Молекулярный механизм реакций расщепления и элонгации РНК-транскрипта, катализируемых ДНК-зависимой РНК-полимеразой E. coli

Атом кислорода в proR положении фосфатной группы первого неспаренного нуклеотидного остатка РНК не участвует в координации Ме-Н, но необходим для катализа эндонуклеазнго расщепления.96.

Влияние присутствия дезоксирибонуклеинового остатка в РНК на скорость эндонуклеазного расщепления.99.

Роль нуклеотидной части первого неспаренного остатка РНК в эндонуклеазном расщеплении.99.

Роль первого неспаренного нуклеотидного остатка РНК, расположенного в +1 положении относительно i+1 сайта, в Gre-зависимом эндонуклеазном расщеплении.102.

Построение молекулярной модели эндонуклеазной реакции.104.

Пуриновое основание первого неспаренного нуклеотидного остатка РНК участвует в катализе эндонуклеазной реакции.106.

Заключение

: молекулярный механизм Gre-независимой эндонуклеазной реакции.106.

III. Влияние мутационных замен в активном центре РНК-полимеразы на реакции синтеза и деградации.108.

Выбор и получение мутационных замен в активном центре.

РНК-пол имеразы.108.

РНКП с мутационными заменами имеют дефекты в скорости элонгации и увеличенные значения Km для нуклеотидных субстратов.109.

Мутационная замена ED813,814AA не влияет на связывание каталитического иона Mg-II в реакции синтеза тримера CpApU.113.

Анализ влияния мутационных замен в активном центре РНКП на 3'-5'-экзонуклеазную активность.114.

Мутационный анализ Е-сайта.117.

Пирофосфат в активном центре РНКП может связываться двумя альтернативными путями.119.

Влияние рН на скорость реакций гидролитического расщепления РНК, катализируемых мутантными РНК-полимеразами.120.

Влияние мутационных замен на эндонуклеазную реакцию.122'.

Анализ способности к бэктрэкингу РНКП с мутационными заменамиметодом Ft?*-индуцированного расщепления.125.

Заклю чение.127.

IV. Обсуждение результатов.130.

Сравнение различных структурных моделей комплекса РНКП с транскрипционными факторами расщепления.130.

Структурная модель комплекса РНКП/GreB, полученная на основе рентгеноструктурного анализа с разрешением 15 А.130.

Биохимический анализ взаимодействия РНКП с Gre.133.

Сравнение различных структурных моделей комплекса РНКП/Gre.134.

ВЫВОДЫ.137.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.138.

БЛАГОДАРНОСТИ.139.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.140.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ТЕРМИНОВ.

РНКП — ДНК-зависимая РНК-полимераза.

ТЭК — транскрипционный тройной элонгационный комплекс dNTP, NTP — дезоксирибои рибо-5'-трифосфат dNDP, NDP — дезоксирибои рибо-5'-дифосфат dNMP, NMP — дезоксирибои рибо-5'-монофосфат оцДНК/РНК — одноцепочечная ДНК/РНК п.н. — пар нуклеотидов а.к. — аминокислотный остаток нт. — нуклеотид.

НК — нуклеиновая кислота.

BSA — бычий сывороточный альбумин.

DTTдитиотреитол.

EDTA — этилендиаминтетрауксусная кислота.

IPTG — изопропил-Р-тио-В-галактопиранозид.

PMSF — фенилметилсульфонилфторид.

SDS — додецилсульфат натрия.

ПААГ — полиакриламидный гель.

PCR — полимеразная цепная реакция.

ТСХ — тонкослойная хроматография.

DMF — диметилформамид.

PIPES — 1,4-пиперазинбис (этансульфокислота).

PMSF — фенилметилсульфонилфторид.

Tris — 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол.

CAPS — З-циклогексиламин-1-пропан сульфокислота (СбНцЫЩСНг^ОзН).

HIV-RT — обратная транскриптаза вируса иммунодефицита человека бэктрэкинг — движение РНКП в обратном транскрипции направлении по ДНК матрице, приводящее к остановке элонгации в следствие потери контакта между 3'-концом РНК транскрипта и активным центром РНКП, и образованию одноцепочечного 3'-концевого фрагмента РНК паузирование — временная остановка транскрипции, вызванная определенными внешними или внутренними сигналами «внутренняя» эндонуклеазная реакция — реакция расщепления 3'-концевого фрагмента РНК, катализируемая только РНКП в отсутствие внешних факторов (Gre-независимая, нестимулируемая) Gre-зависимая эндонуклеазная реакция — реакция расщепления 3'-концевого фрагмента РНК, катализируемая РНКП в присутствии Gre факторов.

Актуальность проблемы.

Основной каталитической функцией ДНК-зависимых РНК-полимераз (РНКП) является образование фосфодиэфирной связи в ходе полимеризации РНК. Кроме того, РНКП обладают эндонуклеазной активностью, благодаря которой происходит гидролитическое отщепление З'-концевого фрагмента РНК. Эта реакция осуществляется в тех случаях, когда в процессе элонгации активный центр утрачивает контакт с 3'-концом РНК-транскрипта в результате «соскальзывания» РНКП в обратном направлении (процесс бэктрэкинга), в результате чего элонгационный комплекс временно или необратимо инактивируется. Гидролитическое отщепление перешедшего в одноцепочечное состояние З'-концевого фрагмента РНК приводит к образованию нового 3'-конца РНК, способного к дальнейшему удлинению.

Прокариотические белковые факторы GreA, GreB и их эукариотический аналог TFIIS, взаимодействуя с РНКП, резко увеличивают скорость эндонуклеазного расщепления РНК. В их присутствии увеличивается эффективность и точность транскрипции in vivo и in vitro, а также существенно уменьшается время прохождения транскрипционных пауз (Borukhov et al., 1993; Izban and Luse, 1992a, Erie et al., 1993).

По аналогии с односубъединичными ДНКи РНК-полимеризующими ферментами было предположено, что многосубъединичные РНКП осуществляют полимеризацию РНК с участием двух ионов двухвалентных металлов (Steitz, 1998). Однако,. полученные к началу данной работы структурные и биохимические данные позволили надежно идентифицировать только один каталитический ион Mg2+, прочно удерживаемый в активном центре тремя абсолютно консервативными остатками аспартатов универсального мотива NADFDGD. Ни одна из полученных в настоящее время трёхмерных структур РНКП, в том числе структура тройного комплекса дрожжевой РНКП, четкого доказательства присутствия в активном центре второго иона Ме2+, участвующего в полимеризации РНК, не представила. В различных структурах он либо отсутствует, либо связан в разных положениях относительно первого иона Mg и не удовлетворяет условиям катализа с участием двух ионов Ме2+. Роль ионов магния в реакции эндонуклеазного расщепления к началу данной работы была практически не изучена.

Когда данная работа только начиналась, в нашей лаборатории была обнаружена реакция 3'-5' экзонуклеазного расщепления РНК-транскрипта РНКП Е. coli. Было установлено, что 3'-5' экзонуклеазное расщепление происходит с низкой скоростью и требует высоких концентраций ионов Mg2+. В присутствии некомплементарного NTP реакция резко ускоряется и требует значительно меньших концентраций ионов Mg2+ (Сосунов, 2003). Эти наблюдения свидетельствуют о присутствии в активном центре второго, слабосвязанного каталитического иона Mg, стабилизируемого некомплементарным NTP. Эти данные послужили отправной точкой для выдвижения в нашей лаборатории гипотезы единого механизма всех реакций, катализируемых РНКП, в основе которой лежит предположение о том, что второй ион Mg2+ во всех реакциях, катализируемых РНКП, располагается в одном и том же месте активного центра, но может требовать дополнительной стабилизации, специфичной для каждого типа реакций.

Цель работы и задачи исследования.

Целью работы являлась проверка двуметаллической модели единого активного центра РНКП E. coli, в котором катализируются все известные активности этого фермента, и построение молекулярных моделей для реакций эндонуклеазного расщепления РНК в присутствии и в отсутствие Gre факторов, катализируемых РНКП с участием двух ионов Mg2+.

В работе ставились следующие задачи:

1. Выяснить природу эффекта стимуляции эндонуклеазной активности РНКП E. coli транскрипционными факторами расщепления GreB и GreA.

2+.

2. Изучить роль 3'-концевого фрагмента РНК в удержании второго иона Mg при эндонуклеазной реакции в присутствии и в отсутствие факторов расщепления.

3. Выяснить влияние аминокислотных остатков, расположенных в непосредственной близости от активного центра РНК-полимеразы, на каталитическую активность РНКП в реакциях экзои эндонуклеазного расщепления и полимеризации.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В работе продемонстрировано, что прокариотические факторы расщепления GreA и GreB резко увеличивают константу связывания второго каталитического иона Mg2* (Mg-П) в активном центре РНКП Е. coli. На основании биохимического и мутационного анализа, а также молекулярного моделирования комплекса РНКП с GreB, предложен механизм стимулирующего эндонуклеазное расщепление действия Gre белков, согласно которому два инвариантных аминокислотных остатка D41 и Е44, расположенных в концевой петле N-концевого домена Gre фактора, непосредственно участвуют в координации каталитического иона Mg-II в активном центре РНКП и катализе реакции в процессе эндонуклеазного расщепления.

Продемонстрировано, что первый неспаренный З'-концевой нуклеотидиый остаток РНК-транскрипта, расположенный в +1 положении относительно i+J сайта активного центра РНКП, способствует Gre-независимой эвдонуклеазной реакции: 1) путем предоставления фосфатной группы для дополнительной стабилизации и координации каталитического иона Mg-II и катализа- 2) в случае, если в указанном положении находится остаток пуринового нуклеотида, — путём предоставления атома N7 пуринового основания для катализа реакции.

Показано, что в присутствии каталитически неактивных Gre факторов с мутационными заменами D41N и E44Q ингибируется Gre-независимая «внутренняя» эндонуклеазная реакция. Предположено, что в присутствии Gre факторов изменяется положение фосфатной группы в +1 положении относительно i+1 сайта активного центра, в результате чего происходит ингибирование Gre-независимой эвдонуклеазной реакции.

Изучена роль фосфатной группы первого неспареного З'-концевого нуклеотидного остатка РНК в реакции эндонуклеазного выщепления динуклеотида в присутствии Gre факторов. Показано, что присутствие фосфатной группы в этом положении (+1 положение относительно i+1 сайта активного центра) необходимо для действия Gre факторов.

С учетом двуметаллической модели активного центра РНК-полимеразы К coli построены молекулярные модели для Gre-независимой и Gre-зависимой эндонуклеазных реакций.

Проведен мутационный анализ активного центра РНКП К coli и изучена роль остатков Е813, D814, R1106, R678, К1073 р-субъединицы и остатков N458 и R731 р'-субъединицы в реакциях расщепления и удлинения РНК-транскрипта.

Результаты данной работы подтверждают развиваемую в нашей лаборатории концепцию единого двуметаллического механизма всех реакций, катализируемых единственным активным центром РНКП, в формировании которого кроме РНК-полимеразы принимают участие различные компоненты транскрипционного элонгационного комплекса.

Апробация работы: Материалы диссертационной работы были представлены на Международных конференциях «Prokaryotic transcription initiation», 2001 и 2003, Saxtons River, Vermont, USA.

Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста и содержит 61 рисунок. Библиография включает 190 названия.

выводы.

1. Прокариотические транскрипционные факторы расщепления GreA и GreB приводят к увеличению связывания второго каталитического иона Mg2+ в активном центре РНКП Е. coli.

2. Предложена модель стимулирующего действия Gre факторов, согласно которой абсолютно консервативные аминокислотные остатки Asp41 и Glu44, расположенные на конце N-терминального домена, принимают прямое участие в катализе реакции эндонуклеазного расщепления РНК путем координации каталитического иона Mg-II и, по-видимому, координации атакующего гидроксила воды.

3. Фосфатная группа нуклеотидного остатка РНК, расположенного в +1 положении относительно i+1 сайта активного центра РНКП Е. coli принимает участие в катализе Gre-независимого эндонуклеазного расщепления.

4. Скорость Gre-независимой эндонуклеазной реакции увеличивается на порядок, когда в +1 положении относительно i+1 сайта находится остаток пуринового нуклеотида, N7 атом которого участвует катализе реакции.

5. Построена структурная модель тройного элонгационного комплекса РНКП с GreB и модель для Gre-независимой реакции эндонуклеазного расщепления.

6. Проведен анализ мутационных замен в активном центре РНК-полимеразы Е. coli PED813,814AA, PR1106A, PR678A, РК1073А, P’N458A, P’R731A. Результаты анализа использованы при построении двуметаллической модели единого активного центра РНКП и модели для нестимулируемой эндонуклеазной реакции.

7. Мутационные замены а.к. остатков R1106, R678, К1073 Р-субъединицы, особенно R678, приводят к нарушениям в связывании фосфатной части NTP в активном центре РНКП.

8. Мутационные замены а.к. остатков N458 и R731 Р'-субъединицы приводят к уменьшению стимулирующего эффекта некомплементарного NTP на скорость 3'-5' экзонуклеазной реакции и ухудшению связывания этого NTP, что подтверждает существование и структурное расположение Е-сайта.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Sosunov V, Sosunova Е, Mustaev A, Bass I, Nikiforov V, Goldfarb A. (2003) Unified two-metal mechanism of RNA synthesis and degradation by RNA polymerase. EMBO J. 22(9): 2234−44.

2. Sosunova E, Sosunov V, Kozlov M, Nikiforov V, Goldfarb A, Mustaev A. (2003) Donation of catalytic residues to RNA polymerase active center by transcription factor Gre. Proc Natl Acad Sci USA. 100(26): 15 469−74.

3. Sosunova E, Sosunov V, Nikiforov V, Goldfarb A, Mustaev A. RNA assists self-cleavage in backtracked transcription complexes by catalytic Mg2±II ion stabilization. FASEB summer research conference «Mechanism and regulation of prokaryotic transcription" — June 2126,2003. Saxtons River, Vermont.

4. Sosunov V, Sosunova E, Nikiforov V, Goldfarb A, Mustaev A. The role of the aspartate triad in the active center of RNA polymerase. FASEB summer research conference «Mechanism and regulation of prokaryotic transcription" — June 21−26, 2003. Saxtons River, Vermont.

5. Sosunov V, Sosunova E, Nikiforov V, Goldfarb A, Mustaev A. The mechanism of the 3'-5' exonuclease reaction catalysed by RNA polymerase. FASEB summer research conference «Prokaryotic transcription initiation" — Jule 14−19, 2001. Saxtons River, Vermont.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Я искренне благодарна А. А. Мустаеву за помощь и поддержку в процессе выполнения работы, В. Г. Никифорову за руководство и критику, А. Д. Гольдфарбу за создание условий работы и редактирование публикаций, В. Сосунову за безграничную помощь и поддержку. Я очень признательна Ж. М. Горленко, И. А. Басс и А. Кульбачинскому и всем сотрудникам ЛМГМ за доброе отношение и постоянную готовность прийти на помощь в любой ситуации.

Заключение

.

Нами были проанализированы мутационные замены в р-субъединице: ED813,814AA, R1106A, R678A, К1073А и в р'-субъединице: N458A, R731A. Все заменённые аминокислотные остатки составляют ближайшее окружение активного центра РНКП. К1073, R678, R1106 — образуют ряд положительно заряженных а.к. остатков, которые, согласно ранее полученным данным и модели единого активного центра, должны участвовать в связывании фосфатной части NTP. Кроме того, нам было важно узнать как эти положительно заряженные остатки влияют на связывание каталитического иона Mg-II. Остатки Е813, D814 и N458 согласно разным структурным данным могут принимать участие в связывании Mg-II. Остатки N458 и R731 согласно модели активного центра для 3'-5'-экзонуклеазной реакции принимают участие в образовании Е-сайта, в котором связывается стимулирующий 3'-5'-экзонуклеазную реакцию NTP.

Анализ активности. РНКП с мутационными заменами показал, что в реакции элонгации самые сильные дефекты вызвали мутационные замены ED813,814AA, а также R678A. Наименьший дефект проявил R731A, что вполне оправдано его относительной удалённостью от активного центра.

Сравнение скоростей 3'-5'-экзонуклеазной активности у мутантных РНКП и РНКП дикого типа показало, что ни Е813, D814, ни N458 не участвуют в связывании Mg-II, что учитывалось при построении двуметаллической модели активного центра РНКП (Сосунов, 2003).

Было обнаружено, что мутационная замена остатка N458 меняет предрасположенность РНКП в ТЭК к бэктрэкингу. По-видимому, присутствие N458 необходимо для поддержания 3'-концевого нуклеозидного остатка в /+/ сайте в правильном положении.

На основе полученых данных мы заключили, что высококонсервативные а.к. остатки R1106, R678 и К1073 р-субъединицы действительно принимают участие в связывании фосфатной части NTP, как в реакции полимеризации, так и в реакции NTP-стимулируемого гидролиза РНК. Причем влияние мутационных замен этих а.к. остатков на связывание NTP возрастает в следующем порядке K1073.

Замены всех положительно заряженных а.к. остатков (кроме удаленного от активного центра R731) приводят к улучшению связывания Mg-II, по-видимому, вследствие уменьшения положительного заряда в районе активного центра, электростатически отталкивающего Mg-II. Однако характер зависимости скорости реакции расщепления от концентрации ионов Mg2+ отостается линейным во всех случаях,. кроме R1106А. В случае этой мутационной замены кривая зависимости выходит на плато, что свидетельствует об увеличении константы связывания Mg-II.

Как было показано (Сосунов, 2003) РНКП дикого типа при щелочных рН в присутствии PPi начинает выщеплять NMP вместо NTP, что свидетельствует от том, что пирофосфат и р-, уфосфаты NTP могут связываться в активном центре РНКП при полимеризации/пирофосфоролизе и при стимуляции 3'-5'-экзонуклеазного расщепления РНК двумя различными способами. Мы обнаружили, что мутационные замены ED813,814AA, R1106А, R678A и частично К1073А в присутствии пирофосфата PPi также катализируют выщепление не NTP, a NMP, по-видимому вследствие: структурных изменений вызванных мутационными заменами. Это служит веским потдверждением сделанного предположения о двух способах связывания пирофосфата и р-, уфосфатов NTP в активном центре РНКП.

Одна из самых дефектных в реакции полимеризации РНКП R678A в реакции 3'-5'-экзонуклеазного расщепления оказалась наиболее активной (рис. III.5). Скорость расщепления у этой РНКП даже выше, чем у R1106A. Причем это нельзя объяснить повышенной константой связывания Mg-II. По-видимому, замена R678A каким-то образом влияет на катализ реакции или приводит к более эффективной для 3'-5'экзонуклеазной реакции конформации ТЭК. Интересно, что скорость эндонуклеазной реакции у этого мутанта не превышает скорости этой реакции у РНКП дикого типа (рис. III.9). Вполне вероятно, что присутствие R678 необходимо для того, чтобы З'-концевой нуклеотид в +1 положении относительно i+1 сайта, занимал каталитически компетентную конформацию (см. раздел результатов II), что вытекает также из анализа построенной нами модели эндонуклеазной реакции.

Мутационные замены N45 8А и R731A приводят к уменьшению симулирующего эффекта NTP на скорость 3'-5'-экзонуклеазного гидролиза и ухудшению связывания стмулирующего NTP. Это свидетельствует в пользу существования и структурного расположения Е-сайта, предсказанного в модели активного центра РНКП для NTP-стимулируемой реакции 3'-5'-экзонуклеазного расщепления (Сосунов, 2003).

IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Сравнение различных структурных моделей комплекса РНКП с транскрипционными факторами расщепления.

Молекулярный механизм стимулирующего действия транскрипционных факторов расщепления долгое время оставался загадкой. Недавно в этом направлении произошел настоящий прорыв. Кроме нашей работы (раздел результатов I), практически одновременно сразу в трёх лабораториях, используя различные подходы, были сделаны структурные модели комплекса РНКП с фактором расщепления и предложен молекулярный механизм стимулирующего действия транскрипционных факторов расщепления (Opalka et al., 2003; Laptenko et al., 2003, Kettenberger et al., 2003). Ниже будут обсуждены особенности структурных моделей комплекса бактериальной РНКП с Gre фактором, которые были получены на основе рентгеноструктурного (Opalka et al., 2003) и биохимического (Laptenko et al., 2003) анализа. Структурная модель комплекса эукариотического фактора TFIIS с РНКП-И, полученная с помощью рентгеноструктурного анализа с разрешением 3.8А (Kettenberger et al., 2003), на основе которой был предположен механизм стимулирующего действия TFIIS, рассмотрена в литературном обзоре (с. 46).

Структурная модель комплекса РНКП/GreB, полученная на основе рентгеноструктурного анализа с разрешением 15 А.

В работе (Opalka et al., 2003) механизм действия Gre факторов был предложен, исходя из анализа структурной модели комплекса РНКП/GreB (Е. coli), сделанной путем наложения карты электронной плотности с разрешением 15А, на известные трёхмерные структуры РНКП и GreB (рис. IV. 1 А). Оказалось, что в полученном комплексе структура РНКП находится в приоткрытой конформации, тогда как для тройного элонгационного комплекса (ТЭК), с которым Gre факторы функционально взаимодействуют, характерна закрытая конформация, т. е. конформация, в которой домен «зажим» находится в закрытом состоянии (см. лит. обзор, с. 17). Согласно полученной карте электронной плотности, С-концевой домен GreB связывается возле входа во вторичный канал, как и было предположено (Polyakov et.al., 1998), и взаимодействует в основном с двумя а-спиралями в р'-субъединице, которые образуют часть края входного отверстия во вторичный канал (рис. IV. 1 В). N-концевой домен GreB входит во вторичный канал на 45А, и его концевая петля оказывается рядом с активным центром РНКП (рис. IV. 1 А). Две а-спирали, с которыми, согласно модели Opalka и соавт., в основном взаимодействует CTD-GreB, находятся внутри последовательности между консервативными районами D и.

Е Р'-субъединицы. Кончик двойной а-спирали N-концевого домена образует контакты с высококонсервативными районами р и р'-субъединиц, окружающих активный центр РНКП, включая универсальный мотив NADFDGD (р'458⁶⁴), который содержит триаду каталитических аспартатов, удерживающих ионы Mg2″ в активном центре (рис IV. 1 В).

Модель комплекса РНКП/GreB, предложенная Opalka и др., подтверждает предположение об участии кластера положительно заряженных, а к. остатков во взаимодействии с 3'-концевым фрагментом РНК Согласно модели, N-концевой домен GreB располагается во вторичном канале таким образом, что положительно заряженные остатки оказываются выстроены в линию вдоль ожидаемого направления выхода одноцепочечного 3'-конца РНК во вторичном канале (рис. IV. 2В) В случае GreA, остатки В.

RNAP } «=|.

GreB Ж' соёей-ссы! CTD.

Рис. IV.I. Структура комплекса РНКП с GreB (Opalka et al., 2003). (А) Результат наложения трёхмерной структуры кор-фермента РНКП Т aquations на карту электронной плотности комплекса с разрешением 15А Трехмерная структура РНКП изображена в виде а-угл сродной цепи Районы совпадения карты электронной плотности с трёхмерной структурой РНКП обозначены голубым цветом. Участки несовпадения обозначены следующим образом: районы pDRl и pDR2, присутствующие в РНКП Е. coli, но отсутствующие в РНКП Taq (Sevcrinov ct a I., 1994). показаны желтым и белым цветамирозовым цветом обозначена электронная плотность, соответствующая GreB. (В) Взаимодействие РНКП с GreB. На рисунке изображена структура РНКП в пределах 4А от GreB. Структуры РНКП и GreB изображены в виде а-углеродной цепи Участки Р-субьедииицы показаны голубым цветом: [V-субъединицы — розовымкаталитический ион Mg-I изображен желтым. Пептидные цепи GreB выделены красным цветомрайон NTD GreB. с которым 3″ -конец РНК образует ковалентные сшивки, выделен зелёным цветом (Koulich et al. 1997; Stebbins et al., 1995). 8 виде цветных кружков изображены а-углеродные атомы консервативных а.к. остатков положительно заряженного кластера района NTD-GreB. слева-направо: GreA R37 (голубой) — GreA R52/GreB К52 (синий) — GreB R53, R56, R60 и R67 (тёмно-синий). Показано положение а.к. D121 и Р123 в CTD-GreB, мутационные замены которых оказывают влияние на связывание с РНКП (Loizos and Darst 1999) Матричная нить ДНК изображена темно-зелёным цветом, РНК-транскрипт — фиолетовым. РНКП схематично разделена на три района (вверху рисунка): район активною центра, вторичного канала и край вторичного канала Структура GreB также схематично разделена на три района (внизу): концевая петля NTD (сс tip), N-концевая двойная а-спираль (coiled-coil) и С-концевой домен (CTD), зажим F-мостовая спираль.

——-:. .. , ^ GreB-NTD.

GreB-CTD.

R37 и R52. образующие положительно-заряженный кластер у этого белка, располагаются на расстоянии около 20А от активного центра. В случае GreB. положительно заряженные а.к. остатки кластера образуют линию вдоль края двойной а-спирали N-концевого домена, при этом расстояние от активною центра до ближайшего остатка 20А, а до самого дальнего — 45А. Это объясняет способность GreB выщеплягь РНК-фрагменты длиной 218 вт, a GreA — РНК-фрагменты длиной 2−3 нт.

Что касается механизма стимулирующего действия GreB. то из-за низкого разрешения кристаллов комплекса авторы не могут точно сказать, прямо Gre белки участвуют в катализе реакции, предоставляя инвариантные остатки NTD D41 и Е44 для координации каталитического иона Mg-II. или индуцируют какое-то аллостерическое изменение в структуре РНКП. Расстояние от кислых а.к. остатков GreB D41 и Е44 до сайта связывания второго иона Mg: согласно предложенной авторами структурной модели комплекса, составляет 13.5 и 8.5 А. соответственно. Эго слишком большое расстояние для прямого участия D41 и Е44 в координации Mg-II. Интересно, что в этой работе мутационные замены D41A и Е44А в NTI)-GreB приводят к не очень большому уменьшению активности по сравнению с РНКП WT в системе T3K16G на Т7А1 промоторе (рис. IV.2). Надо заметить, что выбранная система не очень удачна для анализа активности мутантных Gre факторов, т.к. глядя на приведенную авторадиограмму трудно количественно оценить дефект, обусловленный мутационными заменами. Тем не менее, ссылаясь на приведенные данные (рис. IV.2), Opalka и соавт. утверждают, что мутационные замены D41A и Е44А значительно, но не драматически нарушают каталитическую активность Gre факторов.

Структурные и биохимические данные, приведенные Opalka и соавт., свидетельствуют больше в пользу аллоетерического (непрямого) механизма действия Gre факторов, через привлечение а.к. остатка 1)814 fi-субъединицы. Однако, нами было покавремя, мин.

T3K16G '.

—, V1 D'.IA tJJA ! .LL§ ' 1? ¦ s продать-1 расщепления.

GreA время, мин.

T3K1SG ¦ продукты расщепления I.

GreB л 1 D-1'А (МЛ |0*(1Л fM".

П ] * ' 1 • 1Я is 11 |J |. |3 1 ¦

HI i T ! m.

Рис. IV.2. Электрофореграмма, демонстрирующая активность Gre факторов с мутационными заменами в реакции расщепления РНК в T3KI6G (данные Opalka el al, 2003). зано, что этот остаток (D814) не принимает участия в связывании Mg-II в реакции Gre-зависимого расщепления (раздел результатов I, с.71).

Таким образом, рентгеноструктурный анализ двойного комплекса РНКП (в приоткрытой конформации) с GreB с низким разрешением показал, что Gre белки связываются во вторичном канале РНКП и N-концевой1 домен подходит достаточно близко к активному центру РНКП. Однако, полученного разрешения оказалось недостаточно для определения того, как именно Gre фактор участвует в катализе эндонуклеазного расщепления.

Биохимический анализ взаимодействия РНКП с Gre.

На основании биохимического анализа комплекса РНКП/Gre была предложена еще одна структурная модель комплекса РНКП/GreA (рис. IV.3- рис. IV.5B) и предположен молекулярный механизм действия Gre факторов (Laptenko et al., 2003).

Определяя область РНКП, участвующую во взаимодействии с Gre белками авторы применили метод ковалентных сшивок. Восемь поверхностно экспонированных, функционально неважных остатков GreB, не участвующих во взаимодействии с РНКП, были заменены на Cys. Мутантные GreB обрабатывали фотореактивным реагентом 4-азидосалицил-2,2-дитиопиридил[358]цистеин (ASDPC), при этом вместо цистеиновой тио-группы образуется фотореактивая азидо-группа, с радиусом действия 15А. Обработанные ASDPC мутантные GreB инкубировали с кор-РНКП, затем облучали УФ и анализировали в SDS-ПААГе. Наиболее эффективная сшивка образуется из двух цистеиновых остатков NTD-GreB: из Cys43, расположенного в N-концевой а-спирали «coiled-coil» домена, и из Cys53, расположенного в середине положительно-заряженного кластера а.к. остатков N-концевого домена, при этом сшивки образуются в основном с Р'-субъединицей. Несколько минорных сшивок образуется из Cys43 с Р-субъединицей. Из Cys23, который расположен на отрицательно-заряженной стороне поверхности NTD GreB, относительно слабое ковалентное взаимодействие образуется с Р'-субъединицей. Остатки Cys97 и Cys78, расположенные в CTD GreB, взаимодействуют с Ри Р'-субъединицами, соответственно. Ковалентная сшивка из Cys 128 и Cys 154 на положительно-заряженной стороне CTD GreB более эффективна и происходит одновременно с Ри р'-субъединицами (рис. IV.3A). На основании этих данных было заключено, что NTD-GreB окружен Р'-субъединицей, исключая концевую петлю, которая также контактирует с Р-субъединицей. С-концевой домен GreB расположен рядом с Ри Р'-субъединицами, по-видимому там, где субъединицы контактируют друг с другом (рис. IV.3 А).

Для более детального анализа комплекса РНКП с GreB был использован гидрокснлрадикальный фугпринтинг Fe-EDTA (Wang et al., 1997), а также локализованы районы расщепления РНКП вблизи активного центра гидроксильными радикалами, образованными ионом связанным в активном центре РНКП (Zaychikov et al., 1996; Mustaev et al., 1997). Согласно полученным данным было показано, Gre факторы взаимодействуют в основном с Р' -субъединицей в районах F, G, G* и с неконсервативными участками между районами Е и F, и между G и Н. Согласно данным по белок-белковым сшивкам, оба Gre фактора взаимодействуют с РНКП в районах D и Е р-субъединицы, те в непосредственной близости от активного центра фермента и его ближайшего окружения Основные районы Gre факторов, находящиеся вблизи активного центра РНКП, расположены внутри консервативного района G40-E47 на конце Gre-NTD. щ шг шЯ&Р*^* р р If «Я.

Рнс. IV.3. Биохимический анализ комплекса РНКП/Gre ELcoli (Laptenko et al., 2003). (A) Схематичное представление результатов фотореактивируемых ковалентных сшивок в комплексе РНКП/GreB Обозначено расположение восьми остатков Cys, которые были модифицированы в структуре GreB. (В) Результаты экспериментов по гидрокенлрадикльиому расщеплению РНКП Е. coli в комплексе с Gre факторами (показаны на трехмерной структуре холофермента РНКП Т. thermophilic (Vassylyev et al. 2002″. о-субъсдиннца не показана. Петля, несущая триаду каталитических аспартатов, выделена фиолетовым цветом Синим цветом выделены области р-субъединицы, защищенные GreB от гидроксилрадикального расщеплениязелёным — области защищенные от гидроксилрадикального расщепления в р-субъединицесветло-желтым — области слабой защиты в р-субъединицекрасным и оранжевым цветами показаны области усиления гидроксилрадикального расщепления в Р и р" -субьединицах в присутствии GreB.

Сравнение структурных моделей комплекса РНКП/Gre.

Сравнение структурных моделей, предложенных в разных работах, показало, что построенная нами модель, отличается от структурной модели Opalka и соавт углом поворота GreB во вторичном канале В нашей модели CTD повёрнут против часовой стрелки приблизительно на 120 градусов, относительно оси вторичного канала, по сравне.

Рнс. IV.4. Структурная модель комплекса РНКП/GreB, сделанная в настоящей работе (II) и предложенная Opalka и соавт, на основе данных рентгеноструктурного анализа комплекса РНКП/GrcB (I). Стрелкой показано направление вращения структуры GreB относительно продольной оси вторичного каната в модели Opalka и соавт, необходимого для того, чтобы она приняла положение аналогичное положению GreB в нашей модели (II). Из структуры РНКП изображены только участки Р" -субъединицы: неструктурированные участки полипептидной цепи изображены белым цветом, р-слон — в виде голубых стрелок, а-спирали — в виде красных цилиндров: указано положение двух каталитических ионов Mg3' (зелёный и фиолетовый). Структура GreB изображена зелёным цветом Показано положение аминокислотных остатков Gre В D41 и Е44 и расстояние от них до каталитического нона Mg-II в случае каждой структурной модели. нию с положением CTD-GreB в структуре Opalka и соавт (рис. 1V.4). При таком расположении концевые остатки D41 и Е44 NTD находятся достаточно близко к активному центру, чтобы напрямую координировать Mg-II и атакующую молекулу воды, а С-концевой домен взаимодействует как с р'-субъединицей, так и с fi-субъединицей Как уже обсуждалось выше в комплексе РНКП/GreB Opalka и соавт РНКП, во-первых, находится в приоткрытой конформации, во-вторых, не связана с НК, т. е. присутствует в свободном виде, а не в сосгаве тройного элонгационного комплекса, с которым функционально взаимодействует Gre фактор. Перечисленные факты оставляют возможность того, что GreB в комплексе с такой РНКП находится не в окончательном функционально-компетентном положении, а в промежуточном положении, которое он может занимать на пути к правильному связыванию.

Данные Laptenko и соавт показывают, что вся N-концевая «coiled-coil» спираль f}'(V673-E695) в присутствии Gre факторов защищена от гид роксил рад и кал ьного расщепления (рис. IV.5B), а С-концевой домен образует контакты как с р1-субъединицей, так и с Р-субъединицей (pHC.IV.ЗА). Эти данные «перекрывают» районы взаимодействия Gre фактора с РНКП как в модели Opalka и соавт, так и в нашей структурной модели (рис IV 5). В структурной модели Laptenko и соавт., построенной с учетом рентгеноструктурных данных Opalka и соавт., GreA фактор занимает промежуточное положение по сравнению с положением GreB в нашей модели и модели Opalka и соавт. (рис. IV.4, Iрис. IV 5).

Не исключено, что перед тем как занять наиболее выгодное для стимуляции эндонуклеазного расщепления положение, Gre фактор занимает несколько предварительных сайтов связывания во вторичном канале РНКП, что и отражают результаты структурного и биохимического анализа комплекса РНКП/Gre Возможно также, что относительное расположение доменов в Gre факторе после связывания с РНКП может изменяться, как в случае фактора TFIIS (см. лит обзор).

Рис. IV.5. Сравнение структурных моделей комплекса РНКП/Gre. (А) Структурная модель, сделанная на основе трёхмерной карты электронной плотности с разрешением J 5 A (Opalka et al., 2003). Вид со стороны вторичного канала. GreB обозначен зелёным цветом. р-субъеднницажелтым, р' - белым, а 1 и II — синим и болотным- «1 — тёмно-зелёным Показано взаимодействие CTD GreB с двумя а-сп и рал я ми Р'-субъединицы расположенных при входе во вторичный канал (В) Структурная модель комплекса GrcA/РНКП Т. thermophilic, сделанная на основе биохимического анализа комплекса Gre факторов с РНКП Е. coli (Laptenko et al., 2003) Аналогичное представление со стороны вторичного канала GreB обозначен голубым цветом, р-субъединица — желто-оранжевым, р' - белым. Синим цветом выделены области Р'-субъединицы защищенные GreB от гидроксилрадикального расщепления, зеленым — области защиты в р-субъедннице, красным цветом — области усиления расщепления в присутствии Gre.