Молекулярно-клеточные механизмы геморрагического инсульта (в экспериментальном исследовании)

АКТУАЛЬНОСТЬ.

Заболеваемость геморрагическим инсультом представляет собо*Ь значительную социально-экономическую проблему для современного общества. Летальность в остром периоде кровоизлияния составляет 40−50%, а инвалидизация пациентов достигает 75%. Геморрагический инсульт составляет 15% от всех инсультов в США и Европе и 20−30% у населения в Азии. Последствия, тяжесть протекания заболевания и смертность от геморрагического инсульта значительно выше, чем при ишемическом инсульте. Основными этиологическими факторами-геморрагического инсульта являются гипертоническая болезнь (в 80−85% случаев) (Quereshi et al., 2009; Taylor, Quereshi, 2009), врожденные и приобретенные артериальные и артерио-венозные аневризмы (O'Brien et al., 1999; Cheung, 2007; Gii-Nunez, Vivancos-Mora, 2005; Abaso va, 2009; Schrader, 2009).

Инсультом называют повреждение мозговых структур головного мозга в результате острого нарушения мозгового кровообращения. При разрыве кровеносного сосуда головного мозга вследствие кровоизлияния в мозг (контакта плазмы и форменных элементов’крови с мозговыми структурами) развивается геморрагический инсульт. При спазме или закупорке кровеносного сосуда головного мозга — ишемический инсульт (инфаркт мозга). В большинстве случаев инсульт вызывает стойкие необратимые изменения в ЦНС, приводящие к инвалидности. В мире ежегодно заболевает инсультом около 16 млн. человек, а около 30−60 млн. находятся в зоне риска развития этого заболевания. Среди больных старше 25 лет заболеваемость и смертность увеличиваются примерно в 2−3 раза с каждым последующим десятилетием. Среди выживших до 80% пациентов остаются до конца жизни инвалидами, нуждающимися в посторонней помощи и финансовой поддержке государства, а 33% - полностью зависят от помощи окружающих и остро нуждаются в длительной и дорогостоящей медико-социальной реабилитации (Одинак, Вознюк, 2000). Геморрагические инсульты инвариантны к полу и возрасту больных, хотя с возрастом частота заболевания возрастает, но в то же время имеет место тенденция развития геморрагического инсульта у более молодых людей, у которых присутствует более двух сопутствующих заболеваний (Lee et al., 2007; Pathak, Sloan, 2009). Особенности в уровне и образе жизни и состоянии окружающей среды, (Bejot et al., 2007), метереологические, сезонные, психоэмоциональные и циркадные ритмы (Jimenez-Conde et al., 2008) имеют большое значение в заболеваемости и смертности от геморрагического инсульта. Мозговой инсульт часто сопровождается нарушением когнитивных процессов, зрительного восприятия, наблюдаются нарушения абстрактного мышления, вербальнойпамяти, функции речи у подавляющего числа пациентов (60−70%) (Nys et al., 2007; Gamaldo et al., 2006).

Патофизиология геморрагического инсульта, изучаемая, в основном, в моделях in vivo, описывает изменения физиологического статуса и ряда поведенческих параметров. Остается совершенно неисследованной проблема функциональнойактивности нервных клеток в самые ранние периоды патологии. Известно, что процесс нейродегенерации под действием возбуждающих аминокислот, связанный с нарушением работы возбуждающих глутаматных рецепторов нейронов, является ключевым механизмом инсульта (Garthwaite, 1991; Domoki et al., 2002; Bonvento et al., 2002; Aarts et al., 2003; Kang et al., 2005; Fellin et al., 2006). Однако не известно, как кровь, ее компоненты и продукты ее лизиса воздействуют на нейрональную активность, какова динамика нарушения электрогенеза нервной ткани, которая приводит к гибели нейронов, и, в конечном счете, разрушает деятельность мозга. Важно также представлять, каким образом артериальная гипертензия, которая является одним из основных факторов развития геморрагического инсульта, влияет на функционирование как механизмов электрогенеза нервных клеток мозга, так и более сложных процессов — пластических модификаций мозга.

Для того, чтобы ответить на эти и другие вопросы, были проведены электрофизиологические исследования in vitro, в которых с первого момента контакта нервной ткани с кровью on-line фиксировались изменения активности нейронов, обусловленные как возбуждающими, так тормозными механизмами. В настоящей работе для раскрытия молекулярно-клеточных механизмов возникновения, патогенетических процессов, при развитии геморрагического инсульта были разработаны и исследованы два' типа моделирования геморрагического инсульта in vitro на переживающих срезах мозга. Первый тип моделирования позволяет исследовать «электрогенез при развитии патологических процессов, развивающихся в нервной ткани в начальный период времени после действия аутокрови (до 40 мин). Второй тип моделирования дает возможность изучать молекулярно-клеточные механизмы процессов, происходящих в более поздние периоды времени развивающегося геморрагического инсульта (до 7 часов).

Эти типы моделирования геморрагического инсульта in vitro являются единственными в настоящее время подходами, применение которых позволило не только исследовать динамику нарушений синаптической глутаматергической и ГАМК-эргической активности нейронов в мозге, но и активно воздействовать на. них, используя протективные вещества, способные защитить процессы электрогенеза нервной ткани от блокады и разрушения.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: изучение молекулярно-клеточных механизмов повреждения нервных клеток при их контакте с кровью после кровоизлияния в мозг у гипертензивных крыс линии SHR, а также усовершенствование принципов защиты и восстановления функций нервных клеток после геморрагического инсульта.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Используя методы электрофизиологического определения амплитуд параметров1 фокальных потенциалов в срезах мозга, выявить различия в базисных синаптических процессах при устойчивой гипертензии. Провести сравнение базисных характеристик возбуждающей глутаматергической и тормозной ГАМКергической синаптических передач в переживающих срезах обонятельной коры мозга гипертензивных крыс линии SHR и крыс линии.

Вистар, использованных в качестве контроля. Исследовать различия в развитии процессов наученияв переживающих срезах мозга крыс этих линий.

2. Разработать надежные и воспроизводимые* типы модели геморрагического инсульта, позволяющие регистрировать изменения параметров фокальных потенциалов in vitro на переживающих срезах обонятельной коры мозга крыс линии SHR, происходящих как в начальный момент воздействия целой аутокрови и ее отдельных фракций, так и в отставленные периоды времени. Изучить изменения параметров возбуждающей глутаматергической и тормозной ГАМКергической синаптических передач в переживающих срезах обонятельной коры мозга I гипертензивных крыс линии SHR в первые часы контакта с кровью в моделях in vitro.

3. На основании данных о повреждениях синаптических механизмов при действии аутокрови определить срок от начала действия аутокрови до того момента, когда наступает необратимая гибель нервных клеток -«терапевтическое окно». Определить длительность «терапевтического окна» в I переживающих срезах мозга при воздействии на них аутокрови. I.

4. Исследовать, динамику развития отека в срезах обонятельной коры мозга, возникающего' при моделировании геморрагического инсульта под I действием сгустка аутокрови.

5. Изучить роль глутаматных ионотропных и метаботропных рецепторов в развитии отека в срезах мозга при действии аутокрови.

6. Используя вовлеченность глутаматэргических и ГАМКэргических ионотропных рецепторов в нарушение механизмов работы нейронов при контакте с кровью, осуществить поиск нейропротекторов эндогенного происхождения, способных протектировать функционирование этих рецепторов при геморрагическом инсульте in vitro.

7. Разработать способ определения физиологической активности в нервной системе белка теплового шока с молекулярной массой 70 кДа.

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ ПОЛОЖЕНИЯ:

1. Чувствительность АМПА и НМДА подтипов глутаматных рецепторов в срезах гипертензивных крыс на естественный медиатор снижена^ по сравнению с чувствительностью глутаматных рецепторов в срезах нормотензивных крыс, что свидетельствует о десенситизация этих рецепторов при гипертензии. Это может иметь значение в механизмах когнитивных нарушений у гипертензивных крыс.

2. При моделировании геморрагического инсульта in vitro аппликация аутокрови на срезы обонятельной коры мозга (гипертензивных) крыс оказывает негативное и необратимое воздействие на синаптическую передачу в нервных клетках, а также на АМПА и НМДА глутаматные рецепторы.

3. В развитие отека нервной ткани срезов мозга при воздействии аутокрови вовлечены ионотропные глутаматные рецепторы, модуляция активности которых специфическими антагонистами, а также рядом выявленных соединений эндогенной природы, оказывает протективный эффект.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Впервые разработаны два типа модели геморрагического инсульта in vitro на переживающих срезах мозга. Первая тип из них позволяет исследовать молекулярно-клеточные механизмы процессов, развивающихся в нервной ткани в ранние периоды времени после действия аутокрови. Вторая тип — в более поздние периоды времени развивающегося геморрагического инсульта (патенты на изобретение № 2 307 396 РФ и № 2 340 951 РФ).

Впервые получены сведения о том, что действие аутокрови активирует развитие множественных, последовательно и параллельно протекающих процессов в нервной системе: гиперактивация глутаматных рецепторов, развитие процессов эксайтотоксичности, эпилепсия, блокада механизмов электрогенеза, развитие отека нервных клеток и др.

Впервые показано, что при действии крови на нервные клетки они реагируют фазно: первоначальная активация и последующее угнетение, заканчивающееся необратимой блокадой механизмов электрогенеза.

Впервые установлено, что наиболее уязвимыми механизмами электрогенеза являются НМДА-зависимые и ГАМКергические механизмы. Именно они первыми разрушаются под действием крови. Эти данные необходимо использовать при разработке нейропротективных препаратов.

Впервые установлено, что молекулы-индукторы, вызывающие эпилептическое состояние, находятся в плазме крови (патент на изобретение № 2 359 271 РФ и № 2 361 221 РФ).

Впервые определена длительность «терапевтического окна» — 6−7 час.

Впервые установлено, что при воздействии крови в нервной ткани развивается отек, который реализуется посредством гиперактивации глутаматных ионотропных и метаботропных рецепторов.

Впервые найдено, что водорастворимая форма витамина Е препятствует развитию отека при моделировании геморрагического инсульта (патент на изобретение № 2 359 272 РФ).

Впервые выявлены протективные эффекты веществ — дипептида Ь-карнозина (патент на изобретение № 2 360 295 РФ), БТШ70 (патент на изобретение№ 2 359 337 РФ), гепарина (патент на изобретение № 2 361 283 РФ).

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Изучение динамики нарушений биоэлектрической активности нейронов, происходящих в мозге в самые ранние сроки геморрагического инсульта, имеет не только важный теоретический интерес, но перспективно и для клинического применения. Знание механизмов формирования патологии в ЦНС при контакте нервной ткани с кровью, приводящее к прекращению синаптической деятельности нейронов, дает возможность поиска путей их регуляции или компенсации, и полученные результаты могут быть использованы в целенаправленном поиске нейропротективных средств.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы исследования изложены в 34 публикациях и материалах российских и международных конференций, 17 из которых в журналах, рекомендованных ВАК, РФ.' Автором получено* 9 патентов на изобретение, зарегистрированные в ФИПС.

Представленные в диссертации материалы были доложены, на: IV всероссийской конференции с международным участием «Механизмы адаптивного поведения», посвященной 80-летию организации Института физиологии им. И. П. Павлова РАН, (Санкт-Петербург, 2005), на XI международной научно-практической конференции «Пожилой больной. Качество жизни» (Москва, 2006), на V всероссийской конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения В. Н. Черниговского «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2007), на конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы, формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (СПб-Колтуши, 2008), международной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты применения* биологически активных соединений» (Украина, 2009), международной научной конференции «Закономерности развития патологических состояний и их коррекция» (Минск, Беларусь, 2009), XIV международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Тель-Авив, Израиль, 2009), четвертой всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2009). Был изложен доклад на Всемирном Научном Конгрессе МВАК МУФО, 20 января, Санкт-Петербург, 2009, Report «National Health Project — L-carnosine» at the 2nd International Conference of Medical Sciences, 28th — 30th March, 2010, Erbil, Kurdistan, Съезд, XXI. докл. XXI съезда Физиол. о-ва им. И. П. Павлова, 19−25 сентября, Калуга, 2010. Кроме того, представленные в диссертации материалы были доложены на Всероссийской конференции с международным участием, поев. 85-летию со дня основания Инт-та физиологии им. И. П. Павлова РАН.

Механизмы регуляции физиологических систем организма в процессе адаптации к условиям среды", 7−9 декабря, Санкт-Петербург, 2010.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 441 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы, из них 100 отечественных и 840 зарубежных авторов. Работа проиллюстрирована 20 таблицами и 27 рисунками.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.