбудителями «новых» инфекций, вызываемых R. raoultii и Bartonella spp., что требует совершенствования лабораторной диагностики и эпидемиологического надзора в сочетанных очагах.

3. ПЦР-рестрикционный анализ является эффективным методом для дифференциации R. sibirica и R. raoultii в комплексе методов, применяемых для молекулярно-биологической дифференциации альфа-протеобактерий в природных очагах.

4. Технологии, основанные на ПЦР-рестрикционном анализе, могут быть использованы для совершенствования лабораторной диагностики и эпизоотолого-эпидемиологического надзора за клещевыми риккетсиозами.

Апробация работы.

Диссертационная работа апробирована на совместном заседании кафедр эпидемиологии, микробиологии, вирусологии и иммунологии Омской государственной медицинской академии, с участием научных сотрудников Омского НИИ природно-очаговых инфекций, 2009 г.

Основные положения диссертации доложены на следующих отечественных и международных конференциях: V межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы здоровья населения Сибири: гигиенические и эпидемиологические аспекты», г. Омск, 2004 г.- научно-практической конференции, посвященной 75-летию кафедр инфекционных болезней взрослых и детей ОмГМА, г. Омск, 2005 г.- конференции с международным участием «Актуальные вопросы региональной инфекционной патологии», посвященной 95-летию Института эпидемиологии и микробиологии НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН, г. Иркутск, 2007 г.- УП межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения», г. Омск, 2007 г.- VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, г. Москва, 2007 г.- VIII межрегиональной конференции с международным участием «Актуальные проблемы сохранения здоровья населения Сибири», посвященной 70-летию медико-профилактического факультета Омской государственной медицинской академии, г. Омск, 2008 г.

Основные результаты опубликованы в 10 печатных работах.

Объём и структура диссертации.

Работа изложена на 315 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15 таблицами и 89 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырёх глав собственных исследований, заключения, выводов. Библиографический указатель содержит 217 источников, из которых 58 работ отечественных и 132 — зарубежных авторов.

ВЫВОДЫ:

1. Выявлена тенденция изменения уровня регистрируемой заболеваемости клещевым энцефалитом, иксодовым клещевым боррелиозом и клещевым риккетсиозом в РФ и Омской области за 1997;2007гг. Тенденция снижения заболеваемости КЭ в Омской области совпадает с таковой по России. Уровень регистрации ИКБ в РФ и Омской области не имеет тенденции к изменению за период 1997;2007гг.

2. Проведён сравнительный анализ структуры заболеваемости передаваемых клещами инфекций в РФ и регионах РФ за 2000 г. и 2007 г. В 2000 г. структура заболеваемости клещевыми инфекциями в РФ была представлена следующим образом: КЭ составлял 36,0%- на долю ИКБ приходилось 48,0%- на долю КР — 16,0%. В 2007 г. доля КЭ в структуре заболеваемости снизилась, составив 25,0%±0,01- доля ИКБ, напротив, возросла и составила 58,0%. Долевое участие КР практически не изменилось — 17,0%.

3. При продвижении с запада на восток РФ отмечалось постепенное снижение долевого участия в заболеваемости клещевыми инфекциями иксодового клещевого боррелиоза с 94,8% в Центральном ФО до 26,1% в Сибирском ФО и 27,7% в Дальневосточном ФО. Наряду с этим увеличивалась доля заболеваемости клещевым энцефалитом с 5,2% в Центральном ФО до 68,5% в Уральском ФО, 26,1% в Сибирском ФО и снова снижалась до 6,4% в Дальневосточном. Доля заболеваемости клещевым риккетсиозом в структуре исследуемых нами клещевых инфекций увеличивалась: в Уральском ФО она составляла 0,6%, в Сибирском — 41,3%, а в Дальневосточном — 65,8%.

4. Впервые отработан алгоритм детекции и дифференциации риккетсий R. sibirica и R. raoultii с использованием ПЦР-рестрикционного анализа в полевом и клиническом материале, на основании которого обоснованы подходы эпидемиологического надзора на региональном уровне и алгоритмы лабораторной диагностики риккетсиозов.

5. Впервые в РФ в материале от пациентов (биоптат) с подозрением на клещевой риккетсиоз выявлена R. raoultii, что позволяет предположить её этиологическую роль в инфекционной патологии человека.

6. Выявление ДНК бартонелл во внутренних органах диких мелких млекопитающих (грызуны), членистоногих переносчиках (иксодовые клещи, вши) свидетельствует о широком распространении бартонелл в Омской области.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ.

ДИССЕРТАЦИИ.

1. Выявление протеобактерий (бартонелл и риккетсий) у иксодовых клещей, мелких млекопитающих, в биоптатах пациентов / А. Н. Коломеец, С. Н. Шпынов, Н. В. Рудаков, И. В. Арсеньева // Вестник Российской Военно-медицинской академии. — 2008. — № 2 (22). — С. 635−636.

2. Выявление протеобактерий (бартонелл и риккетсий), спирохет (боррелий) и вируса клещевого энцефалита у иксодовых клещей, мелких млекопитающих, в клиническом материале пациентов / А. Н. Коломеец и др. // Актуальные проблемы сохранения здоровья населения Сибири. — Омск, 2008. — С.228−231.

3. Дифференциация риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки с использованием комплекса молекулярно-генетических методов (ПЦР-ПДРФ) / А. Н. Коломеец, С. Н. Шпынов, Н. В. Рудаков, Л. В. Кумпан, И. Е. Самойленко, Т. А. Решетникова // Актуальные проблемы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения: матер.7 межрег. научно-практ. конф. с междунар. участием. — Омск, 2007. — Т.2. -С. 118−122.

4. Использование комплекса молекулярно-генетических методов (ПЦР-ПДРФ) для изучения риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки / А. Н. Коломеец, С. Н. Шпынов, Н. В. Рудаков, И. Е. Самойленко, Т. А. Решетникова, Л. В. Кумпан // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. — 2007. 3 (55), прилож. — С. 117−120.

5. Коломеец А. Н. Методы выделения ДНК из различных биологических объектов / А. Н. Коломеец, С. А. Рудакова // Актуальные проблемы здоровья населения Сибири: гигиенические и эпидемиологические аспекты. — Омск, 2004. — Т.2. — С. 323.

6. Первые результаты изучения бартонеллезов в Омской области / Н. В. Рудаков, И. Е. Самойленко, Г. В. Березкина, А. Н. Коломеец, А. К. Танцев, С. Н. Шпынов, О. П. Мурзина, Л. В. Хорошавина, В. Н. Белов // Актуальные проблемы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения: матер.7 межрег. научно-практ. конф. с междунар. участием. — Омск, 2007. — Т.1. С. 340−344.

7. Рудакова С. А. Актуальные аспекты эпидемиологии и профилактики трансмиссивных природноочаговых инфекций в Западной Сибири / С. А. Рудакова, А. Н. Коломеец, Н. В. Рудаков // Актуальные проблемы сохранения здоровья населения Сибири. — Омск, 2008. — С.368−372.

8. Экспресс-индикация трансмиссивных патогенов как основа дифференцированного подхода к профилактике инфекций, передающихся иксодовыми клещами / С. А. Рудакова, А. Н. Коломеец, И. Е. Самойленко, A.M. Кузьминов, Н. В. Рудаков // Бюллетень СО РАМН, 2007. — № 4. -С. 116−119.

9. Эпидемиологическая оценка сочетанных очагов клещевого энцефалита, клещевого боррелиоза и гранулоцитарного анаплазмоза на юге Западной.

Сибири / С. А. Рудакова, А. А. Матущенко, Н. В. Рудаков, А. Н. Коломеец, О. В. Бутаков, А. А. Рыбин, Л. Д. Щучинова // Омский научный вестник: ак туальные вопросы инфекционной патологии — 2005. — № 4 (33), прилож. -С. 115−118. lO. Rudakova S.A. Genomic diagnostics of tick-borne borrelioses in West Siberia / S.A.Rudakova, E.V.Matuschenko, A.N.Kolomeetz // Proceedings of international scientific-practical interdisciplinary workshop. — Thailand, 2007. -P. 60−61.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Проблема заболеваний, переносчиками которых являются иксодовые клещи, в последнее десятилетие приобретает все большее значение для многих регионов России, в том числе и для Западной Сибири.

В Западной Сибири отмечена сочетанность природных очагов клещевого энцефалита, иксодового клещевого боррелиоза, клещевого риккетсиоза, Омской геморрагической лихорадки [40, 60, 70- 84].

В Омской области имеются сочетанные природные очаги таких инфекций, как клещевой энцефалит (КЭ), иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ), анаплазмозы, инфекционные агенты которых выявлены в клещах родов Ixodes и Dermacentor. Из инфекций, передающихся клещами, регистрируются КЭ и ИКБ. Всё большую актуальность приобретают «новые» и «возвращающиеся» инфекции, вызываемые риккетсиями и бартонеллами.

В связи с циркуляцией в природных очагах различных альфа-протеобактерий и схожестью клинических проявлений вызываемых ими заболеваний, существенную актуальность имеет совершенствование методов и алгоритмов лабораторной диагностики заболеваний, вызывающихся риккетсиями группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ), бартонеллами и другими клещевыми альфа-протеобактериями. Одним из перспективных и недостаточно разработанных подходов является использование технологий, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рестрикционном анализе как более простой и доступной в практических лабораториях альтернативе технологиям ПЦР-секвенирования. Указанный подход может быть использован для эпидемиологического надзора и лабораторной диагностики риккетсиозов группы КПЛ, дифференциации R. sibirica от других видов риккетсий группы КПЛ, прежде всего от наиболее распространенной в клещах рода Dermacentor Rickettsia raoultii sp. nov. Молекулярно-генетические исследования с использованием ПЦР-рестрикционного анализа для дифференциации циркулирующих на территории РФ патогенных и непатогенных риккетсий в иксодовых клещах и в материалах от больных ранее не проводились. Поэтому нами было проведено исследование вышеуказанных видов материала для восполнения этого пробела. Эпидемиологическая значимость членистоногих переносчиков и млекопитающих в качестве резервуара бартонелл также изучена недостаточно, и наше исследование отчасти восполнило недостаток и этой информации.

Таким образом, основной целью нашего исследования являлось совершенствование адекватных молекулярно-генетических подходов, и на их основе — повышение эффективности эпидемиологического надзора и лабораторной диагностики риккетсиозов и других инфекций, вызываемых клещевыми протеобактериями.

Для достижения этой цели нами был проведён анализ основных тенденций эпидемического проявления природных очагов клещевого риккетсиоза, клещевого энцефалита и иксодового клещевого боррелиоза в РФ и Омской области за 1997;2007гг.- отработан алгоритм лабораторной дифференциации риккетсий группы КПЛ (R.sibirica, R. raoultii) с использованием ПЦР-рестрикционного анализапроведён анализ этиологической структуры и распространенности риккетсий в переносчиках и в материалах от пациентовпроведён скрининг мелких млекопитающих (грызунов) и клещей на заражённость бартонеллами и обоснован алгоритм лабораторной диагностики риккетсиозов и детекции бартонелл и риккетсий с использованием технологий, основанных на ПЦР и рестрикционном анализе, в системе эпидемиологического надзора.

При анализе динамики заболеваемости КЭ по РФ была выявлена тенденция к снижению заболеваемости (Тсн=8,37%). Выраженная тенденция снижения регистрируемой заболеваемости КЭ наблюдается и в Омской области (Тсн=16,8%). Следовательно, тенденции заболеваемости КЭ в РФ и Омской области совпали. За анализируемый период уровень заболеваемости КЭ в РФ превысил показатели по Омской области в 1,5 раза (р<0,001).

При анализе динамики заболеваемости КЭ в сельских районах Омской области была выявлена выраженная тенденция к её снижению: Тсн=17,7%. За анализируемый период отмечается пик заболеваемости в 1999 г. Увеличение уровня заболеваемости в 1999 г. совпадает с подъёмом по РФ, что связано, возможно, с закономерностями, общими и для Омской области и для других регионов РФ. Показатели заболеваемости КЭ в сельских районах Омской области и среднефедеральные не имеют статистически значимых различий за анализируемый период (р>0,05).

При анализе динамики заболеваемости КЭ в г. Омске установлено наличие тенденции к снижению заболеваемости (Тсп=7,5%). За период 1997 г. по 2007 г. наибольший уровень регистрируемой заболеваемости 1,9 на 100 тыс. населения отмечался в 2000 г. За исследуемый период показатели заболеваемости КЭ в РФ превысили показатели в г. Омске в 5,4 раза (р<0,001).

В результате проведённого анализа можно сделать следующее заключение: динамика регистрируемой заболеваемости КЭ в г. Омске, сельских районах Омской области и по Омской области в целом свидетельствует о наличии выраженной тенденции к снижению. Эта тенденция совпала с общей тенденцией, наблюдаемой по РФ. Отмечался пик заболеваемости в 1999 г., который совпал с максимумом по РФ, что, вероятно, является следствием факторов, оказавших влияние на заболеваемость КЭ в большинстве эндемичных регионов России.

При изучении динамики заболеваемости ИКБ в РФ и в целом по Омской области нами были выявлены следующие закономерности: существенных изменений в динамике заболеваемости ИКБ по РФ и Омской области не выявлено (Тс&bdquo-=0,3% и Тпр=0,4% соответственно). При этом показатели заболеваемости по РФ в 4,3 раза превысили таковые по области (р<0,001).

Динамика заболеваемости ИКБ в сельских районах Омской области имела умеренную тенденцию к снижению — (Тсн=3,8%), и показатели в 3,5 раза ниже по сравнению с среднефедеральными (р<0,001).

Динамика заболеваемости ИКБ в г. Омске демонстрировала наличие выраженной тенденции к росту 1997;2007гг. (Тпр=8,9%). Показатели заболеваемости ИКБ в РФ в 7,4 раза превысили показатели заболеваемости в г. Омске (р<0,001).

Таким образом, заболеваемость ИКБ по Омской области в целом ниже среднефедеральных показателей. Таким образом, тенденция снижения заболеваемости КЭ в Омской области совпадает с таковой по России, в отличие от ИКБ. Уровень заболеваемости ИКБ в РФ и Омской области оставался стабильным за период 1997;2007гг.

Несмотря на снижение регистрируемой заболеваемости, численность клещей I. persulcatus и D. reticulatus в Омской области с 2005 г. по 2008 г. имеет тенденцию к увеличению [21]. Также была выявлена прямая сильная корреляционная связь между количеством укусов клещей и уровнем заболеваемости КЭ (г=0,88) и слабая связь между количеством укусов и уровнем заболеваемости ИКБ (г^-0,07).

Третьей нозоформой, динамика заболеваемости которой нами исследовалась, является клещевой риккетсиоз (КР). Данное заболевание, также как КЭ и ИКБ, является облигатно-трансмиссивным, и имеет достаточно широкое распространение в Азиатской части России и за пределами РФ. В отличие от КЭ и ИКБ, КР не регистрируется на территории Омской области, хотя условия для циркуляции возбудителя данной инфекции имеются.

В динамике заболеваемости КР в РФ за 1997;2007гг. имеется тенденция к снижению заболеваемости (Тсн=10,2%).

Сопоставление территориального распределения заболеваемости КР за период с низким уровнем заболеваемости (60-е годы) и период резкого роста (1993;2002гг.) свидетельствует о его изменении за счёт увеличения доли заболеваемости в Западной Сибири (с 24,5 до 55,0%) и на Дальнем Востоке (с 7,5 до 23,0%). При этом доля заболеваемости в Восточной Сибири снизилась с 68,0 до 22,0%.

За период 2000;2007гг. территориальная структура заболеваемости КР в РФ не претерпела существенных изменений, несмотря на снижение общего количества регистрируемых случаев КР в РФ.

Использование молекулярно-биологических методов для мониторинга природных очагов КР на территории Омской области позволило выявить следующие виды риккетсий: R. helvetica, R. tarasevichiae и R. raoultii [48]. Следовательно, на территории Омской области циркулируют риккетсии, которые являются потенциальными патогенами человека. R. raoultii связывают с развитием синдрома «TIBOLA» [189], хотя окончательно роль этого вида в патологии человека не доказана.

На территории Омской области не осуществляется эпидемиологический надзор за КР, поскольку считается, что эта нозологическая форма здесь отсутствует. Роль вышеперечисленных видов риккетсий в качестве патогенов человека окончательно не доказана. Исходя из этого, крайне необходимым является внедрение в клинико-диагностическую практику точных, быстрых и относительно недорогих методов, каким является ПЦР. Метод ПЦР, дополненный рестрикционным анализом, является оптимальным для клинических лабораторий, благодаря простоте постановки, доступности реактивов и быстроте получения результата. Кроме того, он достаточно точен и легко может быть модифицирован путём подбора оптимального набора рестриктаз в зависимости от спектра риккетсий в конкретном регионе.

В 2000 г. структура заболеваемости клещевыми инфекциями в РФ была представлена следующим образом: КЭ составлял 36,0%- на долю ИКБ приходилось 48,0%- на долю КР — 16,0%. В 2007 г. доля КЭ в структуре заболеваемости снизилась, составив 25,0%- доля ИКБ, напротив, возросла и составила 58,0%. Долевое участие КР практически не изменилось — 17,0%. Общее количество зарегистрированных заболеваний КЭ за период 1997;2007гг. снизилось в 1,8 раза (р<0,001).

Первое место в 2000 г. в структуре территориального распределения заболеваемости КЭ принадлежало Сибирскому ФО (50,9%), на втором месте располагался Приволжский ФО (21,9%). Третье место по заболеваемости занимал Уральский ФО (16,5%). Четвертое, пятое и шестое места принадлежали Северо-Западному (6,1%), Дальневосточному (3,4%) и Центральному ФО (1,1%), соответственно. Наибольшее число случаев КЭ в 2000 г. зарегистрировано в Красноярском крае, Удмуртской республике, Пермской области, Свердловской и Томской области. Наибольшие показатели заболеваемости получены в Томской области, Удмуртской республике, Красноярском крае. В 2007 г первое место в структуре территориального распределения заболеваемости КЭ также принадлежало Сибирскому ФО (52,6%), с третьего места на второе переместился Уральский ФО (16,4%). Доля Приволжского ФО в структуре заболеваемости снизилась (16,0%), и в 2007 г. он занял третье место. Четвертое место принадлежало Северо-Западному ФО (11,0%), доля Центрального ФО возросла (2,2%) и он занял пятое местодоля Дальневосточного ФО по сравнению с 2000 г., наоборот, снизилась (1,8%). Наибольшие показатели заболеваемости КЭ в 2007 г. были получены в Томской области и республике Алтай, республике Удмуртия, Кировской и Курганской областях. Наибольшее число случаев заболеваний зарегистрировано в Красноярском крае, Пермском крае, Свердловской области.

Уровень заболеваемости КЭ в РФ снизился в 2007 г. по сравнению с 2000 г. в 1,8 раза (р<0,001).

В структуре территориального распределения ИКБ в 2000 г. первое место принадлежало Приволжскому ФО (28,7%). Вторым по доле вклада в общую заболеваемость ИКБ являлся Сибирский ФО (20,1%). Третье место принадлежало Северо-Западному ФО (18,9%). Четвёртое место в структуре заболеваемости ИКБ занимал Центральный ФО (16,2%). Пятое место принадлежало Уральскому ФО (11,6%). На шестом месте располагался Дальневосточный ФО (4,3%). Последнее место в территориальной структуре заболеваемости ИКБ занимал Южный ФО (0,23%). Наибольшее число случаев.

ИКБ зарегистрировано в Кировской и Пермской области, Удмуртской республике, г. Санкт-Петербурге, Томской, Свердловской и Ярославской областях. Наибольшие показатели заболеваемости ИКБ в 2000 г. получены в УОБАО, Томской, Кировской, Костромской и Ярославской областях. Доли и ранг различных регионов в структуре заболеваемости ИКБ в 2007 г. практически не изменились. Наибольшие показатели заболеваемости ИКБ в 2007 г. были получены в Кировской области, Усть-Ордынском Бурятском АО и Вологодской области. Наибольшее число случаев ИКБ было зарегистрировано в Кировской области, Томской области, Вологодской области.

Уровень заболеваемости ИКБ в РФ не претерпел существенных изменений (р>0,05).

Первое место в территориальной структуре заболеваемости клещевым риккетсиозом в 2000 г. принадлежало Сибирскому ФО (78,2%), второеДальневосточному ФО (21,4%), третье — Уральскому ФО (0,4%). В других округах РФ клещевой риккетсиоз зарегистрирован не был.

В 2007 г. территориальная структура заболеваемости КР не претерпела существенных изменений. Первое место занимал СФО (79,3%) — второе принадлежало Дальневосточному ФО (20,1%) — третье — Уральскому ФО (0,6%). В других регионах РФ КР не регистрировался. Наибольшие уровни заболеваемости КР в 2000 и 2007гг. зарегистрированы в республике Алтай, УОБАО, Алтайском крае, Амурской и Тюменской области. Наибольшее число случаев заболеваний КРв 2000 и 2007гг. зарегистрировано в Алтайском крае, Приморском крае и Тюменской области.

Таким образом, территориальная структура заболеваемости КР в РФ не претерпела существенных изменений, несмотря на снижение уровня заболеваемости за 2000;2007гг. в 1,4 раза (р<0,001).

Таким образом, в территориальной структуре этих трёх инфекций, передаваемых через укус клеща, имеются отличия в различных округах РФ. За анализируемый временной период доля отдельных нозоформ в общей структуре также изменилась. При продвижении от западной границы РФ далее на восток в 2007 г. происходит постепенное снижение доли ИКБ в структуре заболеваемости с 94,8% в Центральном ФО до 26,1% в Сибирском ФО и 27,7% в Дальневосточном ФО. с нарастанием доли КЭ с 5,2% в Центральном ФО до 68,5% в Уральском ФО, 26,1% в Сибирском ФО со снижением до 6,4% в Дальневосточном. На территории Уральского ФО в данной структуре появляется клещевой риккетсиоз (0,6%), доля которого увеличивается к восточной границе РФ (в Сибирском — 41,3%, а в Дальневосточном — 65,8%), тогда как вклад КЭ и ИКБ в общую структуру клещевых инфекций снижается.

При анализе структуры клещевых инфекций в округах РФ в 2007 г. было установлено, что в Центральном ФО основная часть клещевых инфекций приходилась на ИКБ (94,8%), КЭ составлял небольшую часть (5,2%). В СевероЗападном ФО большую часть клещевых инфекций также составлял ИКБ (78,8%), тогда как на долю КЭ приходилось только 21,2%. В Южном ФО клещевой энцефалит и клещевой риккетсиоз не регистрировался, все случаи заболеваний после укуса клещей были диагностированы как ИКБ. В Приволжском ФО на ИКБ приходилось 79,3% всех случаев регистрируемых клещевых инфекций, на КЭ — 20,7%. В Уральском ФО доля ИКБ составляла 68,5%, доля КЭ — 30,8%, доля КР — 0,6%. В Сибирском ФО доля ИКБ составляла 26,1%, КЭ — 32,5%- КР — 41,3%. В Дальневосточном ФО на долю ИКБ приходилось 27,7%- на долю КЭ — 6,4%, 15- КР — 65,8%.

Нами была проанализирована таюке заболеваемость КЭ, ИКБ и КР в отдельных областях РФ, относящихся к Уральскому (Курганская, Свердловская, Тюменская и Челябинская области) и Сибирскому федеральным округам в 2000 г. и 2007 г. В регионах Уральского ФО в 2007 г. по сравнению с 2000 г. отмечались сходные с СФО изменения, касающиеся увеличения доли ИКБ в структуре клещевых инфекций (с 48,3% в 2000 г. до 68,5% в 2007 г.) при снижении доли КЭ (с 51,7% в 2000 г. до 30,8% в 2007 г.). В СФО в 2007 г. по сравнению с 2000 г. отмечалось практически повсеместное снижение долевого участия в структуре клещевых инфекций клещевого энцефалита (с 45,1% в 2000 г. до 32,6% в 2007 г.), за исключением республики Алтай и Читинской области, где доля данной нозоформы, напротив, увеличилась. Во всех регионах СФО, за исключением УОБАО и Томской области, отмечалось увеличение доли ИКБ в 2007 г.(26,1%) по сравнению с 2000 г. (23,8%). В УОБАО доля ИКБ в 2007 г. снизилась, а в Томской области осталась без изменений. Доля КР увеличилась практически во всех регионах СФО (с 31,1% в 2000 г. до 41,3% в.

2007 г.), за исключением республики Алтай и Читинской области, где отмечалось её снижение.

Доля заболеваемости клещевым риккетсиозом в структуре исследуемых нами клещевых инфекций увеличивалась: в Уральском ФО она составляла 0,6%, в Сибирском — 41,3%, а в Дальневосточном — 65,8%.

В Челябинской области в 2000 г. на долю КЭ приходилось 47,8%- на ИКБ — 52,2%.

В 2007 г. в структуре произошли существенные изменения: доля КЭ снизилась до 28,1% - доля ИКБ, напротив, возросла до 71,9%.

При анализе структуры клещевых инфекций в 2000 г. в Свердловской области было установлено, что КЭ и ИКБ составляют примерно одинаковые доли в клещевых инфекциях (50,4%и 49,6%, соответственно).

В 2007 г. в структуре клещевых инфекций Свердловской области произошли существенные изменения: доля ИКБ возросла до 75,5%- тогда как КЭ составил только 24,3%.

В Курганской области в 2000 г. в структуре заболеваемости клещевыми инфекциями КЭ составлял 63,4%- на долю ИКБ приходилось 34,9%- а КР — 1,6%.

В 2007 г. в структуре клещевых инфекций произошли некоторые изменения: так, возросла доля ИКБ (39,2%) — доля КЭ, напротив, снизилась (58,9%). Доля КР осталась практически не изменилась (1,7%).

В Тюменской области на долю КЭ приходилось более половины всех клещевых инфекций (56,8%), на долю ИКБ — 39,6%- доля КР составляла 3,6%.

В 2007 г. в Тюменской области среди клещевых инфекций увеличилась доля ИКБ (46,6% 1), а также КР (6,1%). Доля КЭ, напротив, снизилась, составив 47,4%.

В СФО нами была проанализирована заболеваемость клещевыми инфекциями в 2000 г и 2007 г. в республиках Алтай, Бурятии, Тыве, ХакасииАлтайском, Красноярском краяхИркутской, Кемеровской, Новосибирской, Омской, Томской, Читинской областяхУОБАО.

В Омской области клещевой риккетсиоз не регистрировался. На долю клещевого энцефалита в 2000 г. приходилось 83,0%. Иксодовый клещевой боррелиоз составлял 17,0%.

В 2007 г. долевое участие КЭ и ИКБ в структуре клещевых инфекций в Омской области приняло прямо противоположный характер. Доля КЭ составляла только 20,5%- тогда как доля ИКБ возросла, составив 79,5%.

В Томской области клещевой риккетсиоз не регистрировался. Доли клещевого энцефалита и иксодового клещевого боррелиоза в 2000 г. были примерно одинаковыми и составляли соответственно: 47,2% и 52,8%.

В 2007 г. структура практически не изменилась. КЭ составлял 48,0%, а ИКБ — 52,0%.

В Новосибирской области клещевой энцефалит составлял 56,8%. На долю ИКБ приходилось 33,5%±0,06. Клещевой риккетсиоз составлял 9,6%.

В 2007 г. долевое участие КЭ снизилось, составив 37,1%, тогда как доли ИКБ и КР возросли (47,7% и 15,2%, соответственно).

В Алтайском крае на долю КЭ приходилась небольшая часть заболеваний — 9,0%- на долю ИКБ — 1,7%. Клещевой риккетсиоз составлял наибольшую долю в структуре заболеваемости клещевыми инфекциями — 89,2%.

В 2007 г. доля КР в Алтайском крае среди клещевых инфекций возросла, составив 92,7%. Также немного увеличилась доля ИКБ (3,2%) — доля КЭ, напротив, уменьшилась (4,1%).

В республике Алтай первое место в структуре заболеваемости клещевыми инфекциями занимал КР, составив 75,6%- доля КЭ составляла 18,7%- на долю ИКБ приходилось 5,6%.

В 2007 г. доли КЭ и ИКБ увеличились, составив 27,5% и 9,8%, соответственно. Доля КР, напротив, уменьшилась до 62,7%.

В Кемеровской области КЭ в структуре заболеваемости клещевыми инфекциями КЭ составлял 71,2%- ИКБ составлял 27,4%. Клещевой риккетсиоз занимал незначительную долю и составлял 1,3%.

В 2007 г. в структуре изменилось соотношение долей КЭ и ИКБ. На долю КЭ приходилось лишь 52,3%, тогда как доля ИКБ возросла, составив 45,7%. Доля КР практически не изменилась (1,9%).

В республике Хакасия доля КЭ в структуре клещевых инфекций составила 47,2%- доля ИКБ — 18,4%. Клещевой риккетсиоз составил 34,4%.

В 2007 г. доля КЭ снизилась до 27,6%. Доля ИКБ практически не изменилась, составив 17,3%. Доля КР, напротив, возросла, составив 55,1%.

В Красноярском крае в 2000 г. на долю клещевого энцефалита приходилось 65,6%- на долю ИКБ — 20,6%. Клещевой риккетсиоз составлял 13,8%.

В 2007 г. доля КЭ снизилась, составив 55,0%. Доли ИКБ и КР, напротив, возросли, составив 28,0% и 17,0%, соответственно.

В республике Тыва на долю КЭ приходилось 50,3%- примерно такую же долю составила заболеваемость КР — 46,8%. На долю ИКБ приходилось только 2,8%.

В 2007 г. наблюдалось увеличение доли КР, которая составила 53,2%, а также увеличение доли ИКБ до 3,9%, наряду с уменьшением доли КЭ до 42,8%.

В Иркутской области клещевой энцефалит составлял 60,8% в структуре заболеваемости клещевыми инфекциями. ИКБ составлял 35,2%. На долю клещевого риккетсиоза приходилось 4,1%.

В 2007 г. в данной структуре произошли существенные изменения: возросло долевое участие ИКБ (55,0%) — также увеличилась доля КР (10,9%). Доля КЭ, напротив, снизилась, составив 34,1%.

В Усть-Ордынском Бурятском автономном округе в 2000 г. большая часть клещевых инфекций приходилась на ИКБ, который составил 49,6%, тогда как на долю КЭ — 17,2%. Клещевой риккетсиоз составлял 33,1%.

В 2007 г. доли КЭ и ИКБ в структуре заболеваемости клещевыми инфекциями снизились, составив 10,8% и 44,0%, соответственно. Доля КР, напротив, возросла до 45,2%.

В республике Бурятия первое место в структуре заболеваемости клещевыми инфекциями занимал клещевой энцефалит — 65,3%- примерно одинаковые доли занимали ИКБ и КР — 16,7% и 17,9% соответственно.

В 2007 г. доля КЭ снизилась на 15%, составив 50,9%- тогда как доля ИКБ и JCP возросли (24,3% и 27,8%, соответственно).

В Читинской области в 2000 г. на долю клещевого энцефалита приходилось 58,9%. Клещевой риккетсиоз составлял 34,2%, тогда как иксодовый клещевой боррелиоз составлял 6,8%.

В 2007 г. додя КЭ в структуре заболеваемости возросла, составив 60,7%, также увеличилась доля ИКБ (16,9%). Доля КР, напротив, снизилась, составив 22,3%.

Таким образом, на территориях, находящихся в сходных климато-географических условия с Омской областью, наряду в КЭ и ИКБ регистрируется и КР, что даёт основание предполагать наличие очагов данной инфекции и на территории Омской области.

В республике Алтай наибольшая доля заболеваемости также принадлежала клещевому риккетсиозу, его доля в структуре заболеваемости клещевыми инфекциями составляла 62,7%- доля КЭ составляла 27,5%, а ИКБ — 9,8/%. В Томской области КЭ составлял 48,0%, ИКБ — 52,0%. В Кемеровской области 52,3% приходилось на клещевой энцефалит, 45,7% - ИКБ, 1,9% - КР. В Хакасии доля клещевого энцефалита составляла 27,6%, ИКБ — 17,3%, КР — 55,1%. В Красноярском крае 55,0% приходилось на КЭ, 28,0% - на ИКБ- 17,0% - на КР. В республике Тыва клещевой энцефалит и клещевой риккетсиоз составляли примерно одинаковые доли в структуре заболеваемости (53,2% и 42,8% соответственно), а на долю ИКБ приходилось 3,9%. В республике Бурятия на дол1р КЭ приходилось 50,9%, на долю ИКБ — 24,3%, на долю КР — 27,8%. В Иркутской области структура заболеваемости клещевыми цнфекциями была представлена следующим образом: КЭ — 34,1%- ИКБ — 55,0%, КР — 10,9%. В УОБАО на долю КЭ приходилось 10,8%, наибольшая доля заболеваемости клещевыми инфекциями принадлежала ИКБ, который составлял 44,0%, на долю КР приходилось 45,2%. В Читинской области КЭ составлял 60,7%, ИКБ — 16,9%, КР — 22,3%.

Причиной различных показателей заболеваемости в регионах РФ является широкий спектр факторов, влияющих на неё.

На регистрируемую заболеваемость оказывают влияние как природные, так ц социальные факторы. Заражённость клещей-переносчиков является, наверное, основным и самым важным фактором, оказывающим значительное влияние на показатели заболеваемости той или иной нозоформой. Немаловажное значение имеет и численность клещей на территории, которая в свою очередь зависит от комплекса биотических и абиотических факторов, экологии определённого вида клещей, а также вида и численности их прокормителей, качества проведения акарицидных обработок, характера климатических изменений в течение года, что создает, соответственно, более или менее благоприятные условия и для циркуляции инфекционного агента в природном очаге.

В формировании ареалов видов иксодовых клещей главными являются абиотические условия. Каждый вид в силу своих исторически выработавшихся биологических потребностей занимает то пространство, на котором обеспечен физическими условиями, необходимыми для полного завершения своего жизненного цикла Роль биотических условий проявляется, в основном, в количественном распределении клещей в пределах их ареалов по различным типам местообитаний. Для иксодовых клещей в целом характерна большая неравномерность в распределении на местности в пределах ареала, что связано с особенностями расселения их хозяев-прокормителей. Качественный и количественный состав населения клещей также находится в определённой связи с ландшафтными особенностями природных территориальных подразделений географической оболочки Земли и в значительной мере зависит от характера их хозяйственного использования. Следовательно, такие факторы как обеспеченность теплом и влагой, наличие прокормителей и характер распределения последних могут иметь индикационное значение при определении характера населения иксодовых клещей. (Вершинина Т.А., 1985) Из социальных факторов, влияющих на регистрируемую заболеваемость клещевыми инфекциями, главным является обращаемость населения в лечебно-диагностические учреждения по поводу присасывания клеща. Обращаемость населения складывается из различных компонентов, в том числе частоты контактов населения с очагами, сезонной активности клещей, уровнем информированности населения о риске заражения различными инфекциями при присасывании клеща, а также доступности медицинской помощи в территориальном и финансовом аспектах.

Такая мультифакториальность регистрируемой заболеваемости затрудняет проведение эпидемиологического анализа и прогнозирование заболеваемости, т.к. получаемые статистические данные как бы «размываются» таким множеством влияний.

Количество патогенов, которые могут передаваться человеку клещами, не ограничивается рассмотренными нами. К таким инфекционным агентам ртносятся также эрлихии, анаплазмы, бабезии, бартонеллы, и этот спектр, возможно, будет расширяться.

Нами впервые были разработаны и апробированы технологии молекулярно-биологических исследований, основанные на ПЦР-рестрикционном анализе, для дифференциации основных видов риккетсий, выявляемых в природных очагах Западной Сибири.

Применение рестрикционного анализа с использованием эндонуклеаз (Rsal и PstI) позволило нам чётко дифференцировать два вида риккетсий:

7. R. sibirica, включающая подвиды R. sibirica subsp. sibirica и R. sibirica subsp. BJ-90.

8. R. raoultii, врючающая геноварианты R.sp.DnS14, R.sp.DnS28, R.sp. RpA4,.

При исследовании клинического и полевого материала на наличие ДНК риккетсий получены следующие результаты: снятые переносчики в 18,7% содержали фрагмент гена цитрат-синтазы, клещи относились к виду D. reticulatus (10 образцов) и I. persulcatus (2 образца) и в 23,4%- фрагмент гена цоверхностного белка отрА (все клещи относились к виду D. reticulatus). Фрагмент гена отрА в клещах I. persulcatus обнаружен не был. Рестрикционный анализ показал вариант профилей, соответствующий виду R.raoultii.

Антиген вирусов комплекса клещевого энцефалита выявлен в 7,8% снятых клещей, все клещи относились к виду D.reticulatus. Наличие фрагмента гена ospA боррелий выявлено в 1 случае (1,6%) у клеща D.reticulatus.

Микст-инфицирование (антиген вируса клещевого энцефалита в ИФА и ген отрА риккетсий в ПЦР) было обнаружено в одном случае из клеща D.reticulatus.

При исследовании 62 образцов ДНК клещей из природных стаций фрагмент гена gltA выявлен в 17,7%, гена отрА — в 21,0%. При рестрикции получен вариант профилей, соответствующий R.raoulti.

Наши исследования показали, что использование для детекции риккетсий в клещах одного гена-мишени не выявляет все случаи инфицирования данными агентами, т.к. только небольшая часть проб (10,3% от 126 проб ДНК клещей) дала положительный результат на оба фрагмента гена риккетсий. Большая часть положительных проб (19,8% от 126 проб) была выявлена с праймерами на какой-то один ген-мишень из исследуемых двух (gltA и отрА). Используя оба праймера, мы можем выявить большее количество проб, содержащих ДНК риккетсий.

Из 45 образцов ДНК биоптатов положительными в ПЦР на фрагмент гена цитрат-синтазы оказались 14 (31,1%). С праймерами на фрагмент гена отрА положительный результат получен в 2,2% (1 проба). При рестрикции получен вариант профилей, соответствующий R.raoultii. Для подтверждения результатов исследований необходимо секвенирование полученных фрагментов.

Все образцы ДНК сывороток в ПЦР дали отрицательный результат, что вероятно, связано с поздним взятием крови у пациента для исследования.

Таким образом, используя молекулярно-генетические методы, нам удалось получить результаты, свидетельствующие о наличии ДНК риккетсии R. raoultii в полевом и клиническом материале, что позволяет предположить этиологическую роль данного вида риккетсий в развитии инфекционного процесса.

В Омской области в результате скрининга мелких диких млекопитающих с использованием ПЦР и секвенирования были выявлены бартонеллы известных видов: B. grahamii и B. taylorii, а также два генотипа, представляющие, вероятно, новые виды бартонелл [62].

Так как в РФ бартонеллёзы не регистрируются, нет возможности на данном этапе оценить распространённость этой инфекции.

Нами впервые получены данные ПЦР-скрининга переносчиков и мелких млекопитающих в Омской области, свидетельствующие о широком распространении в Западной Сибири бартонелл, этиологическая структура которых и роль в региональной инфекционной патологии требует дальнейшего изучения.

При исследовании мелких диких млекопитающих, отловленных в Омской области, ДНК бартонелл была выявлена у следующих видов грызунов: М. gregalis — узкочерепной полёвки в 1,1%, M. oeconomus — полёвки экономки (1,5%), CI. rutilus — красной полёвки (4,5%), A. agrarius — полевой мыши (0,8%), A. sylvaticus — лесной мыши (0,4%), Sorex araneus — обыкновенной бурозубки (0,4%).

Клещи I. persulcatus, снятые с людей, содержали ДНК бартонелл в 35,0%, одна проба содержала антиген вируса КЭ, микст-инфицирования обнаружено не было. При исследовании платяных вшей было выявлено 15,0% положительных проб.

Таким образрм, полученные данные свидетельствуют о заражённости бартонеллами диких мелких млекопитающих и иксодовых клещей в Омской области, однако для определения их видовой принадлежности необходимо секвенирование полученных фрагментов генов. Детекция бартонелл в органах диких млекопитающих и членистоногих переносчиках, снятых с людей доказывает возможность заражения человека при кровопитании переносчика.

Принимая во внимание полученные нами данные, необходимо ввести в информационную подсистему эпидемиологического надзора блок лабораторных исследований, направленных на детекцию и идентификацию в клещах и материале от пациентов риккетсий группы КПЛ, а также детекцию в клещах, диких мелких млекопитающих и материале от пациентов бартонелл с использованием ПЦР и рестрикционного анализа.