Оптические свойства растворов белков, содержащих ионы тяжелых металлов

Все наиболее важные химические реакции в живых клетках осуществляются при непосредственном участии белков. Аминокислотные остатки белков обуславливают образование комплексов с антителами, являются местами прикрепления коферментов, осуществляют целый ряд ферментативных реакций. Аминокислотные остатки являются хорошими донорами или акцепторами электронов, что проявляется при образовании комплексов с переносом заряда. Было обнаружено, что некоторые из аминокислотных групп люминесцируют и обуславливают люминесценцию белка [1,2].

В настоящее время для исследования строения атомов и молекул биологически важных веществ широко применяются различные оптические методы [3]. Рентгенография дает прямую информацию о распределении электронной плотности в молекулах и кристаллах. Электронографические и нейтронографические исследования позволяют определять расстояния между атомами в молекулах. По оптическим спектрам определяются энергетические параметры процессов, происходящих в молекулах. Методы светорассеяния позволяют определять статические и динамические параметры растворов — коэффициенты межмолекулярного взаимодействия и массы молекулметод корреляции фотонов — коэффициенты вращательной диффузии и радиусы частиц.

Флуоресцентные методы исследования все шире применяются в биохимических, медицинских и биофизических исследованиях по причине присущим этим методам высокой чувствительности и удобного временного диапазона (испускание флуоресценции происходит за времена порядка 10нс после поглощения света). Структурные превращения, происходящие в исследуемых веществах за это время, способны повлиять на спектральные характеристики их флуоресценции. Поэтому применение флуоресцентных методов, и метода поляризованной флуоресценции в частности, несомненно является мощным инструментом изучения вращательной подвижности частиц в этих системах и необходимым приложением.

Флуоресцентный метод является наиболее чувствительным методом обнаружения и определения количественного содержания люминесцирующего вещества в биологических образцах. В данной работе, например, исследовались растворы с концентрациями компонентов до Ю*10М при объеме одной пробы около 2 мл [Гл.4, с.96].

Очень важное свойство люминесцентного метода как метода биологического эксперимента состоит в том, что измерения люминесценции и спектров поглощения не нарушают естественного хода биологических процессов и, кроме того, могут проводиться в сильно рассеивающих, гетерогенных средах.

Параметры флуоресценции чувствительны к структуре окружения флуорофора, поэтому флуоресцентные методы широко используются для изучения химических превращений различных веществ, изменения их собственной структуры и формы.

Метод поляризации флуоресценции, использованный в данной работе, основан на том, что большие молекулы не успевают изменить свою ориентацию за время жизни возбужденного состояния флуоресценции, в этом случае поляризация оказывается довольно значительной и зависит от величины и симметрии молекулы. Перрен впервые связал характеристики наблюдаемой флуоресценции различных молекул с их динамическими параметрами [4]. Левшин адаптировал метод для изучения тушения флуоресценции посторонними поглощающими веществами [5]. Вебер разработал данный метод для изучения денатурации белков и их комплексообразования с другими высокомолекулярными соединениями [6]. В литературе упоминается также успешное применение метода для изучения взаимодействия мышечных белков с АТФ [7].

В данной работе метод поляризации флуоресценции применялся для исследования сильноразбавленных растворов сывороточного альбумина с токсичными ионами кадмия, свинца, хелатом европия.

Актуальность темы

исследования. Межмолекулярные взаимодействия и динамика белковых макромолекул играют чрезвычайно важную роль в функционировании различных биосистем.

Жизненно необходимым представляется изучение неизбежного влияния на эти системы воздействия токсичных соединений, в том числе соединений тяжелых металлов. Помимо первичного прямого воздействия, на человека косвенно влияет и закисление окружающей среды [8, 9], из-за которого тяжелые металлы легко могут попасть в организм человека по пищевой цепи.

В работе изучалось токсическое действие ионов свинца, кадмия и хелата европия на молекулы сывороточного альбумина.

Ацетат свинца представляет собой бесцветные моноклинные кристаллы со значительной массой, хорошо растворимые в воде и сильно ядовитые [Гл.З, § 2, с.77]. Попадая в кровь и другие биологические жидкости, они даже в небольших концентрациях способны серьезно нарушить нормальное течение физиологических процессов в организме.

Кадмий является хорошим комплексообразователем, легко образует координационные соединения1, многие из которых используются в качестве электролитов. Сульфат кадмия представляет собой белые кристаллы, хорошо растворимые в воде. Как сам кадмий, так и его соли (сульфат Сс1304 и хлорид Сс1С1г), чрезвычайно опасные для человека вещества [Гл.З, § 2, с.78].

Соединения на основе этилендиаминтетраацетата (ЭДТА), хелат европия в частности, широко применяются в медицине и промышленности [гл.З, § 4, с.87], и при определенных концентрациях нарушают нормальное функционирование белков плазмы крови. Применение хелата европия в.

1 то же, что комплексные соединения. Состоят из центрального атома металла-комплексообразователя М, с которым связаны лиганды Ь. Атом М и лиганды Ь образуют внутреннюю сферу комплекса (или внутреннюю координационную сферу). Лигандами могут быть нейтральные молекулы (обычно основного характера), отрицательно заряженные анионы (ацидогруппы). Простые положительно заряженные катионы в роли лигандов не выступают. Для компенсации заряда внутренней сферы комплекса необходимы ионы, образующие внешнюю сферу. Во внешней сфере могут находиться не только ионы, но и нейтральные молекулы, очень часто — молекулы воды [11]. качестве маркера в данном исследовании позволяет изучить природу воздействия ЭДТА на белки, в частности на альбумин. Европий в данном случае может служить изоморфным заместителем ионов кальция или магния [10], что может приводить к нарушению обмена веществ в организмах. В свою очередь сам ЭДТА не подвергается биологическому разложению и, накапливаясь в организме, может становиться токсикантом [12].

Европий принято относить к малотоксичным элементам, хотя последствия его воздействия на организм человека детально не изучались [Гл.З, § 4, с.92].

Ранее в нашей лаборатории методом статического рассеяния света было обнаружено, что присутствие тяжелых ионов в белковых растворах приводит к агрегации частиц [13, 14]. Поведение белков в растворах определяется электростатическим взаимодействием между зарядами на поверхности макромолекул. Однако оказалось, что при определенных условиях, например когда силы заряд-зарядового взаимодействия экранируются ионами тяжелых металлов, существенную роль начинают играть диполь-дипольные взаимодействия, что приводит к изменениям как статических, так и динамических параметров молекул.

Таким образом, несомненный интерес представляет детальное исследование механизма поведения белковых молекул в растворах при наличии ионов металлов с различными значениями заряда и ионного радиуса.

Целью данной работы явилось экспериментальное исследование растворов сывороточного альбумина, содержащих ионы тяжелых металлов и хелата европия флуоресцентными методами, в том числе методом поляризованной флуоресценции.

Для достижения этой цели в работе предполагалось решить ряд задач:

• создание экспериментальной установки на основе Аг-пазера для изучения поляризованной флуоресценции биологических жидкостей в видимом диапазоне длин волн;

• подбор флуоресцентных зондов для исследования вращательной подвижности частиц в растворах альбумина, содержащих ионы тяжелых металлов;

• исследование флуоресценции растворов белков, содержащих соли свинца, натрия и хелат европия;

• получение и сравнение спектров флуоресценции водных растворов альбумина при добавлении токсичных ионов и без них;

• расчет времени корреляции вращательной подвижности и эффективной массы частиц в исследуемых растворах в зависимости от параметров среды (концентрации токсичных ионов, рН);

• сравнение полученных результатов с данными по светорассеянию и корреляционной спектроскопии в тех же системах.

Диссертация состоит из введения, пяти глав и заключения.

Заключение

Основные результаты и выводы.

Итогом проведенной работы явилось экспериментальное исследование возникновения макромолекулярных кластеров в растворах альбумина, содержащих ионы тяжелых металлов и хелата европия с помощью метода поляризованной флуоресценции.

Для достижения этой цели в работе были решены задачи:

1. Создана экспериментальная установка для изучения поляризованной флуоресценции биологических жидкостей в видимом диапазоне длин волн.

2. Исследованы флуоресцентные характеристики зондов флуоресцеин, TNS и DSY, необходимые для проведения экспериментов в видимом диапазоне длин волн.

3. Исследованы флуоресцентные характеристики растворов хелата Ей.

4. Получены флуоресцентные спектры водных растворов альбумина в присутствии токсичных ионов и без них.

5. Получены зависимости характеристик поляризованной флуоресценции частиц в водных и глицериновых растворах БСА при добавлении токсичных ионов.

6. Проведена математическая оценка времен корреляции вращательной подвижности и эффективной массы частиц в исследуемых растворах в зависимости от параметров среды (концентрации тяжелых ионов, рН).

7. Методом поляризованной флуоресценции были исследованы образцы сыворотки крови в норме и при патологии.

По результатам работы можно сделать следующие выводы: 1. Исследования флуоресценции красителей флуоресцеина, TNS и DSY в растворах БСА с ионами токсичных металлов РЬ2+ и Cd2* показали, что интенсивность флуоресценции в области малых концентраций линейно растет с ростом концентрации тяжелых ионовувеличение степени поляризации флуоресценции красителей в растворах БСА с ионами.

164 металлов РЬ2+ и С</+ свидетельствует о росте времен корреляции вращательной подвижности частиц, а следовательно о росте их массы.

2. Обнаружено, что добавление хелата Еи3+ в растворы БСА смещает максимум флуоресцентного спектра в более коротковолновую область, что свидетельствует о взаимодействии молекул хелата с поверхностными группами альбумина.

3. Времена корреляции вращательной подвижности и рассчитанные массы частиц в растворах БСА, содержащих ионы С</+ и РЬ2+, возрастают примерно на порядок по сравнению с временами корреляции вращательной подвижности молекул белка в водном растворе и в растворе, содержащем ионы Ага+.

4. Впервые обнаружено образование наночастиц — белковых кластеров в растворах БСА, содержащих хелат европия. Времена корреляции вращательной подвижности возрастают примерно на порядок по сравнению со временем корреляции вращательной подвижности молекулы альбумина в водном растворе.

5. Обнаружено, что предложенная методика позволяет определять ничтожно малые концентрации токсичных ионов в растворах (~Ю'10М), что возможно использовать для экологического мониторинга.

6. Эффективные (суммарные) времена корреляции вращательной подвижности частиц в растворах сыворотки крови онкологических больных не зависят отрН, что возможно связано с потерей заряда белками в случае онкологических заболеваний.