Низкотемпературное (-80\NаC) консервирование лейкоцитных концентратов

Актуальность: Современная клиническая трансфузиология основана на применении компонентов крови, однако лейкоцитные концентраты не получили до сих пор широкого распространения в клинической практике. Лейкокон-центрат с заместительной целью может использоваться при миелотоксических агранулоцитозах, возникающих на фоне высокодозной химиотерапии больных онкогематологическими заболеваниями, а также при лейкопениях различного генеза, сопровождающихся тяжелой септицемией, лихорадкой и клиническими признаками тяжелой локальной или генерализованной инфекции [1, 5, 9, 14, 33, 44, 132, 134, 165].

Трансфузия аутологичных или донорских лейкоцитных концентратов позволяет заместить утраченную функцию клеточного звена иммунитета особенно в тех случаях, когда иммуностимулирующая терапия неэффективна или противопоказана [13, 44, 55, 66].

Одной из причиы, затрудняющих применение лейкоцитов, является отсутствие эффективного метода их низкотемпературного консервирования. Ранее предложенные криопротекторы — глицерин, полиэтиленоксид (ПЭО-400) -не в полной мере обеспечивают защиту лейкоцитов во время замораживания. ДМАЦ, ПЭ0400 — не нашли применения в России, т.к. отсутствует их производство в нашей стране. Кроме того, ДМСО (димексид) не разрешен для внутривенного введения Фармакологическим комитетом Минздрава Российской Федерации.

Следует отметить, что в литературе опубликовано большое количество способов выделения лейкоцитов, отличающихся не только техникой выполнения, но и результатами, однако, все они несовершенны и не позволяют получать лечебные дозы лейкоцитов [21, 27, 32, 34, 41, 58, 60].

Лечебная доза лейкоцитов составляет в среднем 2,5 х Ю10 клеток [9, 27, 47]. Выделение такого количества клеток достаточно сложно и возможно лишь с помощью специальных автоматических сепараторов (фракционаторов) крови, которые позволяют решить проблему получения больших количеств лейкоцитов (до 5,0×1010) от одного донора.

Однако, вследствие сложности работы с фракционаторами и высокой стоимости расходных материалов эта техника повсеместного распространения еще не получила. В практике используются методы выделения клеток из лей-котромбоцитарного слоя и обогащенной лейкоцитами плазмы.

Ограничение применения лейкоконцентрата в клинической практике связано также с низкой устойчивостью нативных лейкоцитов, особенно грануло-цитов, при хранении в диапазоне положительных температур. Установлено, что у этих клеток, ввиду быстрого истощения энергетического потенциала и на фоне гликолиза, через короткий промежуток времени нарушаются морфофунк-циональные свойства, в частности, уже через 24−48 часов после кроводачи полностью исчезает способность к фагоцитозу [7, 9, 15, 18, 150, 152].

Температуры, близкие к не нашли применения для хранения лейкоцитов, т.к. при этом клетки быстро теряют структуру и разрушаются без постоянного поддержания энергетических затрат и в связи с накоплением продуктов метаболизма [4, 31, 56, 99, 135].

Отмеченные методы требуют применения дорогостоящего оборудования и жидкого азота, что делает технологию криоконсервирования сложной, громоздкой, экономически неэффективной.

Исходя из выше указанных фактов, очевидна актуальность создания нового эффективного метода криоконсервирования концентрата лейкоцитов и необходимость разработки криоконсерванта для замораживания лейкоцитов, который был бы нетоксичен, обеспечивал достаточную морфологическую и функциональную сохранность клеток и не требовал отмывания.

Задачи исследования:

1. Разработать лекарственную форму криоконсерванта для замораживания лейкоцитов, содержащего вещество — гексаметиленбистетраоксиэтилмоче-вину (ГМБТОЭМ), не требующего отмывания после оттаивания биообъекта.

3. Изучить функциональные и морфологические свойства лейкоцитов, криоконсервированных по разработанному методу, в процессе хранения и после размораживания. •.

4. Провести биологические испытания предложенного консерванта. Определить переносимость экспериментальными животными внутривенного введения лейкоцитов, консервированных замораживанием по новому способу.

Научная новизна Разработан и экспериментально изучен оригинальный криоконсервант для замораживания лейкоцитов, содержащий в своей основе криофилактиче-ское вещество ГМБТОЭМ, не требующее отмывания после оттаивания клеточной суспензии.

Теоретическая и практическая значимость работы Результаты проведенных биологических, физических, морфологических, функциональных, цитохимических экспериментальных исследований подтверждают выраженный криозащитный эффект нового криоконсерванта на основе ГМБТОЭМ для лейкоцитов при низкотемпературном замораживании.

Показано, что при использовании установленной оптимальной концентрации оригинального криопротектора клетки после размораживания сохраняют свои морфофункциональные свойства и ультраструктурную организацию на высоком уровне.

Биологические свойства примененного консерванта для лейкоцитного концентрата, позволяют рекомендовать его дальнейшее изучение в клинических условиях.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Оригинальный криоконсервант для лейкоцитов, разработанный на основе отечественного криопротектора ГМБТОЭМ, нетоксичен, апирогенен и не требует отмывания от суспензии клеток после ее оттаивания.

Апробация работы Основные материалы по теме диссертации доложены и обсуждены на научных и научно-практических конференциях КНИИГТЖ (1997, 1998, 1999, 2000), 25-ом Международном конгрессе по переливанию крови (Осло, Норвегия 1998), на республиканской конференции «Актуальные вопросы трансфу-зиологии» (Киров, 2000), на научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (С. Петербург, 2000), на съезде Российского общества физиологов им И. П. Павлова (Казань 2001), а также заседаниях Кировского областного научного общества гематологов и трансфузио-логов (1999, 2000).

Публикации материалов исследования По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, в том числе две из них в центральной и одна в зарубежной печати. Получен один патент.

Объем и структура диссертации.

Диссертация представляет собой рукопись объемом 99 страниц компьютерного текста и состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, указателя использованной литературы, который содержит 171 наименований работ, в том числе 115 отечественных и 56 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 6 рисунками.

выводы.

1. Разработан криоконсервант для низкотемпературного консервирования лейкоцитов, содержащий 30% ГМБТОЭМ, 1% лимонной кислоты и воду для инъекций (остальное).

2. Предложенный раствор обеспечивает высокую морфологическую (87,3 + 3,3%) и выраженную функциональную (58,6 ± 3,9%) сохранность лейкоцитов (по данным тестов in vitro) и не требует отмывания от клеточной суспензии после ее размораживания.

4. Новый криозащитный раствор по физико-химическим и биологическим (пирогенность, генотоксичность, острая и хроническая токсичность) свойствам обладает низкой токсичностью и хорошей переносимостью лабораторными животными, как в чистом виде, так и в смеси 1:1с размороженными аутологичными лейкоцитными концентратами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современный этап развития трансфузиологии предусматривает расширение показаний для клинического применения лейкоцитного концентрата. Данная трансфузионная среда эффективна при ряде патологических состояний, сопровождающихся лейкопенией: медикаментозном агранулоцитозе, сепсисе, некоторых инфекционных заболеваниях, а также у гематологических и онкологических больных с угнетением лейкопоэза после химиотерапии и облучения [1,5, 13,33,82].

Использование трансфузий донорских и аутологичных лейкоконцентратов позволяет заместить утраченную функцию клеточного звена иммунитета особенно в тех случаях, когда иммунотерапия неэффективна или противопоказана [9,47,59,71,105].

Тем не менее, применение трансфузий лейкоконцентрата до сих пор ограничено из-за отсутствия этой трансфузионной среды в достаточном количестве. Известно, что лейкоциты являются сложными по структуре и функциональной активности клетками, поэтому при хранении в диапазоне положительных температур быстро теряют свою жизнеспособность.

Для эффективной трансфузионной терапии требуются большие количества лейкоцитов. Решение данной проблемы состоит в разработке новых способов криоконсервирования концентрата лейкоцитов, создания запасов и последующего длительного хранения выделенных аутологичных лейкоцитов больных и НЬА — типированных доноров в замороженном состоянии.

Наиболее изученными методами долгосрочного хранения лейкоцитов в функционально полноценном состоянии является их замораживание при ультранизких температурах (- 196 0 С) [30, 52, 99 ]. Следует заметить, что указанные способы требуют применения дорогостоящего оборудования и наличия постоянных запасов жидкого азота, что делает технологию криоконсервирования сложной, громоздкой, экономически неэффективной.

Успешное замораживание ядерных клеток крови невозможно без применения криофилактических веществ, предотвращающих повреждение клеток в процессе охлаждения и образования кристаллов льда. Из ранее применяемых известны криопротекторы: глицерин, ДМСО, ДМАЦ, ПЭО — 400, однако, все они обладают рядом недостатков (отсутствие промышленного производства в РФ, токсичность по отношению к замораживаемым клеткам и организму реципиента, необходимость удаления из биосреды перед клиническим применением). Большинство авторов, в качестве криопротекторов при замораживании лейкоцитов наиболее часто применяют диметилсульфоксид и глицерин. Однако токсичность ДМСО и обусловленные им посттрансфузионные реакции препятствуют его широкому клиническому применению, а глицерин в концентрации, необходимой для криозащиты, вызывает необратимые повреждения клеток.

Целью настоящего исследования явилась разработка нового метода криоконсервирования концентрата лейкоцитов путем нелинейного быстрого двухступенчатого замораживания до -80 0 С с новым ограждающим раствором на основе криопротектора ГМБТОЭМ, не требующим отмывания после оттаивания клеточной суспензии, и с применением низкотемпературных морозильников для хранения.

Материалом исследования служили образцы нескольких серий криокон-сервантов на основе криопротектора ГМБТОЭМ и донорские лейкоциты, консервированные низкотемпературным замораживанием с указанными криофилак-тиками. В исследованиях использовано 103 образца концентрата лейкоцитов, полученных от 68 доноров и 183 животных четырех видов.

На начальном этапе разрабатывали лекарственную форму нового криокон-серванта для замораживания лейкоцитов, содержащего вещество — гексамети-ленбистетраоксиэтилмочевину (ГМБТОЭМ) в начальных концентрациях от 10 до 40%, лимонную кислоту и воду для инъекций, изучали физико-химические свойства растворов.

Полученные данные свидетельствуют о стабильности основных показателей исследуемых растворов т.к. оптическая плотность среды, концентрация водородных ионов, цветность и вязкость ее не изменялись при хранении в течение длительного времени (более 1года).

Изучение влияния криоконсервирующих растворов с ГМБТОЭМ на натив-ные донорские лейкоциты в динамике, в процессе 20−90-минутной эквилибрации выявило, что они не оказывали на клетки разрушающего действия.

Контролем в экспериментах служили данные оценки морфологических и функциональных свойств лейкоцитов до их контакта с исследуемыми криофи-лактиками. После инкубации нативных лейкоцитов с криозащитными растворами, содержащими 10%, 15% и 20% ГМБТОЭМ в процессе 20-ти, 60-ти и 90-минутного контакта не происходило разрушения клеток. Даже после 90 — минутной экспозиции сохранялось более 85% клеток от исходного количества, хотя наблюдалось достоверное уменьшение показателей ФАН со всеми исследуемыми растворами до 53,3±4,3% с раствором № 5, до 55,8±7,55% с № 3 и до 49,4±3,9% с № 7 в сравнении с данными до инкубации. Незначительно снижалось количество жизнеспособных клетокс раствором № 5 до 93,9±1,3%, № 3 до 91,0±1,6% и № 7 до 93,4±2,1%. Криоконсервант оказывал слабое ингибирующее действие на функциональную активность лейкоцитов через 60 и 90 минут инкубации. В течении 20 минут, необходимых для подготовки лейкоцитов к замораживанию не происходило существенных изменений данных показателей.

Наилучший результат был отмечен при инкубации в течение 20 минут раствором № 5, в котором конечная концентрация ГМБТОЭМ составляет 15%).

Высокая сохранность лейкоцитов подтверждена данными электронной микроскопии. Отмечена сохранность архитектоники клеток. Поверхностная ци-томембрана гранулоцитов, как правило, не имела повреждений. Ядра клеток не отличались от интактных (до замораживания). В ядерной оболочке наблюдали расширение пор. Сохранность архитектоники лимфоцитов после оттаивания была лучше, чем гранулоцитов при исследуемых концентрациях растворов крио-протектора ГМБТОЭМ, что обусловлено более высокой криоустойчивостью данного вида клеток.

Сроки хранения клеточной взвеси в наших исследованиях составляли от 7 дней до 12 месяцев, после чего клеточную взвесь размораживали и исследовали сохранность клеток. Установлено, что при использовании раствора № 5 сохранность лейкоцитов составляла 88,7 ± 11,9%, жизнеспособность в пробе с супра-витальным окрашиванием 73,1± 15,7%. Сохранность ФАН зависела от срока хранения, если в начале она была равна 59,6 ± 11,2%, то после года хранения процент был равен 44,9 ± 10,2%.

Существенно, что процентное содержание цитохимически активных палоч-коядерных и сегментоядерных нейтрофилов снижалось незначительно. Следует отметить, что средние цитохимические показатели реакций (СЦГТР) оказались статистически несущественно различными (р>0,05). Наибольшим изменениям подверглось содержание липидов, их снижение с 99,1% до 88,8% явилось статистически достоверным. Показатели гликогена и пероксидазы по сравнению с ин-тактными лейкоцитами не подверглись значительным изменениям.

Для изучения характера и степени выраженности развивающихся повреждений при криоконсервировании были изучены содержание и характер распределения в цитоплазме клеток гранул у нейтрофилов. Достоверно (р<0,05) повышается окислительно-восстановительный метаболизм лимфоцитов, о чем свидетельствует изменение процента клеток с темно-синими гранулами формазана в цитоплазме с 1,71+0,49% до 9,67±5,51% у нейтрофилов с 4,80±1,30% до 12,20±0,85%.

Изложенное позволяет считать, что в пределах исследуемого интервала времени при описанных условиях хранения клетки сохраняют достаточный уровень биологической полноценности, что не исключает возможность их использования в клинике.

При токсико-фармакологическом исследовании нашего криозащитного раствора, проведенном на 4 видах лабораторных животных (кролики, собаки, мыши, морские свинки) и на клетках периферической крови человека было показано отсутствие каких-либо отрицательных реакций.

Острую токсичность изучали при введении лабораторным мышам с массой тела 19 — 20 г в хвостовую вену 0,5 мл растворов ГМБТОЭМ в 5%, 7,5%, 10%,.

12,5%, 15%, 17,5 и 20% конечных концентрациях. Эта доза в пересчете на «сухое вещество» составляет от 0,88 до 3,85 г/кг массы тела животных. После внутривенного введения препарата срок наблюдения за животными составил 5 суток. В ходе эксперимента не отмечено гибели мышей и каких-либо отклонений в их поведении и внешнем статусе. ЛД50 ГМБТОЭМ для мышей составляет 15,5 ± 0,6 г/кг массы, что доказывает низкую токсичность ограждающего раствора по сравнению с другими известными криопротекторами. При сопоставлении данных по ЛД50 для ГМБТОЭМ и других криопротекторов, используемых для замораживания биообъектов, сделан вывод, что токсичность ГМБТОЭМ более, чем в 3 раза ниже, чем у глицерина, диметилацетамида и в 4 раза ниже, чем у ДМСО.

Определение острой токсичности криофилактика произведено на кроликах породы «Шиншилла» весом 2100−2700 г. Им внутривенно вводили с целью сокращения объема тест-дозу раствора в 20%-й конечной концентрации ГМБТОЭМ. Указанная доза вводимого криофилактика составляла 3,3 г/кг массы тела кролика, что в 4 раза больше, чем получает реципиент при инфузии максимальной дозы размороженных клеток. При патологоанатомическом вскрытии животных изменений со стороны внутренних органов и систем не обнаружено как на макроскопическом, так и гистологическом уровнях, что дает основания сделать вывод об отсутствии «острой» токсичности исследуемых растворов ГМБТОЭМ.

При изучении мутагенной активности криоконсерванта по влиянию на частоту хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей достоверных отличий в контрольной (частота аберраций 0,012 ± 0,005) и опытной группах (частота аберраций 0,016 ± 0,005) не было отмечено. Можно утверждать, что крио-протектор ГМБТОЭМ не оказывает генотоксического действия на соматические клетки и не индуцирует кластогенный эффект.

Морфологические изменения органов лабораторных животных, выявляемые обычными гистологическими методиками, однотипны и представлены в основном расстройствами кровообращения по типу полнокровия, кровоизлияний, отека стромы. Изменения в легких, связанные с расстройством кровообращения, вызваны, очевидно, способом эвтаназии с применением эфира, т.к. наблюдались в обеих группах мышей как в опытной, так и в контрольной.

При исследовании переносимости размороженной взвеси лейкоцитов, криоконсервированных с ограждающим раствором на основе ГМБТОЭМ, при ее внутривенном введении экспериментальным животным (собаки) установили, что масса, температура тела, частота сердечных сокращений животных после трансфузии размороженных аутологичных лейкоцитных концентратов не изменились по сравнению с исходными показателями. Достоверных изменений в показателях гемограмм собак до и после трансфузии не было выявлено, что дает возможность их применения с целью апробации в клинических условиях.

Итак, на основании проведенных комплексных физико-химических и биологических исследований доказано, что разработанный криоконсервирующий раствор безвреден для организма, стабилен в процессе хранения и не требует отмывания перед введением деконсервированных клеток реципиенту, обеспечивает высокую морфологическую и функциональную сохранность лейкоцитов при низкотемпературном замораживании.

Результаты выполненных исследований свидетельствуют о возможности развития консервирования лейкоцитов при низких температурах в пластикатной таре отечественного производства. Это позволяет повысить эффективность низкотемпературного консервирования, значительно упростить его для учреждений службы крови, отказавшись от применения жидкого азота, алюминиевых контейнеров и аппаратов программного замораживания.