Оценка влияния гриппозной инфекции и иммунизации живой реассортантной гриппозной вакциной на возникновение и течение IgE-опосредованных аллергических реакций организма

Актуальность проблемы. В последние десятилетия в России, как и во всем мире, отмечен бурный рост распространенности аллергических заболеваний [29, 104, 174]. В современной аллергологии одним из актуальных направлений является исследование роли респираторных вирусов в возникновении и проявлении^{Е-опосредованных} аллергических заболеваний дыхательного тракта [26, 109,125].

Эпидемиологические данные убедительно свидетельствуют о наличии прямой связи между острыми респираторными вирусными инфекциями и развитием или обострением таких форм аллергопатологии как атопическая бронхиальная астма и аллергические обструктивные бронхиты [24, 164, 182]. Согласно одной из существующих концепций причиной тому является способность ряда возбудителей инфекции индуцировать так называемый патологический ТЬ2-иммунный ответ. Предполагается, что вирус сам (за счет аллергенности своих поверхностных или внутренних белков) или опосредованно через повышенную продукцию Т112-цитокинов (особенно ИЛ-4) приводит к накоплению общих и (или) вирусспецифических^Е и провоцирует развитие клинических симптомов аллергии [87, 109, 125].

В последние годы установлено, что таким иммунопатологическим действием обладают респираторные инфекции, вызываемые респираторно-синцитиальным вирусом (РС), вирусами парагриппа (ПГ) и риновирусами [26, 124, 176]. Иммунный ответ на эти вирусы может сопровождаться развитием аллергической сенсибилизации к самому возбудителю и (или) к неинфекционным аллергенам. Однако сведения о наличии такой способности у вируса гриппа носят противоречивый характер.

С одной стороны, получены настораживающие экспериментальные данные о способности гриппозной инфекции отменять иммунологическую толерантность к неинфекционным респираторным аллергенам [172] и повышать приток в слизистую респираторного тракта аллергенспецифических клеток памяти [106] и дендритных клеток [179], за счет чего происходит усиление аллергического воспаления в легких. Кроме того, в эпидемические сезоны именно грипп является наиболее частой причиной госпитализации лиц с симптомами острого осложнения астмы [36, 168].

G другой стороны, введение добровольцам с аллергическим ринитом в стадии, ремиссии умеренно вирулентного вируса гриппа A (H1N1) не приводило к повышению продукции аллергенспецифических IgE и ИЛ-4 [75]. Получены данные, свидетельствующие о ингибирующем влиянии гриппозной инфекции на повышенную продукцию ТЬ2-цитокинов у мышей с экспериментально воспроизведенной1 бронхиальной астмой [41]. Таким образом, вопрос об аллергизирующем воздействии возбудителя гриппа на организм требует дополнительного изучения.

Проблема развития аллергических IgE-опосредованных иммунных реакций в полной мере относится и к противовирусной вакцинации^ [14]. Высокая аллергенность экспериментальных инактивированных PG-вакцин [124] и мукозальной интраназальной инактивированной гриппозной вакцины [85] до сих пор не позволила внедрить эти высоко востребованные препараты в практику. В обоих случаях причиной их повышенной аллергенности явилось поствакцинальное развитие патологического ТЬ2-иммунного ответа с накоплением высоких уровней общих и (или) вирусспецифических IgE. Кроме того, показана способность парентеральной сплит-ИГВ за счет активации ТИ2-клеток индуцировать, конъюнктивиты и респираторные осложнения анафилактоидного типа [38, 63].

Альтернативой парентеральной ИГВ является живая холодоадаптированная реассортантная интраназальная вакцина (ЖГВ), разработанная академиком A.A. Смородинцевым и проф. Г. И. Александровой [22, 1]. Недавно подобная, но не идентичная вакцина лицензирована и в США [157]. За более чем двадцатилетний период практического применения ЖГВ уровень клинических аллергических реакций у привитых людей никогда не превышал нормы [140]. В то же время, аллергенность ЖГВ с иммунологических позиций была проверена лишь в период ее внедрения в 80-х гг. с использованием доступного тогда радиоиммунологического метода [21]. Однако накопленные за последние годы данные о повышенной аллергизации населения и роли респираторных вирусов в развитии аллергопатологий требуют изучения этого вопроса на новом качественном уровне.

Если рассматривать массовую противогриппозную вакцинацию населения с позиции возможного возникновения негативного поствакцинального аллергизирующего эффекта, то особое внимание должны привлекать люди, предрасположенные к развитию патологического ТЬ2-иммунного ответа. Анализ современной литературы позволяет выделить, по меньшей мере, три группы таких людей.

Люди с возрастными дефектами иммунной системы — дети первых лет жизни и престарелые лица. Особенность иммунного реагирования данных возрастных контингентов заключается в недостаточности ТЫ-звена иммунитета, что может приводить к смещению противоинфекционного иммунного ответа в сторону ТЫ [125, 110]. Иммунологическая безвредность ЖГВ у таких людей нуждается в более углубленном изучении.

Лица с латентной сенсибилизацией, то есть имеющие повышенные уровни общих и (или) аллергенспецифических 1§-Е, без клинических проявлений собственно аллергии. Такие лица составляют группу риска в отношении перехода скрытой формы сенсибилизации в манифестную [25, 87]. Потенциально вакцинация может стать индуктором этого процесса. Вопрос об последствиях вакцинопрофилактики гриппа у таких людей практически не изучен.

Люди, страдаюгцие бронхиальной астмой. Такие лица особенно нуждаются в защите от гриппа, поскольку инфекция может вызывать тяжелейшие обострения данной аллергопатологии [36, 168]. На сегодняшний день профилактическая эффективность ИГВ у этих людей многими авторами ставится под сомнение [31, 48]. Как влияют на течение бронхиальной астмы аттенуированные реассортантные вирусы гриппа, остается неизвестным.

Настоящая работа посвящена изучению перечисленных выше вопросов.

Цель исследования. Оценить у людей и экспериментальных животных влияние гриппозной инфекции и, вакцинации аттенуированными реассортантными вирусами гриппа на возникновение и течение^{Е-опосредованных} иммунных реакций.

Задачи исследования:

1. В эксперименте на мышах изучить продукцию: общих, вирусспецифических и овальбумин-(ОВА)-специфических в сыворотке крови и секретах дыхательных путей при гриппозной инфекции и вакцинации аттенуированным реассортантным вирусом — экспериментальным аналогом вакцинного штамма для ЖГВ.

2. Исследовать продукцию общих и вирусспецифических 1§-Е системной и.

М «У V* 1 локальной природы у людей после перенесенной гриппознои инфекции.

3. Сравнить продукцию общих, вирусспецифических и ОВА-специфических^Е, а также ТЫи ТЪ2-цитокинов у вакцинированных ЖГВ людей разных возрастов с учетом исходных уровней общих сывороточных.

4. Оценить влияние гриппозной инфекциии вакцинации аттенуированным реассортантным вирусом гриппа на. течение и выраженность экспериментально индуцированной бронхиальной астмы у мышей:

Научная новизна работы;

1. Впервые сопоставлена продукция у мышей трех типов локальных и сывороточных^Е (общие, вирусспецифические и ОВА-специфические) при первичной и вторичной гриппозной инфекции и вакцинации аттенуированным реассортантным вирусом гриппа. Показаны постинфекционные и поствакцинальные отличия — синтеза общих^Е. Во всех случаях не обнаружено повышенного уровня вирусспецифических и ОВА-специфических^Е ни в сыворотке кровини в секретах дыхательных путей:

2. Впервые проведено исследование влияния иммунизации ЖГВ на статус людей разного возраста в зависимости от исходных концентраций общих^Е в сыворотке крови. Установлено, что введение ЖГВ детям, молодым людям и пожилым лицам не провоцировало развитие патологического ТЬ2-иммунного ответа. Это касалось и лиц с исходными уровнями общих сывороточных 1§-Е, значительно превышающими показатели нормы.

3. Впервые охарактеризована локальная и системная продукция общих и вирусспецифических^Е у переболевших гриппом людей. Отмечено, что неосложненная гриппозная инфекция, вызванная вирусом А (НЗН2), не повышала синтез этих иммуноглобулинов у лиц с нормальными и высокими исходными уровнями общих сывороточных ^Е.

4. Впервые осуществлено экспериментальное изучение влияния гриппозной инфекции и вакцинации аттенуированным штаммом на течение бронхиальной астмы в стадии обострения и в стадии ремиссии. Показано, что и инфекция, и вакцинация, воспроизведенные у мышей на фоне, острого аллергического воспаления респираторного тракта, приводили к усилению астматических явлений и аллергенспецифического 1§ Е-ответа. То же самое наблюдалось при инфекции, развившейся в стадии ремиссии астмы. Вакцинация же в этот период аттенуированным вирусом не сопровождалась повышением секреции 1§-Е и обострением астмы.

Практическая значимость работы.

1. Осуществлено скрининговое обследование проживающих в Санкт-Петербурге людей разного возраста (дети, молодые люди, престарелые лица) для определения частоты выявления лиц с гиперпродукцией общих сывороточных ^Е.

2. Обоснована иммунологическая безвредность ЖГВ для детей дошкольного и школьного возраста, молодых людей и лиц пожилого возраста с позиций опасности поствакцинальной стимуляции патологического ТЬ2-иммунного ответа у лиц с латентной сенсибилизацией.

3. Получены экспериментальные данные, являющиеся предпосылкой для обоснования возможности клинических испытаний ЖГВ у больных бронхиальной астмой в стадии ремиссии этого заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Скрининговые данные о концентрации общих сывороточных^Е у детей 3−15 лет и молодых людей 18 — 22 лет без клинических признаков аллергических расстройств свидетельствуют о высокой частоте выявления случаев повышенной продукции этих иммуноглобулинов.

2. Вакцинация ЖГВ таких людей не приводит к утяжелению аллергического статуса в форме усиления продукции общих, вирусспецифических и овальбуминспецифических^Е в сыворотке крови и секретах верхних дыхательных путей.

3. Неосложненная гриппозная инфекция, вызываемая вирусом гриппа А, не индуцирует у условно здоровых молодых людей повышения синтеза сывороточных и локальных 1§-Е.

4. В отличие от инфекции, вакцинация мышей с экспериментальной астмой аттенуированным реассортантным вирусом (экспериментальный аналог вакцинного штамма для ЖГВ) не провоцирует усиление астматических явлений, если вакцинация осуществляется в стадии ремиссии этого заболевания.

Личным вкладом автора является самостоятельное проведение всех экспериментальных исследований, включая приготовление необходимых препаратов^ разработку схем их введения, работу с лабораторными животными, отбор и анализ материалов. Автор принимал непосредственное участие в клинических испытаниях, включая сбор анамнестических данных, отбор и иммунологический анализ материалов. Интерпретация полученных результатов выполнена лично автором. Отбор добровольцев для клинических испытаний проводили медицинские работники местных лечебно-профилактических учреждений. Автор выражает искреннюю благодарность д.б.н. П. В. Пигаревскому за помощь в интерпретации патоморфологических данных, а также к.м.н. С. А. Дониной за помощь в постановке иммунологических реакций.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на IX научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт.

Петербурге" (Санкт-Петербург, 2005) — на научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2006) — доклад занял I место на конкурсе молодых ученыхна X научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006) — на VI Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Москва, 2006).

Диссертационная работа апробирована на совместной научной конференции отделов иммунологии и вирусологи ГУ НИИЭМ РАМН 5 марта 2007 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работав том числе 3 статьи и 6 тезисов.

Структура и объем диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 134 страницах текста, включающего 21 таблиц и 12 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 186 источников, в том числе 30 отечественных и 156 иностранных.

выводы.

1. Среди обследованных жителей г. Санкт-Петербурга 3−6, 8−15и 18 — 22 лет, не имеющих в анамнезе аллергических заболеваний и лабораторно подтвержденных гельминтозов, доля лиц с превышением нормальных уровней общих сывороточных 1§-Е в 217 раз составляет 48 — 57%. У людей 65 лет и старше этот показатель не превышает 5%.

2. Иммунизация этих возрастных контингентов живой гриппозной вакциной не приводит к повышению продукции общих, вируси овальбуминспецифических^Е на системном и локальном уровнях. Это касается лиц как с нормальными, так и с высокими исходными концентрациями общих сывороточных.

3. Неосложненная гриппозная инфекция у молодых людей 18−20 лет с повышенными и нормальными исходными уровнями общих 1§-Е также не провоцирует усиление^{Е-синтеза} (общие и вирусспецифические^Е в сыворотках крови и секретах верхних дыхательных путей).

4. Гриппозная инфекция, возникающая на фоне экспериментально индуцированной бронхиальной астмы, приводит к обострению аллергического воспаления респираторного тракта как в острой фазе астмы, так и в период ремиссии.

5. В отличие от инфекции иммунизация аттенуированным реассортантным вирусом гриппа (экспериментальный аналог вакцинного штамма для живой гриппозной вакцины) в период ремиссии астмы не представляет угрозы с точки зрения усиления^{Е-опосредованных} аллергических реакций и воспалительных изменений в респираторном тракте.

Заключение

.

Обобщая данные литературы, представленные в разделе 1.З., можно отметить следующее.

Проблема «вакцинация — аллергия» весьма актуальна из-за широчайшего применения вакцин, содержащих потенциальные аллергены. Вакцины против респираторных вирусов не оставляют исключение. До сих пор не внедрены очень востребованные практикой вакцинные препараты против РС-инфекции по причине их повышенной аллергенности, проявляющейся в развитии патологического ТИ2-иммуиного ответа. По этой же причине не нашли широкого применения мукозальные варианты ИГВ. Парентеральная ИГВ не аллергенано она не обладает достаточной профилактической эффективностью у больных бронхиальной астмой. Очень низкая аллергенность ЖГВ доказана в клинико-эпидемиологических наблюдениях за здоровыми людьми всех возрастов, начиная с Зх-летнего. Однако воздействие этого препарата на^{Е-статус} требует специальных углубленных исследований с охватом, прежде всего, лиц повышенного риска (детей, пожилых людей и лиц всех возрастов с латентной сенсибилизацией). Вопрос о возможности применения ЖГВ с целью вакцинопрофилактики гриппа у больных бронхиальной астмой остается открытым.

Решению перечисленных вопросов и посвящена настоящая диссертационная работа (разделы 3,4).

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Вакцины.

Для иммунизации использовали коммерческую живую холодоадаптированную реассортантную тривалентную гриппозную вакцину.

— ЖГВ (ФГУ «Микроген» — Иркутское предприятие по производству иммунобиологических препаратов, Иркутск). В состав ЖГВ входили холодоадаптированные реассортантные вирусы с биологической активностью штаммов типа A (H1N1), А (H3N2) — 106'5 ЭИД 50/0,2 мл, типа В.

— Ю6,0 ЭИД 50/0,2 мл. ЖГВ вводили интраназально в объеме 0,5 мл (по 0,25 мл в каждый носовой ход).

В различные прививочные сезоны в состав ЖГВ входили следующие вакцинные штаммы: A/17/Texac/l/3/91 (H1N1), A/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1), А/17/Нанчанг/95/4 (H3N2), А/17/Сидней/97/76 (H3N2), А/17/Панама/99/242 (H3N2), А/17/Калифорния/04/6 (H3N2), В/60/Панама/90/4/Е, В/60/Гонконг/01/22, В/60/Джиллин/03/1. Все вакцинные штаммы являлись актуальными для данного эпидемического сезона и были рекомендованы ВОЗ.

2.2. Обследованные контингенты.

Гриппозная инфекция. Было обследовано 32 человека 18−20 лет из наблюдавшегося воинского коллектива, которые в эпидемический сезон 2003.

— 2004 гг. перенесли неосложненный, клинически выраженный и серологически подтвержденный грипп, А (H3N2). Все обследованные люди не имели в анамнезе клинически выраженных аллергических заболеваний и лабораторно подтвержденных гельминтозов. В течение периода наблюдения у волонтеров не было отмечено клинических проявлений аллергических реакций.

Вакцинация. Возрастные контингенты вакцинируемых лиц составили: 132 молодых людей 18−22 лет из организованных коллективов- 118 детей 3.

— 6 лет и 114 детей 8 — 15 лет, посещавших детские сады и школы- 42 пожилых человека 65 — 87 лет из домов престарелых. Все коллективы и учреждения находились в г. Санкт-Петербурге. Все отобранные для исследования лица не имели в анамнезе клинически выраженных аллергических заболеваний и лабораторно подтвержденных гельминтозов. Вакцинацию и забор исследуемых материалов у детей осуществляли с письменного разрешения родителей, а у взрослых людей — на основе добровольного письменного согласия.

Обследованные возрастные контингента составили две группы: (1) привитые интраназально коммерческой ЖГВ- (и) лица, которым вводили интраназально препарат плацебо 1 — стерильный физиологический раствор- (ш) лица, которым вводили интраназально препарат плацебо 2 — не содержащую вирус аллантоисную жидкость куриных эмбрионов (стандартный субстрат для накопления вирусов гриппа).

Молодые люди и дети прививались ЖГВ однократно, пожилые люди двукратно с интервалом в 21 день. Двукратная вакцинация для пожилых людей является более эффективным способом специфической вакцинопрофилактики против гриппа [139].

В течение 5 дней после прививки проводились клинические наблюдения, включавшие измерение температуры тела, пульса и кровяного давления, осмотр носоглотки. Через 21 день после иммунизации проводилось дополнительное обследование вакцинированных одновременно с взятием материала для анализа. Клинически выраженных аллергических реакций после вакцинации не было зафиксировано ни у одного из добровольцев в течение всего периода наблюдения.

2.3. Лабораторные животные.

Экспериментальные исследования проводили на мышах линии СВА, самках, в возрасте 8 — 10 недель. Животных содержали в условиях вивария на стандартном рационе питания при свободном доступе к воде [9]. Мыши, использовавшиеся для воспроизведения ОВА-индуцированной бронхиальной астмы получали не содержащую яичный белок диету. Работу с мышами осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755).

2.4. Экспериментальные модели.

Модель гриппозной инфекции и вакцинации. Мышам интраназально вводили по 50 мкл раствора на 10 мМ фосфатном буфере (pH 7,4) (Sigma Со, США), содержащего: (i) 4,0 ^ЭИД50/0,1 мл общепринятого патогенного для мышей вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1), представляющего собой экспериментальный аналог дикого вирулентного вируса (инфекция) — (и) 6,01§ ЭИД5о/ОД мл аттенуированного реассортанта, являющегося аналогом вакцинного штамма для ЖГВ и моделировавшего вакцинацию. Вирус (и) был создан по технологии приготовления вакцинных штаммов для ЖГВ методом генетической реассортации по формуле 6/2 [1]. Реассортант унаследовал 2 гена поверхностных белков (гемагглютинин и нейраминидаза) от патогенного A/PR/8/34 (H1N1) и все гены внутренних белков от холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/47/57 (H2N2), прошедшего 47 пассажей на куриных эмбрионах при пониженной температуре. Таким образом, аттенуированный реассортант обладал следующими фенотипическими признаками: 1) холодоадаптированностьспособность к активной репродукции при низкой температуре (25 — 27°С) — 2) температурочувствительность — неспособность к размножению при повышенной температуре (38°С) [1]. Для подтверждения этих признаков перед проведением эксперимента были проверены репликативные свойства исследуемых вирусов в верхних и нижних отделах респираторного тракта мышей (табл. 1). Интенсивность репликации оценивалась по уровню инфекционной активности вирусов в гомогенатах легких и назофарингеального тракта животных. Инфекционная активность определялась методом заражения куриных эмбрионов 10-кратными разведениями вируссодержащих гомогенатов и выражалась в 50% эмбриональной инфекционной дозе.