Роль активных форм кислорода в регуляции функций клетки

Актуальность. проблемы. Активные формы кислорода, к которым относятся, в частности, перекись водорода (Н202) и супероксиданион (02*" Х являются продуктами одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода. Начало исследований их биологической роли можно датировать 1969 годом, когда была открыта супероксиддисмутазная активность белка эритрокупреина [1] - белка, который катализирует дисмутацию супероксидных радикалов. С этим открытием появилась возможность регулировать количество АФК во внеклеточной среде и таким образом выяснять роль АФК в жизнедеятельности клетки. На протяжении многих лет биологическую роль АФК видели лишь в их токсическом действииэти соединения рассматривали как химическое орудие, которьм профессионально фагоцитирующие клетки (макрофаги и нейтрофшш) защищают организм от инфекционного поражения.

Ряд открытий начала 1990;х годов вызвал активную дискуссию относительно другой, регуляторной роли, которую эти соединения (в узком диапазоне концентраций) могут играть во внутриклеточных процессах. Так, было показано, что параллельно с рецептор-опосредованной активацией транскрипционного фактора КРкВ в клетках образуются АФК [2], что привело к открытию посреднической роли молекулы Н202 в передаче сигнала от рецептора фактора роста к транскрипционному фактору №кВ в клетках гладкой мускулатуры [3]. Было обнаружено, что не только профессиональные фагоциты, но и клетки других типов имеют специальный механизм образования АФК (см. обзор: Клюбин, Гамалей, 1997), и, наконец, признали, что химический потенциал и Н202, и 02″ недостаточен для некротического действия на клетки. Эти работы стимулировали многочисленные исследования новой роли АФК в клетке. Всплеск этих исследований (см. обзор: ОатаЬу, ЮуиЪш, 1999) окончательно утвердил проблему регуляторной роли АФК в функционировании клетки. Однако основной круг вопросов — механизмы возникновения в клетках АФК, физиологические условия для их образования, мишени на поверхности и внутри клетки, на которые действуют АФК, и, наконец, молекулярные механизмы действия АФК — пока не находит достаточного объяснения и является предметом пристального изучения.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы — выяснить роль АФК в функциональных ответах клетки.

При исследовании проблемы решали следующие задачи. 1) Рассмотреть механизмы образования АФК в клетках. 2) Выяснить, способны ли неиммунокомпетентные клетки отвечать образованием АФК при стимуляции. 3) Исследовать действие Н202 и 0'~ в малых (неповреждагопщх) дозах на функции макрофагов. 4) Изучить диффузию Н202 в условиях, приближенных к биологическим. 5) Исследовать ионную сигнализацию клеток (мембранный потенциал и концентрацию свободного Са2' ([Са2'],) в клетках при активации разными агонистами и самими АФК. 6) Сравнить ионные ответы клеток при стимуляции, идущей с промежуточным образованием АФК и без него. 7) Выяснить, участвуют ли АФК в пролиферативном ответе клетки.

Научная новизна полученных результатов. Проведено комплексное исследование действия на клетки АФК в малых (неповреждающих) концентрациях. Показано, что Нг02 в диапазоне концентраций 0,1−20 мкМ может быть активатором функций клетки.

Впервые показаны модулирующий эффект Н2О2 на фагоцитоз макрофагов и способность Н2О2 вызывать хемотаксис перитонеальных нейтрофилов мыши. Измерен коэффициент диффузии ИгОг в среде культивирования клеток. Обнаружено стимулирующее действие Н2О2 на окислительный взрыв макрофагов.

Впервые исследовано изменение [Са2+]- и мембранного потенциала макрофагов при действии Н202 в широком диапазоне концентраций. Впервые проведено сравнительное изучение ответов клеток на стимуляцию биологически активными соединениями, действие которых сопровождается и не сопровождается промежуточным образованием АФК. Впервые показано, что гаперцоляризация плазматической мембраны макрофагов и астроцитов, вызванная взаимодействием агониста с рецептором, связана с АФК-опосредованной активностью К+каналов.

Впервые показано, что у трансформированных фибробластов 1.929 внутриклеточный уровень АФК зависит от фазы клеточного цикла.

Продемонстрированы достоинства флуориметрических измерений одиночных клеток.

Научно-практическая значимость. Данные проведенного исследования об участии АФК в функциональных ответах клетки вносят существенный вклад в решение фундаментальной проблемы клеточной биологии — проблемы внутриклеточной и межклеточной передачи сигнала. Результаты исследования прямого действия АФК на функции клеток свидетельствуют о существенной роли баланса окислительно-восстановительных сил в жизнедеятельности клетки и важны для выяснения механизмов, которые обеспечивают и сдвиг, и поддержание этого баланса в клетке на необходимом уровне.

Полученные данные о прямом действии АФК на функции клетки, об АФК-оносредованной активности ионных каналов и об активности АФК-генерирующего механизма в пролиферируюпдах клетках могут быть использованы в решении ряда проблем патологической физиологии (в частности, проблемы окислительного стресса и проблемы клеточной трансформации) и важны для выяснения возможных побочных эффектов различных лекарственных препаратов, включая антиоксиданты, при лечении различных заболеваний.

По изменению активности №АОРН оксидазы макрофагов под действием электромагнитного поля высокой частоты определены оптимальные частота и время действия поля, которое создавалось прибором, созданным в Германии в терапевтических целях (МесШше, Берлин, 1994;1995 гг.).

Полученные результаты могут быть также использованы в учебных целях.

Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на Всесоюзных конференциях «Биология клетки в культуре» (Ленинград, 1988; Санкт-Петербург, 1992, 1994, 1998), Всесоюзных конференциях «Физиология пептидов» (Ленинград, 1988), «Физиологическое и клиническое значение регуляторных пептидов» (Горький, 1990), Симпозиуме стран СНГ «Пути передачи внеклеточного сигнала» (Звенигород, 1993), Европейском конгрессе по клеточной биологии (Прага, Чехословакия, 1994), конференции НАБЕВ «Антиоксиданты в клеточной биологии» (Сакстон-Ривер, США, 1995), Международном конгрессе «Свободные радикалы: здоровье и заболевания» (Стамбул, Турция, 1995), на II съезде Биохимического общества РАН (Москва, 1997), на Международном физиологическом съезде (Санкт-Петербург, 1997), на конференции Физиологического общества Великобритании (Кембридж, Англия, 1997), на конференции Биофизического общества США (Канзас-Сити, 1998, США), на Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 1998). Материалы также докладывались на семинарах и Научном собрании Иститута цитологии, на семинарах в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН (Пущино), в Институте химии Венгерской АН (Будапешт), в Институте молекулярной биотехнологии (Иена, Германия).

Структура и объем работы. Диссертация изложена в форме научного доклада на 41 стр. машинописного текста и иллюстрирована двумя таблицами и 14-ю рисунками. Материалы диссертации отражены в 27 публикациях в отечественных и международных журналах, в том числе в двух обзорных работах и заказной главе в книге Int. Rev. Cytol. Личный вклад автора заключался в постановке цели и задач исследования, участии в проведении экспериментов, обработке, обсуждении и обобщении результатов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

ВЫВОДЫ.

1. Образование активных форм кислорода (АФК) клетками разных типов при активации происходит в результате взаимодействия биологически активного соединения с рецептором. Однако действие не всех, а лишь определенных активаторов вызывает пострецепторное образование АФК и в иммунокомпетентных (перитонеальные макрофаги мыши), и в неиммунокомпетентных клетках (клетки глиальной ткани астроциты, клетки эпидермоидной карциномы А431, фибробласты линии ШНЗТЗ). Образование АФК в клетках является быстро проходящим пострецепторным процессом, активность которого зависит от природы стимула, а также от дозы и времени его действия.

2. Перекись водорода (Н2О2) в концентрационном диапазоне 0,1−20 мкМ активирует ряд функций перитонеальных макрофагов мыши, а именно: усиливает фагоцитоз опсонизированных частиц латекса, усиливает окислительный взрыв макрофагов в ответ на хемотактический пептид фМЛФ, ускоряет транспорт анионов флуоресцеина из клетки.

Последний может рассматриваться как модель секреции клеткой ряда органических анионов, в частности метаболитов арахидоновой кислоты. .3. Н202 диффундирует в среде культивирования клеток и в нетоксичных дозах является хемотактическим агентом для периго и сальных макрофагов мыши. При наличии в среде культивирования клеток концентрационного градиента Н2О2 нейтрофшш двигаются в направлении возрастающей концентрации этого соединения, причем скорость направленного движения сравнима1 с таковой при действии, хемотактического пептида фМЛФ. На основании жданных о диффузии Н2О2 в среде культивирования клеток и данных о том, что секреторный продукт макрофагов Н202 является активирующим стимулом длясамих же макрофагов, сделан косвенный вывод 6 роли Н202 как вторичном, посреднике в межклеточной передаче сигнала. — ¦ ' 4 Механизмы активации функций клеток при действии АФК включают изменение ионного баланса в клетке, И Н202 (в концентрационном диапазоне 0,1−20 мкМ), и 02*" -генерирующая смесь ксантина с ксантинохсидазой вызывают стойкую гаперполяризацию плазматической мембраны макрофагов, астроцитов и трансформированных фибробластов линии 1929. Н2О2 в широком диапазоне концентраций (100 нМ-50 мкМ) вызывает быстро проходящий дозозависимый Са2±ответ в макрофагах, что свидетельствует о способности Н2О2 влиять на все Са2'-зависимые процессы в клетке.

5. Направление сдвига мембранного потенциала макрофагов и астроцитов при активации зависит от природы стимула. Агенты, действие которых сопровождается образованием АФК, гииериолчризукп плазматическую мембрану клеток, в то время как агенты, не активирующие механизм образования АФК, деполяризуют ее. Гиперполяризационный ответ клеток связан с Ог* -опосредованной активностью Са2'-зависимых К" каналов. Обнаруженное участие 02″ во внутриклеточной сигнализации при активаций клеток пополняет растущий перечень данных об участии АФК (в нетоксичных концентрациях) во внутриклеточной передаче сигнала.

6. Внутриклеточный уровень АФК у трансформированных фибробластов линии 1−929 зависит от фазы клеточного цикла — резко возрастает во время поздней фазы О! и фазы 8 и снижается во время фазы <30 и 02/М. От фазы клеточного цикла зависит и изменение мембранного потенциала этих клеток в ответ на действие Н202: при минимальном уровне АФК в клетках мембрана гиперполяризуется, а при максимальном.

— незначительно деполяризуется. Эта зависимость свидетельствует о том, что мембранный потенциал пролиферирующих клеток является не постоянным, а меняющимся параметром. Блокада Са2~-зависимых К" каналов устраняет гиперполяризацию, вызванную действием Н202, что свидетельствует о вовлечении К каналов в шперполяризационный ответ клеток. Данные позволяют выдвинуть гипотезу о том, что для успешной пролиферации клеток необходима АФК-опосредованная активность К+ каналов.

Таким образом, основной итог работы — подтверждение широко обсуждаемой в литературе гипотезы о том, что АФК, включаясь во внутриклеточную передачу полученного клеткой сигнала, могут регулировать ряд функций клетки.