Бруцеллезные бактериофаги. 
Оптимизация технологии производства и способов применения в лабораторной диагностике бруцеллеза

Актуальность проблемы

Среди более чем 180 нозологических форм зоонозных инфекционных заболеваний бруцеллез по-прежнему не утратил своей значимости в связи с масштабами экономического ущерба животноводству и здоровью населения [Черкасский Б.Л., Иванова А. А., 1996; Авилов В. М. и др., 1997; Антоненко А. Д., 2000; Онищенко Г. Г., 2002; WHO, 1997].

Если к настоящему времени во многих странах мира, где раньше регистрировалась высокая заболеваемость людей бруцеллезом (Австралия, Англия, США, Новая Зеландия), наблюдается тенденция к полному его искоренению, то в Российской Федерации ежегодно регистрируются до 500 случаев впервые выявленного бруцеллеза [Онищенко Г. Г. и др., 1999]. Наиболее неблагополучными по бруцеллезной инфекции являются Северо-Кавказский, Поволжский, Сибирский регионы России [Калиновский А.И. и др., 1998], причем на долю административных территорий Южного Федерального округа приходится до 30% случаев первично выявляемой заболеваемости данной инфекционной патологией [Таран И.Ф. и др., 1999].

Бруцеллёз, как правило^ диагностируется уже при развитии хронического процесса, когда практически у каждого четвёртого заболевшего наблюдается стойкая утрата работоспособности. Учитывая, что инфекция возникает в основном у лиц трудоспособного возраста (20−50 лет), затраты на выплаты по инвалидности, на лечение и реабилитацию оказываются значительными. Несмотря на то, что бактериологическое подтверждение инфицирования бруцеллезом на практике регистрируется лишь в 3−10% наблюдений, выделение культуры возбудителя является абсолютно достоверным подтверждением диагноза заболевания, а установление видовой принадлежности и биовара штамма-изолята имеет решающее значение при эпидемиологическом расследовании, а также определении тактики и объема необходимых противоэпидемических мероприятий.

Лабораторная диагностика бруцеллеза в России у людей проводится в соответствии с методическими указаниями (МУ 3.1.7.1189−03) «Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллёза людей» [2003], регламентирующими бактериологический, иммуносерологический, молекулярно-генетический и аллергический методы исследования. Принятая схема межвидовой дифференциации штаммов бруцелл предусматривает использование в комплексной схеме определение чувствительности бруцелл к лизирующему действию бактериофага Тб.

В соответствии с рекомендациями объединенного комитета экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу [1986] в числе комплексных тестов дифференциации выделенных штаммов возбудителя бруцеллеза применяется определение чувствительности изолятов к литическому действию бруцеллезных диагностических бактериофагов Тб (Тбилиси), Fi (Firenze), Wb (Weybridge), Bk2 (Berkley), R-фага.

В настоящее время в Российской Федерации отсутствует коммерческое производство бруцеллезного диагностического бактериофага Тб, а технология производства бактериофагов Wb, Fi, Bk2 и R вообще не разработана. Данные обстоятельства определяют необходимость разработки нормативной документации и создания современной биотехнологической цепи производства бруцеллезных фагов, налаживания выпуска этих диагностических препаратов, отсутствие которых затрудняет выполнение всего комплекса тестов межвидовой

Ч" дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза.

В связи с тем, что ни один из описанных бруцеллезных фагов не обладает строгой видовой специфичностью литического действия [Corbel М., Thomas Е., 1980] представляется важным изучение возможности получения новых ви-доспецифических препаратов бруцеллезных бактериофагов с использованием для этих целей индуцированного мутагенеза.

Сложность, длительность и комплексность видового определения выделяемых штаммов возбудителя бруцеллеза определяют актуальность разработки и практического внедрения методических подходов, обеспечивающих идентификацию и межвидовую ' дифференциацию штаммов бруцелл эпидемически значимых видов (В. melitensis, В. abortus, В. suis), в том числе с использованием диагностических бактериофагов.

Цель исследования

Усовершенствовать схему лабораторной диагностики бруцеллеза путем использования на этапах идентификации и дифференциации штаммов бруцелл оптимального набора бруцеллезных диагностических бактериофагов, разработать эффективную и экономичную технологию производства препаратов бруцеллезных бактериофагов, определить пути ее совершенствования.

Основные задачи

1. Изучить спектры литической активности различных бруцеллезных бактериофагов.

2. Определить оптимальный набор бруцеллезных диагностических бактериофагов для использования на различных этапах бактериологической диагностики бруцеллеза.

3. Изучить возможность использования индуцированного мутагенеза с применением химических соединений для получения новых видоспецифиче-ских бруцеллезных бактериофагов.

4. Разработать технологию экспериментально-производственного получения бруцеллезных диагностических бактериофагов Тб, Fi, Wb, Bk2 с использованием сред немясного происхождения, вакцинных штаммов размножения, оптимального консерванта.

5. Разработать нормативную документацию (фармакопейную статью предприятия, инструкцию для применения, экспериментально-производственный регламент) для выпуска препаратов бруцеллезных бактериофагов в производственных условиях.

6. Апробировать возможность применения стандартной синтетической питательной среды для репродукции бруцеллезных бактериофагов.

7. Изучить возможность совершенствования отдельных технологических этапов производства бруцеллёзных бактериофагов путем оптимизации усю ловий размножения бактериофагов и режима лиофилизации.

8. Разработать новые методические приемы для определения фагочув-ствительности штаммов возбудителя бруцеллеза различных видов.

9. Усовершенствовать этапы идентификации и дифференциации Brucellae spp. при лабораторной диагностике бруцеллёза за счёт использования оптимального набора бруцеллезных бактериофагов.

Научная новизна и теоретическая значимость

Впервые определен оптимальный набор фаговых препаратов для использования на различных этапах бактериологической диагностики бруцеллеза.

Разработан ускоренный способ межвидовой дифференциации эпидемически значимых представителей рода Brucella (В. melitensis, В. abortus, В. suis) с использованием теста фагочувствительности и определения адениндезаминаз-ной активности штаммов бруцелл.

На основе сравнительного изучения биокинетических особенностей одиночных циклов размножения бруцеллезных бактериофагов на штаммах возбудителя бруцеллеза с различным уровнем вирулентности подобраны оптимальные условия, позволяющие осуществлять репродукцию фагов с высокой степенью эффективности и обеспечивающие максимальный уровень биологической безопасности технологического цикла.

На основании сравнительного изучения способности бруцеллезного бактериофага переживать состояние анабиоза в результате воздействия низких температур, удаления свободной и связанной влаги подобраны оптимальные криопротекторы и отработаны режимы лиофилизации, обеспечивающие получение конечного высушенного препарата с высоким показателем уровня выживаемости фаговых корпускул (72,48±1,52%) и удовлетворяющих нормативным требования показателя потери в массе при высушивании (3%) .

Разработана оригинальная высокопродуктивная методика размножения бруцеллезных бактериофагов в жидкой питательной среде, включающая установление оптимального соотношения (множественность инфекции) концентрации фага и штамма размножения, равного 0,01 — 0,001, в репродуктивной среде, и в которую для обеспечения необратимости и эффективности адсорбции фаговых корпускул на поверхности бактериальной клетки дополнительно внесены сульфат кальция и магния в концентрации 0,001 М каждого. Методика защищена патентом Российской Федерации на изобретение № 2 126 833.

Экспериментально установлено, что результатом химического индуцированного мутагенеза является получение h-мутантных линий бактериофагов, характеризующихся измененным спектром активности в сторону внутриродового расширения литических свойств. С применением химических мутагенов нитро-зогуанидина и этилметансульфоната впервые получены новые линии бруцеллезного бактериофага Тб, обладающие литической активностью в отношении штаммов бруцелл вида В. melifensis.

Разработан оригинальный способ идентификации бактерий рода Brucella с различным уровнем чувствительности к лизирующему действию бруцеллезных фагов, для обеспечения которого подобраны условия, повышающие степень адсорбции бактериофага на клеточной стенке бруцелл за счет предварительного смешивания взвеси исследуемых штаммов с фагом в соотношении 1:3−1:4, инкубации в течение 20−30 мин при температуре + 36−38 °С и последующим нанесении смеси на агаровые пластинки. Метод защищен патентами Российской Федерации на изобретение № 2 010 853 и № 2 059 722.

Предложен новый спосрб оценки пороговой чувствительности штаммов бруцелл к действию бруцеллезных бактериофагов, заключающий в приготовлении градиентных фаговых препаратов на бумажных носителях и позволяющий количественно и качественно оценивать чувствительность бруцеллезного микроба к лизирующему действию бактериофагов. Метод защищен патентом Российской Федерации на изобретение № 2 147 610.

Практическая значимость

• Разработана технология экспериментально-производственного получения бактериофагов диагностических бруцеллезных жидких Тб, Fi, Wb, Bk2, обеспечивающая соблюдение^максимального уровня биологической безопасности технологического цикла, включающая репродукцию их на культурах вак

12 цинных штаммов с применением сред немясного происхождения.

• Составлена нормативная документация (экспериментально-производственный регламент (ЭПР), фармакопейная статья предприятия (ФСП), инструкция по применению) на бактериофаги диагностические бруцеллезные жидкие, одобренная Ученым Советом Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (СтавНИПЧИ) [протокол № 5 от 28.05.2001 г.].

• Три экспериментально-производственные серии препарата «Бактериофаги диагностические бруцеллезные жидкие» успешно прошли контрольные испытания на базе Государственного института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов (ГИСК) им. JI.A. Тарасевича, нормативная документация (ЭПР, ФСП, инструкция по применению) представлена на Ученом Совете ГИСК им. JI.A. Тарасевича, комитетом МИБП утверждена программа Государственных испытаний бактериофагов диагностических бруцеллезных жидких и разрешено их проведение [протокол № 4 от 24.06.04 г.].

• Бактериофаги диагностические бруцеллезные жидкие прошли лабораторные испытания на базе Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» (РосНИПЧИ) [акт лабораторного испытания фагов, утвержденный директором РосНИПЧИ «Микроб» В. В. Кутыревым от 15 апреля 1998 г.], депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» и рекомендованы в качестве маточных производственных [справка о депонировании бактериофагов].

• Бактериофаги диагностические бруцеллезные жидкие апробированы в НИИ микробиологии Министерства обороны Российской Федерации при идентификации и межвидовой дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза [акт внедрения, утвержденный начальником НИИ микробиологии Министерства обороны РФ Е. Пименовым от 27 мая 2003 г.].

• Материалы диссертации использованы при составлении раздела «Бруцеллез» (подраздел «Лабораторная диагностика») в целевых комплексных программах обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения на территории юга России и в Ставропольском крае:

— «Профилактика особо опасных инфекций и санитарная охрана территории Ставропольского края от завоза и распространения конвенционных инфекционных заболеваний на 1993;1995 гг.». Утверждена постановлением главы администрации Ставропольского края 14.10.1993 г.;

— «Обеспечение эпидемиологического благополучия по особо опасным и природно-очаговым заболеваниям и улучшение медико-эпидемиологической обстановки на юге России на 1994;1995 гг.». Одобрена решением Совета Ассоциации социально-экономического сотрудничества республик, краев и областей Северного Кавказа 15.05.1994 г.;

— «Обеспечение эпидемиологической безопасности по особо опасным и природно-очаговым заболеваниям в регионе Северного Кавказа на 1999;2002 гг.». Утверждена решением Ассоциации социально-экономического сотрудничества республик, краев и областей Северного Кавказа 10.12.1999 г.

• Материалы диссертации вошли в сборник методических документов «Лабораторная диагностика возбудителей опасных инфекционных заболеваний» [Саратов, 1998]- в дополнение к информационному указателю штаммов, депонированных в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» [Саратов, 1999]- в методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации [Саратов, 2000]- в методические рекомендации по индикации особо опасных инфекционных заболеваний (чума, туляремия, бруцеллез, сибирская язва, холера) в СПЭБ и СНЛК в условиях чрезвычайных ситуаций [Ставрополь, 2003], утвержденные директором СтавНИПЧИ 27/02.03 г. [протокол № 2]- в методические рекомендации «Бруцеллез. Эпизоотолого-эпидемиологический надзор, лабораторная диагностика, клиника, лечение, диспансерное наблюдение за больными» [Ставрополь, 2003], утвержденные Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 12.02.04 г.

• Материалы диссертационной работы используются при чтении

14 лекций и проведении практических занятий на курсах специализации врачей по особо опасным инфекциям при СтавНИПЧИ.

Диссертационная работа выполнена в рамках государственных тем НИР: «Проблемы зоонозов и пути jjx решения в современных условиях индустриализации сельскохозяйственного производства» (№ Гос. регистрации 18 660 004 639), «Разработка и усовершенствование лабораторной диагностики бруцеллеза» (№ Гос. регистрации 1 910 047 321), «Совершенствование методов и препаратов, используемых для лабораторной диагностики бруцеллеза» (№ Гос. регистрации 1 960 001 790), «Разработка технологии получения бруцеллезных диагностических бактериофагов» (№ Гос. регистрации 1 200 109 093).

Положения, выносимые на защиту

• Предлагаемые бактериофаги бруцеллезные диагностические Тб, Wb, Fi, Bk2 позволяют с высокой диагностической точностью определять фа-гочувствительность бактерий рода Brucella.

• Ускоренный способ межвидовой дифференциации эпидемически значимых представителей рода Brucella (В. melitensis, В. abortus, В. suis) с использованием теста чувствительности к бактериофагам Тб и Вк2 и определением адениндезаминазной активности штаммов бруцелл эффективен при выполнении данного этапа лабораторной диагностики бруцеллеза.

• Технология экспериментально-производственного получения бруцеллезных диагностических бактериофагов Тб, Wb, Fi, Bk2 позволяет осуществлять их репродукцию на вакцинных штаммах с использованием сред немясного происхождения, обеспечивает биологическую безопасность технологического цикла и экономический эффект.

• Предложенные криопротекторы и условия лиофильного высушивания обеспечивают высокий уровень выживаемости бактериофагов.

• Применение разработанных препаратов бруцеллезных бактериофагов на бумажных носителях позволяет существенно упростить постановку теста на фагочувствительность при сохранении точности метода.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на научных конференциях СтавНИП-ЧИ [Ставрополь, 1990;2003].

Материалам диссертации были представлены на областной научной конференции молодых ученых [Ростов-на-Дону, 1989]- на рабочем совещании «Проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций» [Оболенск, 1989]- на межгосударственной научно-профилактической конференции «Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний», посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы [Ставрополь, 1994]- на научно-практической конференции «Эпидемиологические аспекты краевой патологии Ставрополья» [Ставрополь, 1995]- на научно-практической конференции «60 лет противочумной службы Кавказа» [Ставрополь, 1995]- на научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России [Саратов, 1997]- на V и VI итоговых научных конференциях молодых ученых и студентов [Ставрополь, 1997,1998]- на второй международной конференций, посвященной 75-летию института им. Пастера [Санкт-Петербург, 1998]- на юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию научно-исследовательского института микробиологии МО РФ [Киров, 1998]- на второй Всероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» [Саратов, 1998]- на международной конференции «Проблемы биологической и экологической безопасности» [Оболенск, 2000]- на 3-ей международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем» [Махачкала, 2001]- на международной научно-практической конференции «Современный эпидемический потенциал природных очагов чумы», посвященной 10-летию суверенитета Республики Казахстан и 50-летию Талдыкорганской противочумной станции [Талдыкорган, 2001]- на юбилейной научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы», посвященной 50-летию Ставропольского научно-исследовательского противочумного института [Ставрополь, 2002].

Публикации.

Основные результаты диссертации изложено в 40 опубликованных работах, из них в журналах рекомендуемых ВАК Российской Федерации для публикации основных научных результатов докторских диссертаций — 6, патентов -4.

Структура диссертации.

Диссертация изложена на 212 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литераторы, восьми глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 162 источника на русском языке и 87 — на иностранных языках. Материалы исследований иллюстрированы 35 таблицами и 16 рисунками.

выводы

1. На основании впервые проведенных сравнительных экспериментальных исследований спектров литической активности различных фагов бруцелл предложены для практического использования бруцеллезные бактериофаги Тб, Wb, Fi, Bk2, позволяющие с высокой диагностической точностью определять фагочувствительность бактерий рода Brucella, при этом для лабораторной диагностики бруцеллеза на этапе идентификации и дифференциации штаммов-изолятов оптимально применение набора бактериофагов — Тб и Вк2.

2. Разработанный ускоренный способ межвидовой дифференциации эпидемически значимых представителей рода Brucella (В. melitensis, В. abortus, В. suis) с использованием теста чувствительности к бактериофагам и определением адениндезаминазной активности штаммов бруцелл эффективен при выполнении данного этапа лабораторной диагностики бруцеллеза.

3. Впервые разработанная биотехнология производственного получения бруцеллезных диагностических бактериофагов Тб, Fi, Wb, Bk2, включающая их репродукцию с использованием сред немясного происхождения и применение вакцинных штаммов размножения, обеспечивает биологическую безопасность технологического цикла и экономическую эффективность.

4. Впервые предложенный и апробированный в экспериментально-производственных условиях способ стабилизации свойств бруцеллезных диагностических бактериофагов методом лиофильного высушивания с применением пептоно-желатиновой среды при 18-часовом режиме лиофилизации обеспечивает высокое качество конечного продукта по нормативным показателям выживаемости и потери в массе при высушивании.

5. Разработанная оригинальная методика репродукции бруцеллезных бактериофагов, основанная на подборе оптимального соотношения бактериофага и бруцеллезного микроба в реакционной смеси, позволяет добиться необратимости процесса адсорбции на поверхности бактериальной клетки и эффективности его репродукции.

6. Сконструированная синтетическая питательная среда для репродукции бруцеллезных диагностических бактериофагов отличается возможностью ее стандартизации и может быть использована в качестве метода выбора на этапе размножения бактериофагов.

7. Экспериментально доказана возможность получения линий бруцеллезных бактериофагов с измененным спектром литической активности методом индуцированного мутагенеза с применением химических соединений. Получены две новые линии бруцеллезных бактериофагов Тб и Fi, обладающие дополнительной активностью в отношении штаммов бруцелл вида В. melitensis.

8. Предложенная оригинальная методика определения фагочувстви-тельности бактерий рода Brucella, основанная на предварительной инкубации оптимальных соотношений фага и исследуемого штамма и использовании репликатора, увеличивает производительность метода и обеспечивает повышение его чувствительности за счет создания условий для необратимой адсорбции фаговых корпускул на поверхности микробной клетки.

9. Разработанная технология получения бруцеллезных фаговых препаратов на бумажных носителях и способ определения пороговой чувствительности бруцелл к лизирующему действию бруцеллезных бактериофагов с помощью градиентных фаговых полосок позволяют оптимизировать (существенно упростить) постановку теста на фагочувствительность с фагами Тб и Вк2, что даёт возможность рекомендовать применение этой модификации метода для практического использования, в первую очередь, в полевых условиях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В Российской Федерации бруцеллез продолжает оставаться серьезной проблемой здравоохранения и ветеринарии. Ежегодное выявление до 500 «свежих» случаев заболевания людей бруцеллезом свидетельствует об активной циркуляции возбудителя среди сельскохозяйственных животных.

Причиняя значительный ущерб экономике, бруцеллез затрагивает не только сферу животноводства, но и социальную сферу. Нарушение репродуктивных функций животных, вынужденный убой скота, затраты на дезинфекцию, а также лечение и пенсионное обеспечение заболевших работников животноводства в случае возникновения инвалидности нередко сводят к нулю рентабельность хозяйств.

Все это определяет необходимость вложения сил и средств в изучение проблемы бруцеллеза. Одним из возможных путей ее решения является расширение знаний в области микробиологии возбудителя заболевания, а также совершенствование средств и методов его лабораторной диагностики, от чувствительности и специфичности которых зависит быстрота и своевременность постановки диагноза и, как следствие, определение объема и характера проведения противобруцеллезных мероприятий, а также разработка тактики лечения больных.

Несмотря на то, что бактериологический метод не является определяющим при постановке диагноза бруцеллезной инфекции, выделение возбудителя бруцеллеза, установление его видовой принадлежности не только достоверно подтверждает диагноз, но зачастую позволяет установить вероятный источник инфекции, давность заболевания, выбрать наиболее эффективное средство антимикробной терапии.

Межвидовая дифференциация штаммов бруцелл, предусматривающая использование ряда обязательных тестов, включает определение фагочувстви-тельности выделенного штамма. До настоящее время в Российской Федерации отсутствовало коммерческое производство бруцеллезных диагностических фаговых препаратов, что определило необходимость разработки биотехнологии их получения, определения сроков годности и методов стабилизации.

Процесс межвидовой и^внутривидовой дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза с использованием традиционных схем и методических приемов является относительно длительным и трудоемким, поэтому важно было разработать методики оптимизации определения фагочувствительности бруцелл, а также отобрать тесты, обеспечивающие ускоренную и достоверную дифференциацию эпидемически значимых штаммов возбудителя бруцеллеза видов В. melitensis, В. abortus, В. suis.

В качестве исходных моделей были использованы штаммы бруцеллезных бактериофагов, имеющихся в коллекции лаборатории бруцеллеза СтавНИПЧИ. Фаг Тб был получен из Тбилисского института вакцин и сыворотокисходные образцы бруцеллезных диагностических бактериофагов Fi, Wb, Bk2, R-фага были получены из Центральной ветеринарной лаборатории Вейбриджа (Англия) и любезно предоставлены М. Corbelбруцеллезные фаги S708 и JP32A, описанные Moreira-Jacob М. [1968] были любезно предоставленных Ю. К. Кулаковым и В.Н.Гореловым

Для тестирования были использованы штаммы бруцелл, выделенные на территории юга России за последние 20 лет, в числе которых 77 штаммов были в стабильной S-форме и 23 штамма — в стабильной R-форме либо в переходной S-R форме. Представительство по видам распределялось следующим образом: В. melitensis — 25 (6 — не S-штаммов) штаммовВ. abortus — 22 (4 — не S-штамма) штаммаВ. suis — 28 (1 — не S-штамм) штаммовВ. neotomae — 2 штаммаB. ovis — 10 штаммов, B. canis — 3 штамма. При этом виды В. ovis и В. canis были представлены только штаммами в стабильной R-форме. Литическая активность бактериофагов в отношении штаммов возбудителя бруцеллеза определялась для двух концентраций: ДРТ и 104ДРТ.

Анализ результатов показал, что активность бактериофага Вк2 не зависела от используемой концентрации препарата. Все штаммы в S-форме были чувствительны к его лизирующедоу действию. Фаг не проявлял активность в отно

173 шении штаммов возбудителя бруцеллеза в Rи переходной S-R-формах.

Фаг Тб, как в ДРТ, так и в 104ДРТ в 100% наблюдений лизировал штаммы видов В. abortus и В. neotmae, находящиеся в S-форме. Аналогичным действием в отношении штаммов данных видов обладал и бактериофаг Fi.

Гораздо более низкая активность указанных фагов была в отношении штаммов вида В. suis. Бактериофаг Fi в ДРТ лизировал 8 штаммов (28,6%), а в концентрации 104ДРТ — 14 штаммов (50,0%) этого видафаг Тб в ДРТ не обладал активностью в отношении штаммов В. suis, а в 104ДРТ вызывал лизис только 3 (1 0,7%) изученных штаммов.

Все используемые в эксперименте штаммы видов В. abortus, В. neotomae, В. suis в S-форме были чувствительны к литическому действию бактериофага Wb обеих концентраций.

Бактериофаг S708 в отношении изучаемых штаммов возбудителя бруцеллеза обладал активностью почти аналогичной таковой у фага Wb, спектр литической активности бактериофага JP32A соответствовал таковому у фага Fi.

В проведенных экспериментах не удалось установить наличия активности бактериофага R в отношении штаммов возбудителя бруцеллеза, находящихся либо в стабильной R-, либо в переходной S-R-форме. Литические свойства фага проявлялись только в отношении 20 штаммов (71,4%) бруцелл вида В. abortus в S-форме и 2 штаммов вида В. neotomae, а в разведении 104ДРТ бактериофаг дополнительно лизировал еще и 3 штамма (10,3%) вида В. suis также в стабильной S-форме.

Установленные данные позволили рекомендовать использование бруцеллезного фага Вк2 в качестве-дополнительного теста для идентификации культур рода Brucella, поскольку он обладал способностью вызывать лизис штаммов бруцелл всех видов, находящихся в стабильной S-форме. Считаем целесообразным применение фага Тб для межвидовой дифференциации штаммов бруцелл эпидемически значимых видов (В. melitensis, В. abortus, В. suis), т.к. в ДРТ бактериофаг обладал видоспецифичностью литического действия в отношении штаммов вида В. abortus. Оценка чувствительности штаммов возбудите

174 ля бруцеллеза к лизирующему действию набора фагов (Тб, Wb, Fi, Bk2) необходима для углубленного изучения штаммов при научных, исследованиях в специализированных лабораториях.

В наших экспериментах не было установлено литической активности бактериофага R в отношении штаммов возбудителя. бруцеллеза в R-форме, описанной Corbel М, Thomas Т. [1985]. Поэтому не представлялось возможным рекомендовать использование данного фага, для межвидовой дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза.

Литическая активность^{бактериофагов} S708 и JP32A практически полностью совпадала с таковой у фагов Wb и Fi соответственно, поэтому дополнительное их применение для определения фагочувствительности штаммов возбудителя бруцеллеза являлось нецелесообразным.

Сложность и длительность межвидовой дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза определяется отсутствием до настоящего времени единого универсального дифференциально-диагностического теста, что предусматривает применение комплексной оценки по ряду признаков, включая и определение фагочувствительности. В связи с чем вопрос о получении строго видоспецифи-ческих бруцеллезных бактериофагов остается актуальным.

Использование индуцированного мутагенеза с применением химических соединений является одним из подходов, определяющих возможность реализации данной задачи [Гольдфарб Д.М., Беляев Д. Л., 1966; Черник Т. П., Серебряный A.M., 1972; Кривиский А. С. и др., 1973; Петренко В. А. и др., 1982; Loveless А., 1958; Freese Е., 1959; Tessman I., 1959; Bautz Е., Freese Е., 1960; Bautz-Freese Е., Freese Е., 1961; Corbel M.J., 1977].

В связи с этим для получения линий фаговых препаратов с измененным спектром литической активности нами были использованы алкилирующие мутагенные агенты — нитрозогуанидин, нитрозометилмочевина, этилметансуль-фонат, ICR191.

Степень проявления мутагенного действия химических препаратов зависит от их концентраций и длительности применения. При этом наиболее выра

175 женный эффект проявляется при воздействии препаратов, обеспечивающих 5070% летальный эффект на микробные клетки или фаговые корпускулы [Стрель-чукС.Н., 1981].

В экспериментах на бруцеллезных бактериофагах при использовании различных концентраций мутагенов было установлено, что, независимо от вида бактериофага, оптимальной для ожидаемого мутагенного воздействия является концентрация препаратов, равная 2 мг/мл. Построив кривые выживаемости бруцеллезных фагов от времени их экспозиции с мутагенами, были определены уровни 50−70% летального эффекта последних. Было показано, что НГ обеспечивал данное действие в диапазоне 28−38-часовой, ICR191 — 22−32-часовой, ЭМС — 26−36-часовой, а НММ — 32−54-часовой экспозиций.

В результате воздействия НГ ЭМС на бруцеллезные бактериофаги были получены две мутантные линии фагов Fi и Тб, которые обладали более широким спектром литической активности, чем исходные варианты. Расширение спектра активности проявлялось в способности данных линий фагов вызывать лизис представителей рода Brucella козье-овечьего вида. При этом приобретенные свойства препаратов стабильно сохранялись в течение 12 месяцев.

Аналогичным образом была проведена селекция линий бактериофагов в отношении штаммов возбудителя бруцеллеза, находящихся в стабильной R-форме. Было отмечено, что наибольшей мутагенной активностью на бруцеллезные бактериофаги обладал НГ, который индуцировал появление линии бруцеллезного бактериофага Тб, обладающей активностью в отношении R-штаммов бруцелл вида В. abortus, но эти свойства мутантных линий бактериофага Тб не обладали высокой степенью стабильности и специфичности.

Результаты проведенных исследований подтвердили ранее опубликованные данные [Габрилович М.С., 1973], свидетельствующие о том, что исходом индуцированного мутагенеза с использованием химических соединений является появление h-мутантных линий бактериофагов, характеризующихся измененным спектром активности не в сторону его сужения до видоспецифичности, а внутриродовым расширением литических свойств по сравнению с исходными

176 вариантами.

Согласно морфологическим, физическим, химическим и антигенным свойствам бруцеллезные бактериофаги принадлежат к одному семейству [Corbel М., Thomas Е., 1980; Ackerman Н. et al., 1982; Matthews R., 1982]. В то же время проведенные исследования показали, что изученные бруцеллезные бактериофаги обладают относительной специфичностью литического действия в отношении штаммов возбудителя бруцеллеза различных видов. В связи с этим были проведены эксперименты по изучению структуры ДНК референтных бруцеллезных бактериофагов, а также полученных мутантных линий бактериофагов Тб и Fi.

Определение размеров ДНК фагов показало их абсолютную идентичность: независимо от вида бактериофага размер генома составлял приблизительно 25,1 мД. Проведенный рестрикционный анализ фаговых ДНК с использованием эндонуклеаз Eco R^h Ваш HI установил их полное сходство по картине рестрикции как у референтных, так и у мутантных линий бактериофагов. Полученные нами данные полностью подтверждают результаты Segondy М. et al. [1988], Rigby C.L. et al. [1989]

Установленная идентичность геномов бруцеллезных бактериофагов не позволила объяснить относительную специфичность их литического действия в отношении штаммов бруцелл различных видов. Учитывая изложенное можно предположить, что относительная специфичность активности бруцеллезных фагов связана либо с минимальными различиями структуры участков ДНК, кодирующих синтез белков базальной пластины фагов, либо с особенностями фаговых рецепторов бруцелл отдельных видов или различиями в их доступности. Поэтому увеличение концентрации фагов обеспечивает частичный лизис нечувствительных штаммов бруцелл.

Таким образом, в настоящий момент стабильными бактериофагами, применение которых целесообразно для межвидовой дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза, являются фаги Тб, Wb, Fi, Bk2.

Разработка биотехнологических основ производства этих бактериофагов

177 один из главных вопросов, решаемых в нашем исследовании. Этот этап работы включал: подбор питательных сред, определение методов репродукции бактериофаговподбор штаммов размножения фаговустановление методов консервации, условий и сроков хранения конечного продукта производства.

При выборе питательных сред, используемых для размножения бруцеллезных бактериофагов было показано, что для их репродукции с успехом можно применять среды немясного происхождения (бульон и агар Альбими), при этом среднее значение концентраций получаемых фаговых препаратов составляло

2,0 ±0,4)х10п БОЕ/мл, что сопоставимо с концентрацией бактериофагов, получаемых на средах на основе мясного сырья. В то же время в качестве среды выбора для репродукции бруцеллезных бактериофагов можно использовать стандартизованную по своим показателям синтетическую питательную среду [патент Российской Федерации на изобретение № 2 148 638].

При сравнительной оценке методик размножения фагов (на бульонной культуре, в слое агаровой культуры, на агаровой культуре) было показано, что наилучший выход конечного продукта производства давала методика размножения бактериофагов в слое агаровой культуры. В то же время в виду трудоемкости ее осуществления при коммерческом производстве бактериофагов было определено, что применение указанного способа размножения возможно только для репродукции бруцеллезного бактериофага Вк2, воспроизводство которого не удалось осуществить двумя другими способами. В качестве метода выбора для репродукции данного фага можно применять методику размножения на бульонной культуре, однако в качестве жидкой питательной среды использовать разработанную нами синтетическую питательную среду, которая за счет стандартизованного состава обеспечивала получение бактериофага Вк2 в концентрации, удовлетворяющей нормативным требованиям.

Биотехнология производство фагов предусматривает ряд последовательно осуществляемых процессов (центрифугирование, фильтрация), которые в определенной мере являются небезопасными для персонала, занятого в технологическом цикле. В связи с этим для обеспечения биологической безопасности

178 отдельных этапов процесса производства была изучена возможность применения для размножения фагов Wb и Вк2 вакцинных штаммов В. suis 61 и В. melitensis RevI соответственно вместо стандартно используемых вирулентных культур (В. suis 1330, В. melitensis Ispania).

Для обоснования возможности осуществления репродукции бактериофагов на указанных вакцинных штаммах в сравнительном аспекте были изучены одиночного циклы их размножения на типичных кормилках и на предлагаемых нами вакцинных аналогах.

Проведенные исследования показали, что процесс размножения фагов на вакцинных штаммах характеризуется некоторым удлинением латентного периода по сравнению с репродукцией на вирулентных культурах, но в то же время незначительным увеличением выхода фагового потомства.

Предложенные штаммы (В. suis 61 и В. melitensis RevI) были апробированы в качестве штаммов размножения бруцеллезных бактериофагов. Репродукция бруцеллезных фагов Wb и Вк2 в данных условиях позволила обеспечить воспроизводство бактериофагов с конечной концентрацией и показателя ДРТ, удовлетворяющими нормативным требованиям.

Одним из важных аспектов биотехнологии производства бактериальных препаратов является обеспечение условий, исключающих возможность контаминации посторонней микрофлорой конечного продукта. В связи с этим для разработки технологических основ производства бруцеллезных бактериофагов было испытано применение в качестве консервирующих агентов различных концентраций хлороформа и толуола. При этом показано, что оптимальным является применение толуола до 0,25% и 0,5% концентрации в конечном препарате, который обеспечивал стерильность препарата и не влиял на его концентрацию.

С использованием подобранных оптимальных условий репродукции, были получены по 3 экспериментальных серии бруцеллезных бактериофагов Тб, Fi, Wb, размноженные на вакцинных штаммах в бульоне по предложенной методике и по 3 серии бактериофага Вк2, полученные путем репродукции в слое

179 агаровой культуры и на жидкой синтетической питательной среде. Каждая из серий фагов была произведена с использованием различных концентраций консервирующего агента (0,25%-и 0,5% толуола в конечном продукте).

Препараты бактериофагов были стандартизованы по количественным свойствам (концентрация и ДРТ) и по качественным показателям (специфичность и специфическая активность).

Полученные серии бруцеллезных бактериофагов имели достаточно высокую конечную концентрацию, обеспечивающую высокие значения ДРТ, что вполне удовлетворяло требованиям производства. Спектр их литической активности полностью соответствовал таковому у исходных образцов бактериофагов.

Важным этапом производства диагностических' препаратов является определение условий и сроков их годности. С этой целью были апробированы различные температурные режимы (+ 4 °C, 18−22 °С, 37 °С) и сроки хранения (1 -6 лет) фаговых препаратов

Было показано, что выживаемость нативных препаратов бруцеллезных фагов обратно пропорциональна температуре и времени хранения. При этом оптимальными условиями для жидких препаратов бруцеллезных диагностических бактериофагов является температурный режим, равный + 4 °C. Данные условия в течение первых двух лет наблюдения обеспечивали сохранение жизнеспособности препаратов в пределах 90% от исходной.-Другие испытанные температурные режимы хранения (18−22 °С, 37 °С) приводили к резкому снижению выживаемости (2,5±0,2%) фаговых препаратов уже в течение первого года наблюдения.

В результате проведенной серии экспериментальных исследований были предложены биотехнологические схемы экспериментально-производственного получения бруцеллезных диагностических бактериофагов (Тб, Wb, Fi, Bk2) При этом основополагающими технологическими моментами производства фагов являлись: репродукция бруцеллезных бактериофагов (Тб, Wb, Fi) осуществляется на бульонных культурах^вакцинных штаммов размножения {В. abortus 19,

В.suis 1330, В. abortus 19 соответственно) с использованием сред немясного происхождения (бульон Альбими) — размножения бруцеллезного бактериофага Вк2 в технологической схеме производства предусматривает его репродукцию на вакационном штамме (В. melitensis RevI) в слое агаровой культуры также с использованием сред немясного происхождения (агар Альбими).

Предложенные технологические схемы легли в основу составленной нормативной документаци (ЭПР, ФСП, инструкций по применению) на бактеЧ риофаги диагностические бруцеллезные жидкие, одобренная Ученым Советом Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (СтавНИПЧИ) [протокол № 5 от 28.05.2001 г.].

Разработанная нормативная документация (ЭПР, ФСП, инструкция по применению), три экспериментально-производственные серии препарата «Бактериофаги бруцеллезные диагностические жидкие» и проект программы Госиспытаний препарата представлены на экспертизу и контроль в Государственный институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов (ГИСК) им. JI.A. Тарасевича Ч

Бактериофаги диагностические бруцеллезные жидкие апробированы в НИИ микробиологии Министерства обороны Российской Федерации при идентификации и межвидовой дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза [акт внедрения, утвержденный начальником НИИ микробиологии МО РФ Е. Пименовым от 27 мая 2003 г.].

В ряде случаев имеется необходимость наработки фаговых препаратов, имеющих более высокие значения конечных концентраций, для чего нами была предложена оригинальная методика оптимизации условий размножения бруцеллезных бактериофагов Тб, Wb, Fi [патент Российской Федерации на изобре

Ч. тение № 2 126 833]. Для этого’были подобраны оптимальные соотношения концентрации фага и штамма размножения (множественность инфекции) в репродуктивной среде, равные 0,01−0,001, и предложено дополнительное внесение в среду размножения сульфатов кальция и магния в концентрации 0,001 М каждого, что обеспечивало выход бактериофага с конечной концентрацией на 1−2 порядка превышающей образцы, полученные по традиционной методике. Было также показано, что для оптимизации процесса размножения бруцеллезного фага Вк2 возможно использование указанной оригинальной методики, но с применением синтетической питательной среды, в которую дополнительно вносится только сульфат кальция в концентрации 0,001 М.

В настоящее время одним из наиболее эффективных способов сохранения исходных свойств микробиологических объектов является метод их лиофиль-ного высушивания, основанный на предварительном замораживании объектов и непосредственном высушивании при температуре, обеспечивающей щадящее удаление из объекта свободной и связанной влаги [Никитин Е.Е., Звягин И. В., 1971; Фадеева Л. Л., 1977; Белоус A.M., Гриценко В. И., 1994].

При этом основные условия, которые необходимо определить при разработке данного способа стабилизации диагностических препаратов является подбор криопротекторов и режимов лиофилизации.

В проведенных экспериментах были апробированы 5 описанных и наиболее эффективных для фаговых препаратов стабилизирующих систем: 5% раствор бессолевого пептона- 20% раствор лактозы- 10% раствор глютамата натрияпептоно-желатиновая ихахарозо-желатиновая среды.

Оценивая возможность применения тех или иных стабилизаторов для лиофильного высушивания бруцеллезных диагностических бактериофагов по критерию выживаемости, было отдано предпочтение 20% раствору лактозы и пептоно-желатиновому стабилизатору, которые обеспечивали сохранение 7075% жизнеспособных фаговых корпускул в сухом препарате.

Одним из важных критериев, определяющих свойства сухих препаратов, является показатель потери в массе при высушивании. Для бруцеллезных бактериофагов показано преимущество пептоно-желатинового криопротектора в качестве стабилизатора процесса высушивания, который обеспечивал потерю в массе при высушивании в фаговых препаратах — 2,73±0,17%, что удовлетворяло нормативным требованиям (не более 3%).

Исходя из того, что для каждого бактериофага и защитной среды оптимальный режим высушивания может иметь различающиеся параметры, нами были испытаны разные режимы лиофилизации, которые отличались, в основном, диапазоном температурных колебаний, а, следовательно, и скоростью высушивания препаратов.

При этом была апробировано три режима лиофилизации бруцеллезных бактериофагов. Во всех наблюдениях предварительное замораживание препаратов проводили в течение 6 ч при температуре — 40 °C. В дальнейшем были использованы: 18-часовой режим лиофилизации, при котором сублимация материала (как процесс удаления основной влаги) проходила в течение 10 ч, а процесс досушивания составлял 8 ч при конечной температуре подогрева 27±2,5 °С и температуре биоматериала 25 °С- 14-часовой режим — процесс удаления основной влаги проходил в течение 8 ч, удаление связанной влаги при температуре нагрева, равной 45 °C, — в течение 6 ч- 12-часовой режим, при которой удаление основной влаги проводили за 6 ч, удаление связанной влаги при температуре нагрева, равной 65 °C, — в течение 6 ч.

Установлено, что применение 18-часового режима лиофилизации обеспечивало наилучшие результаты выживаемости бруцеллезных бактериофагов в конечном продукте производства (72,48+1,52%). При этом использование обеих сред высушивания (лактоза, пептоно-желатиновая) давало практически равнозначные результаты.

Более жесткий из примененных режимов, при котором досушивание препаратов осуществлялось при температуре 45 °C, обеспечивал также получение препаратов в определенной степени удовлетворяющих требованиям производства: средняя выживаемость бактериофагов независимо от используемого стабилизатора составляла 46,52+2,14%, при некотором преимуществе использования в качестве стабилизатора 20% раствора лактозы. Следует отметить, что при таком режиме лиофилизации улучшался показатель потери в массе при высушивании, который при использовании в качестве стабилизатора 20% раствора лактозы составлял 2,96+0,16% .

7 —

Применение самого жесткого режима лиофилизации (продолжительность 12 ч, досушивание при 65 °С) дало неудовлетворительные результаты: выживаемость составила около 3% в сухих препаратах бактериофагов.

Оценка использования различных концентраций толуола в качестве ингибитора посторонней микрофлоры при проведении лиофилизации препаратов бруцеллезных бактериофагов показала преимущество использования 0,5% раствор толуола, обеспечивающего стерильность конечного продукта производства при сохранении исходных свойств препаратов на достаточно высоком уровне.

Таким образом, рекомендуемым режимом лиофилизации бруцеллезных бактериофагов следует считать 18-часовой режим с применением пептоно-же-латинового стабилизатора. В качестве метода выбора может быть использован 14-часовой режим лиофилизации с применением 20% раствора лактозы или пептоно-желатинового стабилизатора.

•ч,

Полученные лиофилизйрованные формы бруцеллезных бактериофагов были испытаны на возможность длительного хранения в различных температурных режимах (+ 4 °C, 18−22 °С, 37 °С). При этом было установлено, что оптимальным как и для жидких форм является их хранение при + 4 °C. В данных условиях концентрация препаратов и литическая активности в течение трех лет наблюдения оставалась практически на исходном уровне.

Таким образом, стабилизация препаратов бруцеллезных бактериофагов методом лиофильного высушивания позволила увеличить срок их годности до трех лет, что обеспечивает больший экономических эффект производства.

Совершенствование методики постановки теста на фагочувствительность связано с тем, что в ряде случаев приходится проводить межвидовую дифференциацию большого количества штаммов возбудителя бруцеллеза. Работа в этом направлении осуществлялась путем приготовления препаратов бруцеллезных диагностических бактериофагов Тб, Bk2, Wb, Fi на бумажных носителях (фаговые диски, градиентные полоски). Были подобраны оптимальные условия, дозы и концентрации имперегнируемых бактериофагов. Способ приготовления

184 градиентных фаговых препаратов для оценки пороговой чувствительности штаммов бруцелл защищен патентом Российской Федерации на изобретение № 2 137 610.

Использование фаговых препаратов на бумажных носителях значительно упрощало постановку теста на фагочувствительность штаммов бруцелл по сравнению с традиционными методами, обеспечивая те же достоверные результаты теста.

Сравнительная оценка .^охранения свойств фаговых препаратов на бумажных носителях в зависимости от условий и сроков хранения показало, что срок их годности составляет 1 год при содержании образцов в условиях холодильника при температуре + 4 °C.

Возможность применения фаговых дисков и градиентных фаговых препаратов для определения фагочувствительности штаммов возбудителя бруцеллеза была апробирована на микроорганизмах рода Brucella как референтных, так и выделенных из различных источников и находящихся в коллекции Став-НИПЧИ в сравнении с традиционно применяемыми методами. При этом было установлено полное совпадение полученных результатов.

Для оптимизации и унификации методики постановки пробы с бактериофагом был предложен способ, при котором на агаровые пластинки репликатором наносится смесь, приготовленная в соотношении 1:3—1:4, взвеси исследуемого штамма в фосфатном буфере и бактериофага, предварительно проинкубированная в течение 20−30 мин при 37 °C. При этом чувствительность штамма к лизирующему действию бактериофага определялась по наличию или отсутствию роста в месте нанесения смеси на агаровую пластинку. Использование данной методики позволило значительно интенсифицировать процесс межвидовой дифференциации штаммов бруцелл за счет возможности одномоментного тестирования большого количества штаммов. Предложенных способ защищен патентами Российской Федерации на изобретение № 2 010 853 и № 2 059 722.

В связи с тем, что в настоящее время основная заболеваемость людей бруцеллезом обусловлена штаммами бруцеллезного микроба видов В. melius tensis, В. abortus, В. suis имелась необходимость подбора минимального набора тестов, позволяющих проводить межвидовую дифференциацию данных представителей рода Brucella.

В результате проведенных исследований для этих целей было предложено использование стандартных тестов родовой специфичности с последующим определением их видовой принадлежности с использованием трех тестов, выполняемых параллельно: определение чувствительности штаммов к лизирую-щему действию бруцеллезных бактериофагов Тб и Вк2 и определение аденин-дезаминазной активности. Использование предложенных тестов позволяло сократить сроки дифференциации выделяемых штаммов возбудителя бруцеллеза с 6 до 2 сут.

Предлагаемые тесты для дифференциации возбудителя бруцеллеза являлись технически простыми и информативными, что наряду с легкой воспроизводимостью и быстротой получения результата (48 ч) позволяло рекомендовать их для использования при предварительной дифференциации штаммов бруцелл в бактериологических лабораториях отделов особо опасных инфекций центров ГСЭН всех уровней.