В работе гистологического отделения используется гематоксилин Эрлиха, железный гематоксилин Вейгерта, гематоксилин Майера. Эозин окрашивает оксифильные структуры клетки и ткани (цитоплазму, нервные и соединительнотканные волокна, белковые включения) в розовый цвет, эритроциты окрашиваются в оранжевый цвет.
Методика окрашивания гематоксилином и эозином применяется для гистологического исследования во всех случаях. Этим методом можно окрашивать целлоидиновые срезы, депарафинированные, парафиновые или замороженные срезы. Порядок окрашивания срезов гематоксилин — эозином следующий:
1) срезы переносят в дистиллированную воду;
2) окрашивают гематоксилином Эрлиха 2−5 мин;
3) промывают в дистиллированной воде;
4) затем промывают в водопроводной воде 3−5 мин;
5) осуществляют контроль под микроскопом;
6) дифференцируют 1% раствором хлористоводородной кислоты в 70° спирте 1−2 с;
7) быстро переносят срезы в водопроводную воду на 30 мин при частой смене; в водопроводной воде вишневая окраска ядер сменяется синей;
8) осуществляют контроль под микроскопом; если хроматин и ядрышко видны недостаточно четко, то дифференцировку следует повторить (срезы можно смотреть под большим увеличением, накрыв их покровным стеклом);
9) промывают в дистиллированной воде;
10) 1% водный раствор эозина 0,5−1 мин;
11) промывают в дистиллированной воде (и дифференцируют, так как вода смывает эозин); время промывки контролируют по цвету среза;
12) проводят обезвоживание, осветляют в ксилоле, заключают в бальзам. В спиртах эозин также отмывается, так что проводить срезы по спиртам следует быстро. Время окрашивания в гематоксилине нужно установить на первых 2 -3 срезах и затем все срезы данного блока окрашивать одинаково.
Дифференцировку в растворе хлористоводородной кислоты в спирте можно не проводить, но в этом случае структуры ядра будут менее четкими и в цитоплазме может быть синеватый фон. Окрашивание срезов может выполняться вручную с помощью гистологических «красящих батарей» или автоматически с использованием автостейнеров (рис. 10).
Рис. 10. Автостейнер для окрашивания гистологических препаратов Просветление и заключение срезов Одним из основных условий, определяющих пригодность гистологических препаратов к микроскопическому исследованию, является их прозрачность. Кроме того, препараты должны быть защищены от высыхания и загрязнения. Все это обеспечивается просветлением и заключением в специальные среды, которые можно подразделить на смешивающиеся с водой (глицерин, гуммиарабик, поливиниловый спирт, желатин) и не смешивающиеся с водой (ксилол, толуол, их смеси с фенолом, эфирные масла).
Смешивающиеся с водой просветляющие вещества одновременно являются средой для заключения и приготовления постоянных препаратов. Из этих сред чаще применяют глицерин-желатин. Используют также чистый глицерин, однако этот метод не позволяет приготовлять постоянные препараты.
Чаще в практической работе используются среды, не смешивающиеся с водой. Срезы или наклеенные на стекло, препараты тщательно обезвоживают в спиртах (70%, 96% и 100%), а затем помещают в любые из просветляющих веществ. Установлено, что для разных исследований предпочтительнее то или иное просветляющее вещество. Так, при окраске по Нисслю и методу Грам-Вейгерта лучшим просветляющим и одновременно дифференцирующим средством является анилиновое масло, но для просветления препаратов при окраске по Ван-Гизону его использование недопустимо. Наиболее распространенными и индифферентными по отношению к красителям веществами являются толуол и ксилол, а также их смеси с фенолом.
Хорошо обезвоженные в спиртах и просветленные в карбол-ксилоле, а затем в чистом ксилоле препараты готовы к заключению в специальные смолы. С этой целью применяют смолы тигельного происхождения — бальзамы (канадский, пихтовый и сибирский кедровый). Все они хорошо растворяются в толуоле и ксилоле.
В практической работе широко используют синтетическую пластмассу — полистирол. Он хорошо растворяется в ксилоле и толуоле, прозрачен и быстро затвердевает под предметным стеклом, образуя тончайшую пленку. Однако со временем полистирол становится хрупким, в пленке появляются трещины, что затрудняет микроскопическое исследование и совершенно неприемлемо для микросъемки. Для предотвращения этих недостатков в 30% раствор полистирола в ксилоле добавляют пластификатор, придающий пластичность и гибкость, устраняя все недостатки полистирола. В настоящее время в качестве пластификатора используют дибутилфталат, широко применяемый в электронной микроскопии.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СРОКА ДАВНОСТИ ИНФАРКТА ГОЛОВНОГО МОЗГА Согласно официальным данным министерства здравоохранения России за последние годы, смертность от болезней системы кровообращения занимает первое место и при этом продолжает неуклонно расти. Примерно 56,1% умерших составляют умершие от болезней сердечно-сосудистой системы.
Смертность от инфаркта головного мозга находится на втором месте, уступая лишь смертности от ишемической болезни сердца. Суммарные показатели заболеваемости и смертности от ишемического и геморрагического инфаркта головного мозга во многих странах мира имеют тенденцию к росту. Ишемические инфаркты составляют 70−85% от всех случаев инсульта, Соотношение частоты ишемических и геморрагических типов инфаркта мозга составляет 4:
1. Для определения роли этой патологии в наступлении смерти большое значение имеет определение давности ишемического инфаркта головного мозга, которое проводится по результатам гистологических исследований.
Материал и методы исследования Исследования проводились врачом — судебно-медицинским экспертом гистологического отделения КУ НАО «Бюро судебно-медицинской экспертизы», препараты для исследования были приготовлены лаборантом-гистологом по стандартной методике.
Давность инфаркта головного мозга оценивалась по макрои микроскопическим признакам. Макроскопически изучались размягчение в зоне инфаркта, демаркационная линия, формирование кисты, состояние мягкой мозговой оболочки, цвет очага инфаркта. При гистологическом исследовании оценивались некротические изменения, отек, лейкоцитарная и лимфоидная инфильтрация, реакция макроглии, состояние кровеносных сосудов.
Изучено 25 гистологических препаратов ишемического инфаркта головного мозга. Микропрепараты были исследованы при помощи микроскопа Nicon eclipse i80 при малом и большом увеличении (х100, х400). Микропрепараты фотографировались при помощи цифровой камеры Nikon и персонального компьютера на базе Intel Pentium 4.
Результаты исследования В 1−3 сутки от начала развития инфаркта определялось макроскопически незначительное размягчение вещества мозга в очаге повреждения, вещество мозга имело сотовидный вид. При гистологическом исследовании определялось незначительное количество сегментоядерных лейкоцитов (рис. 11).
Рис. 11. Инфаркт головного мозга 3 сут., окр. гематоксилином и эозином, х 100.
На 4−6 сутки макроскопически: вещество мозга имело дряблую консистенцию, по периметру повреждения определялась зона отека шириной 2−4 мм. При гистологическом исследовании: сегментоядерные лейкоциты составляли до ¼ от всего клеточного состава. В веществе мозга отмечено начало образования мелких сосудистых щелей (рис. 12).
Рис. 12. Инфаркт головного мозга 6 сут, окр. гематоксилином и эозином, х 100.
8−11 сутки: — вещество мозга имеет кашицеобразную консистенцию, отчетливо определяется демаркационная зона. При гистологическом исследовании — начало образования зернистых шаров (рис. 13).
Рис. 13. Инфаркт головного мозга: зернистые шары, гематоксилином и эозином, х 100.
На 12−18 сутки имелось отчетливое формирование демаркационной зоны по всему периметру очага повреждения, отмечено начало образования кисты. Микроскопически: наличие зернистых шаров до ¼ от всего клеточного состава, выраженная сосудистая реакция.
19−21 сутки — вещество мозга кашицеобразное, отчетливое формирование демаркационной зоны, начало образования демаркационной полости. Гистологически: зернистые шары составляют 1/5−¼ всего клеточного состава, сосудистая реакция значительно выражена, эндотелиальные клетки составляют до ¼−1/3 всего клеточного состава.
Данные о гистологическом строении инфаркта головного мозга на разных сроках давности представлены в табл. 2.
Таблица 2.
Микроскопические критерии давности инфаркта головного мозга Признаки Давность инфаркта, сут 0,5 1 3 5 7 15 21 Отек ++ +++ ++++ ++++ ++/+++ + + Некроз + +++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ Лейкоциты + ++ ++++ +++ ++ + + Макрофаги — - ++ +++ ++++ ++++ ++ Лимфоциты — - - ++ +++ ++ ++ Сосуды — + ++ +++ +++ ++++ ++++.
Изменения, возникающие при инфаркте головного мозга, оценивались при увеличении х100 в 5 полях зрения полуколичественным методом. Выраженность изменений оценивалась по следующей шкале:
+ - очень слабо выраженная реакция.
++ - слабо выраженная реакция.
+++ - выраженная реакция.
++++ - значительно выраженная реакция ЗАКЛЮЧЕНИЕ Правильное взятие материала для гистологического исследования и удовлетворительное качество гистологических и гистохимических препаратов во многих случаях позволяет установить прижизненное или посмертное происхождения повреждений, сроки причинения прижизненных повреждений и решить ряд других важных вопросов.
В связи с существующими в судебной медицине рекомендациями по применению в практической работе гистохимических методик следует отметить, что оценка результатов таких исследований на судебно-медицинском материале, особенно количественная, требует большой осторожности и опыта.
Часть из того, что выявляется при гистологическом исследовании судебно-медицинского материала, выходит за рамки экспертных задач и приобретает общебиологическое значение. Поскольку от травм часто погибают здоровые люди, изменения в организме можно рассматривать как закономерное проявление его реакции в условиях «эксперимента жизни».
Судебному медику крайне важно не только знать изменения при тех или иных видах смерти, но и уметь правильно их оценить при исследовании препаратов, исключив ошибочные трактовки, которые могут возникать за счет некачественной гистологической обработки материала и неправильной фиксации. Это обязывает эксперта знать основные правила и приемы гистологической техники.
В случаях смерти от инфаркта головного мозга давность патологического процесса оценивалась по макрои микроскопическим признакам. Макроскопически изучались размягчение в зоне инфаркта, демаркационная линия, формирование кисты, состояние мягкой мозговой оболочки, цвет очага инфаркта. Микроскопически оценивались некротические изменения, отек, лейкоцитарная и лимфоидная инфильтрация, реакция макроглии, состояние кровеносных сосудов.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Аверьянова Т. В. Судебная экспертиза. Курс общей теории. — М.: Норма, 2006. — 480 с.
Алиев И.А., Аверьянова Т. В. Концептуальные основы общей теории судебной экспертизы. — Баку, 1992. — 257 с.
Арсеньев В.Д.
Заключение
эксперта в уголовном процессе // Социалистическая законность. — 1973. — № 4. — С. 29−32.
Афанасьев Ю. И. Гистология / Ю. И. Афанасьев, Н. А. Юрина. — М.: Медицина, 2002. — 744 с.: ил.
Белкин Р. С. Криминалистика: проблемы, тенденции, перспективы. От теории к практике. — М., 1988. — 615 с.
Белкин Р. С. Собирание, исследование и оценка доказательств. Сущность и методы. — М.: Юрид. лит., 1966. — 170 с.
Бородин С.В., Палиашвили А. Я.. — Вопросы теории и практики судебной экспертизы. — М.: Госюриздат, 1963. — 180 с.
Бурков И.В., Мурзиков А. В.
Заключение
эксперта как вид доказательств. — Транзит-Икс, 2001. — 328 с.
Ванеева Л. А. Судебное познание в советском гражданском процессе. — Владивосток, 1972. — 180 с.
Гончаренко В. И. Использование данных естественных и технических наук в уголовном судопроизводстве. — Киев: Выща школа, 1980. — 240 с.
Горский Г. Ф., Кокорев Л. Д., Элькинд П. С. Проблемы доказательств в советском уголовном процессе. — Воронеж, 1978. — 290 с.
Гражданское процессуальное право России / Под ред. М. С. Шакарян. — М.: Былина, 1998. — 420 с.
Давтян А. Г. Экспертиза в гражданском процессе. — М., 1995. — 230 с.
Дулов А. В. Вопросы теории судебной экспертизы. Минск, изд-во Белорус.
ун-та, 1959. — 230 с.
Жбанков В. А. Получение образцов для сравнительного исследования. — М., 1992. — 178 с.
Жилин Г. А. Экспертиза по гражданскому делу в судебной практике // Комментарий российского законодательства. — М., 1995. — 160 с.
Зайцев И. М. Судебное решение как процессуальный документ // Российская юстиция. — 1995. — № 4.
Лупинская П.А. О понятии судебных доказательств // Учен. Зап. ВЮЗИ. Вып. 71.
— М., 1968. — С. 52.
Орлов Ю.К.
Заключение
эксперта и его оценка (по уголовным делам). — М., 1995. — 180 с.
Основы судебной экспертизы. Часть 1. Общая теория. — М., 1997. — 280 с.
Палиашвили А.Я.
Заключение
эксперта как один из источников доказательств // Советская юстиция. — 1971. — № 12. -32 с.
Педенчук А.К.
Заключение
судебного эксперта: логика, истинность, достоверность. Докт. дис. — М., 1995 − 508 с.
Ратинов А. Р. Вопросы познания в судебном доказывании // Сов. Государство и право. — 1964. — № 8. -14 с.
Механизм наступления смерти.
