Разработка технологий вакцины клещевого энцефалита «ЭнцеВир». Изучение ее физико-химических и иммунобиологических свойств

Актуальность работы.

Клещевой энцефалит (КЭ) — вирусное заболевание центральной нервной системы, имеющее природно-очаговый характер и широко распространенное на территории России, Австрии, Германии, Чехии, Словакии и других европейских государств. В России последние 10−15 лет характеризуются подъемом заболеваемости клещевым энцефалитом, что вызвано рядом природных, а также социальных факторов. В 1999 — 2001 г. г. ежегодно регистрировалось от 5 до 9 тысяч больных КЭ, преимущественно в Урало-Сибирском регионе и на Дальнем Востоке [44,50, 51, 69,182].

Наиболее эффективной мерой профилактики клещевого энцефалита является вакцинация [22, 36, 112, 185, 189]. В большинстве регионов России для массовых прививок в течение длительного времени применяли вакцину клещевого энцефалита культуральную инактивированную сорбированную жидкую производства ФГУП НПО «Вирион» (г. Томск). Начиная с 1984 г. получение культуральной инактивированной вакцины в ФГУП НПО «Вирион» ведется с применением производственного штамма «№ 205″ вируса клещевого энцефалита, обеспечивающего высокий уровень накопления его в культуре клеток ку-» риного эмбриона [3, 19]. Использование производственного штамма «№ 205» ВКЭ в сочетании с производительным методом репродукции в суспензионной культуре ККЭ позволило производить неконцентрированную культуральную вакцину, обеспечивающую выраженную иммунологическую и эпидемиологическую эффективность при невысокой стоимости вакцинации [80, 99, 100, 114, 149]. Объемы производства такой вакцины, необходимые для обеспечения потребностей практического здравоохранения, составляли до 4 — 4,5 млн. доз ежегодно [149].

В то же время, достаточно высокий уровень накопления субстратых белков в процессе суспензионного культивирования клеток и отсутствие эффективных процедур очистки от примесей в технологии вакцины привели к увеличению количества поствакцинальных осложнений на препарат по типу аллергических реакций различной степени тяжести [22]. В соответствии с современными требованиями ВОЗ и НОК вакцина клещевого энцефалита должна быть очищена от антибиотиков, остаточного формальдегида и других технологических примесей [191].

В настоящее время накоплен опыт получения очищенных вирусных вакцин. В нашей стране разрешены к применению отечественная и две зарубежные концентрированные очищенные цельновирионные вакцины клещевого энцефалита на основе штаммов вируса клещевого энцефалита «Софьин», «Нейрдорф» и «К-2» [155, 175, 178, 183]. С целью выделения очищенного вируса клещевого энцефалита при получении этих вакцин используются методы хроматографии на макропористом стекле и ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Вакцины, полученные такими способами, обладают высокой имму-ногенной активностью и низкой реактогенностью. Однако большой расход культурального полуфабриката («вирусного сбора») в процессе концентрирования является одной из причин, обуславливающих высокую стоимость этих препаратов.

Разработка технологии очищенной культуральной вакцины клещевого энцефалита, совмещающая в себе производительный способ получения вирус-содержащего культурального полуфабриката с эффективной методикой очистки вируса, позволит получить недорогой препарат, доступный для массовой вакцинопрофилактики. Учитывая высокую потребность в вакцине против клещевого энцефалита в нашей стране, разрабатываемая технология должна обеспечить крупномасштабное производство этого препарата. В свою очередь разработка технологии очищенной вакцины требует разработки и внедрения адекватных методов контроля чистоты получаемых вирусных антигенов и методов определения концентрации этих антигенов на этапах производства и в готовом препарате.

Таким образом, разработка крупномасштабной технологии очищенной вакцины, обладающей высокой иммуногенной активностью и не имеющей побочных действий является важной и актуальной задачей.

Цель работы.

Разработать технологию очищенной концентрированной инактивирован-ной вакцины клещевого энцефалита на основе производственного штамма «№ 205» вируса клещевого энцефалита для крупномасштабного производства.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Отработать метод контроля содержания субстратных белковых примесей в вакцине на этапах получения.

2. Разработать методы концентрирования культурального «вирусного сбора» на основе штамма «№ 205» вируса клещевого энцефалита.

3. Разработать методы очистки культурального «вирусного сбора» на основе штамма «№ 205» вируса клещевого энцефалита.

4. Получить экспериментальные серии очищенной концентрированной вакцины клещевого энцефалита.

5. Получить экспериментально-производственные серии вакцины и разработать НД на препарат.

6. Изучить полученного препарата по физико-химическим и иммунобиологическим свойствам на соответствие требованиям ВОЗ, НОК и утвердить пакет документов (РП, ФСП).

7. Отработать метод контроля содержания гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита в полуфабрикатах очищенной концентрированной вакцины на этапах приготовления.

Научная новизна работы.

Впервые научно обоснована и разработана технология очистки и концентрирования вируса клещевого энцефалита штамма «№ 205», полученного методом суспензионного культивирования.

Приоритетность исследований подтверждена патентом на изобретение «Способ получения вакцины клещевого энцефалита» № 2 203 089 от 28.06.2001 г.

Впервые показана высокая эффективность очистки штамма «№ 205» вируса клещевого энцефалита гель-хроматографией на диол модифицированных кремнеземных сорбентах.

Впервые показана целесообразность сочетанного применения осаждения протаминсульфатом и гель-хроматографии для очистки вируса клещевого энцефалита от белков куриного эмбриона.

Модифицирован метод встречного иммуноэлектрофореза для количественного определения белков куриного эмбриона.

Показана возможность применения метода ИФА на основе моноклональ-ных антител для определения гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита с целью стандартизации специфических свойств вакцины.

Практическая значимость работы.

Разработана и внедрена в производство технология концентрированной и очищенной вакцины «ЭнцеВир».

Разработан и утвержден пакет нормативно-технической документации на препарат (Регламент производства № 1147−01, Фармакопейная статья предприятия № 42−0135−1790−01). Получено регистрационное удостоверение № 763/01−2001 и сертификат производства № 2001;73 024.

Изучены физико-химические и иммунобиологические параметры вакцины «ЭнцеВир» и показано их соответствие требованиям ВОЗ, НОК и НД.

Положения, выносимые на защиту.

1. Разработанная технологическая схема получения очищенной концентрированной вакцины клещевого энцефалита на основе производственного штамма «№ 205» вируса клещевого энцефалита.

2. Сочетание обработки протаминсульфатом, ультрафильтрации и гель-хроматографии на макропористом кремнеземе позволяет получать концентрированный антиген вируса клещевого энцефалита на основе штамма «№ 205», очищенный от субстратных белковых примесей.

3. Модифицированный метод встречного иммуноэлектрофореза позволяет контролировать содержание белков куриного эмбриона в вакцине на этапах приготовления.

4. Полученные экспериментально-производственные серии очищенной и концентрированной вакцины «ЭнцеВир» соответствуют требованиям ВОЗ, НОК и НД по физико-химическим и иммунобиологическим показателям.

5. Иммуноферментный анализ на основе моноклональных антител к гли-копротеину Е ВКЭ позволяет проводить предварительную оценку специфической активности вакцины клещевого энцефалита.

Апробация материалов исследований.

Основные результаты работы доложены и обсуждены на Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 95-летию ФГУП НПО «Вири-он» (г. Томск, 2001 г.) — научной конференции «Проблемы инфекции в клинической медицине» и VIII съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням (г. Санкт-Петербург, 2002 г.) — Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела XXI веке» (г. Пермь, 2003 г.) и на заседаниях научно-технического совета ФГУП НПО «Вирион» в 2000 -2003г.

Сведения о внедрении.

На основании полученных в процессе выполнения диссертационной работы результатов разработана и утверждена НД на вакцину «ЭнцеВир®-» (Регламент производства № 1147−01, Фармакопейная статья предприятия № 420 135−1790−01). Получено регистрационное удостоверение № 763/01−2001 и сертификат производства № 2001;73 024.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, включая патент на изобретение.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 162 страницах текста, включает 27 рисунков и 22 таблицы. Работа состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, обсуждения результатов и выводов.

Список литературы

содержит 194 работы отечественных и зарубежных авторов.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые разработана технология получения очищенной концентрированной вакцины клещевого энцефалита на основе производственного штамма «№ 205» вируса клещевого энцефалита, репродуцированного в условиях суспензионного культивирования. Приоритетность исследований подтверждена патентом на изобретение «Способ получения вакцины против клещевого энцефалита» № 2 203 089 от 28.06.01 г.

2. Отработан способ определения субстратных белков куриного эмбриона в концентрации менее 1,0 мкг/мл с применением встречного иммуноэлектро-фореза. Подтверждена высокая специфичность метода. Установлена возможность его использования для оценки концентрации белков куриного эмбриона в вакцине на этапах производства.

3. Показана эффективность методов адсорбционной хроматографии на макропористом кремнеземе и ультрафильтрации на «ядерных» и полисульфо-новых мембранах для концентрирования штамма «№ 205» вируса клещевого энцефалита.

4. Установлена эффективность метода гель-хроматографии на кремнеземных сорбентах для очистки от примесей неконцентрированных и концентрированных препаратов вируса клещевого энцефалита штамм «№ 205».

5. Обработка ультрафильтрационных концентратов вируса клещевого энцефалита протаминсульфатом с последующей очисткой гель-хроматографией позволяет снизить содержание белков куриного эмбриона в препарате до уровня менее 1,0 мкг/мл при сохранении его высокой иммуногенной активности.

6. Полученные экспериментально-производственные серии очищенной концентрированной вакцины клещевого энцефалита соответствуют требованиям ВОЗ, НОК и НД на препарат (Регламент производства № 1147−01, Фармакопейная статья предприятия № 42−0135−1790−01). На основании этого получен сертификат производства № 2001;73 024 на вакцину клещевого энцефалита «ЭнцеВир®-».

7. Установлена возможность использования иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител к гликопротеину Е ВКЭ для предварительного экспресс-контроля специфической активности вакцины «ЭнцеВир®-».