Потоковая модель метаболизма, связанного с производством водорода бактериями рода Rhodobacter

Актуальность.

В настоящее время, в связи с экономическими и экологическими проблемами, возникающими при использовании традиционных видов топлива, возрастает научная и инновационная актуальность разработок по альтернативным источникам энергии. Водород является перспективным экологически чистым топливом. Хотя в современной промышленности водород получают из ископаемых видов топлива, однако в лабораторных условиях разрабатываются пути его синтеза, безопасные для окружающей среды.

Одним из наиболее перспективных путей синтеза водорода является его получение за счет солнечной энергии с помощью фотосинтезирующих микроорганизмов. В частности, пурпурные несерные бактерии способны образовывать водород как побочный продукт роста культуры на органических отходах. Когда этот процесс будет доведен до индустриальных масштабов, это позволит не только производить экологически чистое топливо, но и очищать окружающую среду. Однако такие существенные преимущества будут достигнуты, только если будет сконструирована рентабельная система производства водорода. Такая система должна быть основана на бактериальных штаммах, производящих водород с наибольшим выходом в удобных для промышленности условиях. Наиболее перспективными кандидатами для крупномасштабного производства биоводорода считаются бактерии из группы пурпурных несерных бактерий, так как они показывают наибольшую эффективность преобразования энергии и могут использовать большое разнообразие субстратов. Из этой группы бактерии рода Rhodobacter являются наиболее распространенными участниками экспериментов по производству водорода.

До недавнего времени выбор подходящего штамма и условий для его оптимального роста и производства водорода требовал постановки большого количества экспериментов. В то же время современные методы системной биологии дают возможность построить эффективно производящую биоводород систему теоретически, что заметно уменьшает объем экспериментальной работы. Один из таких методов, называемый метод баланса стационарных метаболических потоков (Flux Balance Analysis), позволяет построить математическую модель метаболизма бактерии в стационарном приближении на основе данных о наборе генов бактерии. Такая модель называется потоковой или стехиометрической моделью метаболизма. Потоковая модель может быть использована для компьютерной симуляции экспериментов и подбора оптимальных условий для наработки биотоплива. Кроме того, она может быть использована для поиска генных модификаций, приводящих к увеличению наработки водорода или другого химического вещества.

В связи с необходимостью конструирования эффективной производящей биоводород системы, актуальным оказывается построение потоковой модели метаболизма бактерий рода КУюс1оЬас1ег, связанного с производством водорода и изучение особенностей этого метаболизма.

Цель и задачи исследования

.

Главной целью проведённой работы было создание потоковой модели анаэробного метаболизма бактерий рода Якос1оЬас (ег, а именно Я. sphaeroid. es и Я. capsu.la.tus, с помощью которой можно будет разработать инновационную технологию производства водорода этими бактериями, а также исследовать возможности коррекции метаболизма этих бактерий.

В задачи работы входило:

• для каждой из бактерий Я. sphaeroid. es и Я. сарзиШт создание и сопоставление с литературными данными списка биохимических реакций, описывающих анаэробный метаболизм бактерий и достаточных для описания производства водорода этой бактерией;

• для каждой из бактерий Я. sphaeroides и Я. сархиШт создание потоковой модели анаэробного фотогетеротрофного метаболизма с помощью метода баланса стационарных метаболических потоков;

• поиск экспериментальных данных, достаточно подробно описывающих рост и производство водорода культурами Я. sphaeroides и Я. сарзиШш, и проведение сравнения экспериментальных данных с предсказаниями построенной модели;

• на основе потоковых моделей Я. sphaeroides и Я. саряиШиз провести сравнение их анаэробного метаболизма;

• определение изменений в экспериментальных условиях, необходимых для увеличения наработки водорода;

• предсказание мутантов бактерий Я. sphaeroides и Я. сархиШиз, производящих водород с повышенной скоростью.

Научная новизна.

Впервые создана потоковая модель анаэробного метаболизма бактерии Rhodobacter. Эта модель позволяет описывать распределение стационарных потоков вещества, как в центральном метаболизме, так и в метаболизме аминокислот, липидов, и в фотосинтетическом аппарате. Проведено сравнение предсказаний модели с экспериментальными данными и продемонстрирована ее работоспособность.

Впервые с помощью потоковой модели проведена интерпретация экспериментальных данных на всей продолжительности жизни бактериальной культуры.

Впервые предсказаны мутанты Л. sphaeroid. es и Л. сархиШж способные производить водород с более высокой скоростью, чем природные штаммы.

Практическое значение работы.

Построенная модель анаэробного метаболизма бактерий рода Мкн^оЬаМег позволяет провести компьютерный анализ экспериментальных данных о производстве водорода бактериальной культурой и предложить пути изменения экспериментальных условий для оптимизации процесса и увеличения объема наработанного водорода. Кроме того, модель позволяет предсказать влияние различных факторов внешней среды, таких как освещение и тип субстрата, на результат эксперимента. Модель позволяет предсказать генные модификации Л. $ркаего1йе$ и Л. сархиШш, приводящие к созданию штаммов с повышенным выделением водорода. Использовать такой материал можно будет в создании биореакторов, подборе субстратов и штаммов для запуска производства водорода бактериями К. хркаегохйеь и Я. сарзиШт в промышленных масштабах.

Выводы.

1. Впервые построена и апробирована потоковая модель анаэробного метаболизма бактерии рода Rhodobacter. Показано, что предсказываемые моделью скорости роста культуры и наработки побочных продуктов хорошо согласуются с экспериментальными данными.

2. Выявлены различия между наборами биохимических реакций, характеризующими анаэробный метаболизм бактерий R. sphaeroides и R. capsulatus. Теоретически доказано, что эти различия не оказывают существенного влияния на физиологию фототрофного роста указанных бактерий.

3. С использованием построенной модели теоретически показано, что усвоение ацетата при фототрофном росте R. capsulatus не идет по цитрамалатному пути, как считалось ранее. На основании модельных расчетов высказана гипотеза о том, что у R. capsulatus этой цели служит этилмалониловый путь.

4. С помощью разработанной модели показано, что блокировка синтеза полисахаридов у бактерий R. sphaeroides и R. capsulatus приводит к заметному увеличению скорости производства водорода.

5. Предложены группы эффективных генных модификаций клетки R. sphaeroides, приводящие к увеличению скорости наработки водорода в фазе роста культуры. Основной предложенной генной модификацией является выключение гена, кодирующего фосфоглицерат киназу (ЕС 2.7.2.3).

6. Предложены группы эффективных генных модификаций клетки R. capsulatus, приводящие к увеличению скорости наработки водорода в фазе роста культуры. Основной предложенной генной модификацией является выключение гена, кодирующего пируват: формиат лиазу (ЕС 2.3.1.54).

5.5.

Заключение

.

В настоящей главе с помощью построенной и протестированной потоковой модели исследованы особенности метаболизма бактерий рода Rhodobacter. Получены следующие результаты:

— При недостатке азота в среде и в стационарной фазе происходит запасание биополимеров или выделение водорода, формиата и бутирата (п. 5.1). При сильном освещении происходит выделение водорода или запасание полисахаридов, которые являются конкурирующими процессами. При слабом освещении происходит либо запасание РНВ, либо выделение формиата, либо углекислого газа.

— В п. 5.2 показано, что биохимические пути запасания биополимеров и выделения побочных продуктов не отличаются для Л. sphaeroid. es и К. сархиШш, поэтому поведение этих бактерий в стационарной фазе одинаково. При росте при недостатке азота в среде (п. 5.1) распределение потоков в метаболизме в силу линейности модели является суммой распределения потоков при росте клетки и распределения потоков при синтезе побочных продуктов в стационарной фазе. Это означает, что, так как распределение потоков в метаболизме Л. sphaeroides и Л. сарыйа1т одинаково и при оптимальном росте (п. 4.1), и в стационарной фазе, то распределение потоков будет одинаково и при недостатке азота в среде. Поэтому в п. 5.1. приведены результаты исследования производства побочных продуктов при недостатке азота в среде только для Л. саряиШш, так как для Л. sphaeroides оно такое же.

— С помощью построенной потоковой модели предсказаны наборы нокаутов, внесение которых в геном бактерий Л. sphaeroгdes и/или Л. сар$и1а1т приведет к появлению выделения водорода этими бактериями при росте на различных субстратах (п. 5.4). Производство водорода при этом происходит за счет перераспределения потоков таким образом, что в клетке появлялся избыток КАБ (Р)Н, при условии блокирования всех дополнительных стоков КАО (Р)Н, при этом скорость наработки биомассы снижается. Различия в списке биохимических реакций Л. sphaeroides и Л. сарзиШт проявляются именно в наборах нокаутов: группы нокаутов, предсказываемые для Л. сарзиШт основаны на блокировании Ил^бСО (сток КАОН) и РБЬ (выделение формиата), а группы нокаутов, предсказанные для Л. sphaeroides, основаны на перенаправление синтеза глицеральдегид-3-фосфата с глюконеогенеза на синтез через Б-глицерат. Однако надо иметь ввиду, что в модели не были введены ограничения на скорость реакции, поэтому в реальной клетке при перераспределении потоков может оказаться, что реакция, на которую пришелся основной поток вещества в мутанте, на это не рассчитана.

— С помощью потоковой модели Л. саряиШш проведено сравнение различных путей усвоения ацетил-СоА: глиоксилатного шунта, этилмалонилового пути и цитрамалатного пути. Оказалось, что по количеству выделяемого углекислого газа и водорода глиоксилатный и цитрамалатный пути одинаковы, а этилмалониловый путь заметно отличается (п. 5.3). Имеющиеся экспериментальные данные ближе к предсказаниям модели с этилмалониловым путем, на основании чего сделан вывод, что у Л. сар8и1аШ5, скорее всего, действует именно этот путь усвоения ацетил-СоА.

Глава 6. Обсуждение результатов.

Бактерии рода Rhodobacter являются одними из наиболее перспективных производителей биоводорода (Koku et al, 2002; Basak&Das, 2007; Eroglu et al, 2008; Basak&Das, 2009; Obeid et al, 2009). В настоящее время многие исследовательские группы ищут пути влияния на метаболизм этих бактерии, чтобы приспособить их для производства водорода в крупных масштабах. Однако условия, в которых бактерии рода Rhodobacter дают наибольший выход биогаза различаются для разных штаммов и поиск оптимальных условий идет методом подбора для каждого следующего штамма. В этой исследовательской задаче не хватает теоретического осмысления получаемых экспериментальных данных, которое может дать модель метаболизма бактериальной клетки.

Потоковые модели метаболизма уже зарекомендовали себя как полезные инструменты для анализа распределения потоков вещества в метаболизме различных бактерий и для предсказания возможного влияния на жизнедеятельность клетки путем генных модификаций (Durot et al, 2009; Milne et al, 2009). Хотя уже построено много стехиометрических моделей разных бактерий, они не могут быть использованы для анализа метаболизма бактерий рода Rhodobacter, так как отличаются от нее условиями жизнедеятельности (Feist et al, 2009). Среди существующих потоковых моделей метаболизма бактерий, связанного с производством водорода, большинство занимают модели темнового производства водорода (Е. coli (Pharkya et al, 2004; Manish et al, 2007), Citrobacter amalonaticus (Oh et al, 2008), Clostridium butyricum (Cai et al, 2010)), и только одна модель цианобактерии Synechocystis sp. (Montagud et al, 2010) описывает производство водорода фотосинтезирующим микроорганизмом. Все эти модели не могут быть использованы для исследования производства водорода ПНС бактериями, так как у них отличаются как основные синтезирующие водород ферменты (у всех перечисленных организмов используются гидрогеназы), так и фотосинтетический аппарат (у цианобактерий две фотосистемы и оксигенный фотосинтез).

Для анализа метаболизма пурпурных бактерий в 2002 г. была построена потоковая модель центрального метаболизма (Klamt et al, 2002). Однако в этой модели отсутствовали реакции, связанные с производством водорода и биополимеров и не учитывались известные особенности жизнедеятельности Rhodobacter, поэтому они неприменима к анализу производства водорода бактериями рода Rhodobacter.

В настоящей работе представлена потоковая модель анаэробного фотогетеротрофного метаболизма, объединяющая бактерии R. sphaeroides и R. capsulatus. Эта модель, включая в себя кроме путей центрального метаболизма, пути биосинтеза аминокислот, липидов, нуклеиновых кислот и фотосинтетических пигментов, и процессы, происходящие при фотосинтезе, а так же реакции, связанные с выделением водорода и запасанием полимеров, является практически полной моделью анаэробного метаболизма Rhodobacter. При построении модели были учтены такие особенности, как наличие альтернативного пути усвоения ацетата и различный синтез фотосинтетических мембран при разном освещении. Особенностью настоящей модели является возможность использования различных целевых функций для исследования склонностей бактериальной культуры к синтезу различных побочных продуктов. Хотя при построении моделей использовались отдельные наборы биохимических реакций для R. sphaeroides и R. capsulatus, при тестировании модели оказалось, что эти различия не имеют существенного влияния на результаты моделирования, поэтому был сделан вывод о схожести метаболизмов этих двух видов.

Тестирование модели было проведено путем сравнения известных из эксперимента потоков с расчетными, как для фазы экспоненциального роста бактерии, так и для стационарной фазы. Тестирование показало, что модель правильно предсказывает реальные потоки вещества и может быть использована для анализа и интерпретации экспериментов.

Для демонстрации работоспособности модели был проведен анализ двух экспериментальных работ. На первом наборе экспериментов, опубликованном в работе (Hillmer&Gest, 1977а) продемонстрирована способность модели корректно предсказывать распределение потоков в метаболизме R. capsulatus в фазе роста и в стационарной фазе при выделении водорода этой бактерией. Тоже было показано и на втором наборе экспериментов, относящихся к росту культуры R. sphaeroides на среде с манатом и аммонием (Waligorska et al., 2009). Применение двух различных видов целевой функции при моделировании последних данных позволило предположить, что блокирование синтеза биополимеров может привести к возрастанию скорости наработки водорода в фазе роста. Более подробное исследование запасания биополимеров при недостатке азота в среде и в стационарной фазе подтвердило это предположение. Кроме того, численный анализ данных (Waligorska et al, 2009) показал, что бактерии используют весь запасенный полигидроксибутират для производства водорода в стационарной фазе. Этот результат, хотя и предполагался ранее в экспериментальных работах, впервые получил однозначное подтверждение.

С помощью построенной потоковой модели было проведено исследование распределения потоков в метаболизме бактерий при фотогетеротрофном росте на малате и ацетате. Последний субстрат был выбран, так как он в последние годы все чаще используется экспериментаторами как субстрат для роста бактерий рода Rhodobacter (Barbosa et al., 2001; Fang et al, 2005; Laurinavichene et al, 2008; Ozgur et al, 2010). Ацетат представляет особый интерес для промышленного использования пурпурных несерных бактерий, так как является одним из основных составляющих органических отходов (Тао et al., 2008). Результаты выполненных к настоящему времени лабораторных экспериментов по производству водорода бактериями на ацетате не обнадеживают, поскольку эффективность использования данного субстрата составляет около 60% (Fang et al, 2005; Laurinavichene et al., 2008). К тому же пурпурные несерные бактерии при росте на ацетате гораздо более склонны запасать полигидроксибутират, чем при росте на лактате или малате (Koku et al., 2002; Eroglu et al, 2008). Проведенное исследование метаболизма ацетата с помощью потоковой модели позволило количественно охарактеризовать соотношение запасаемых биополимеров и производимого водорода, а также определить метаболические пути (выделение бутирата и формиата, запасание полисахаридов), конкурирующие с выделением водорода.

Метаболизм некоторых пурпурных несерных бактерий характеризуется отсутствием глиоксилатного шунта, необходимого для усвоения ацетата. Считается, что R. capsulatus также относится к подобным бактериям (Meister et al., 2005). Для пурпурных несерных бактерий открыто два запасных пути усвоения ацетата: цитрамалатный путь у Rhodospirillum rubrum (Берг&Ивановский, 2009) и этилмалониловый путь у Rhodobacter sphaeroides (Erb et al., 2007). Хотя в работе (Meister et al, 2005) было продемонстрировано только присутствие у R. capsulatus фермента метилмалил-СоА лиазы, общего для цитрамалатного и этилмалонилового пути, в настоящее время в литературе (Kars et al., 2009; Kars&Gunduz, 2010) считается, что у R. capsulatus присутствует именно цитрамалатный путь. Для проверки этого факта в настоящей работе было проведено сравнение предсказаний потоковой модели R. capsulatus с различными путями усвоения ацетата с имеющимися экспериментальными данными (Ormerod, 1956; Fang et al., 2005; Laurinavichene et al., 2008; Ozgur et al., 2010). Оказалось, что модель с включенным этилмалониловым путем лучше описывает экспериментальные данные по выделению водорода и углекислого газа, чем модель с цитрамалатным путем или с глиоксилатным шунтом. Результаты каждого из экспериментов, относящихся к этой моде роста, можно объяснить недостатком освещения или склонностью к запасанию биополимеров, тем не менее представленные в настоящей работе данные численного моделирования дают возможность провести аккуратную экспериментальную проверку.

Эффективность производства водорода дикими видами бактерий ограничена внутренними связями, некоторые из которых заложены в настоящую потоковую модель. Кроме ограничения на скорость работы нитрогеназы (не учитывается в модели), общее количество произведенного водорода лимитируется следующими факторами: обратное усвоение водорода гидрогеназой (не моделируется, так как может быть легко устранено блокированием гидрогеназы (Kars et al., 2009)), ингибирование нитрогеназы ионами аммония, недостаточное освещение культуры, альтернативные «стоки» электронов, и т. п. (Кагэ&ОйпсШг, 2010). Преодоление этих ограничений приведет к созданию «суперпроизводителя» водорода (Каге&СйпсШг, 2010). С помощью потоковой модели возможно вычислить пути преодоления последних двух из перечисленных препятствий. В то время как расчет необходимого освещения должен проводится для конкретных экспериментальных условий (как было продемонстрировано при тестировании модели), вычисление генных модификаций, приводящих к блокированию альтернативных «стоков» электронов может быть проведено независимо от эксперимента, что и было сделано в настоящей работе.

С помощью построенной модели были сделаны предположения о генных модификациях, которые могут привести к увеличению наработки водорода. Увеличение скорости производства водорода во всех случаях происходит за счет уменьшения скорости наработки биомассы, т. е. снижения скорости роста культуры, что предсказывалось экспериментаторами (МеЫскл е/ а/., 2008). Это положительный момент, так как медленно растущая культура медленнее заполняет объем, и среда дольше пропускает свет. Кроме того, оказалось, что различия в наборах биохимических реакций, описывающих метаболизма бактерий & $ркаегспс1ех и Я. саряиШия, приводят к различным наборам предсказанных нокаутов для этих двух видов бактерий. Группы нокаутов, предсказываемые для Я. сарзиШш основаны на блокировании цикла Кальвина (сток КАОН) и РРЬ (выделение формиата), а группы нокаутов, предсказанные для Я. 5ркаегогс1е8, основаны на перенаправление синтеза глицеральдегид-3-фосфата с пути глюконеогенеза на синтез через Б-глицерат. Но так как в модели не были введены ограничения на скорость реакции, результирующее распределение потоков в реальной клетке может отличаться от предсказываемого, так как при перераспределении потоков может оказаться, что реакция, на которую пришелся основной поток вещества в мутанте, на это не рассчитана. Все предсказанные нокауты, кроме блокирования потока через цикл Кальвина, в настоящей работе предлагаются впервые.

Однако надо помнить, что построенная модель метаболизма использует стационарное приближение, поэтому обладает определенными ограничениями. В то время как модель способна предсказать, как будет распределяться усвоенный клеткой субстрат при различном освещении, она не может дать представления о скорости усвоения субстрата при изменении его концентрации в среде. Тем не менее, стехиометрическая матрица, которая является основой потоковой модели, может стать основой и для построения динамической модели (.ГатзЫсН&Ра^зоп, 2008). Располагая картиной распределения потоков вещества в клетке, можно существенно сократить число переменных в построенной на основе потоковой модели редуцированной кинетической модели (Ризниченко&Рубин,.

2004). Поэтому построение кинетической модели метаболизма для предсказания поведения бактерии в различных условиях является одним из возможных направлений развития модели метаболизма бактерий рода Шюс1оЪас1ег.

Другим возможным направлением развития является добавление известной генетической регуляции процессов, управляющей переключением потоков между различными метаболическими путями. Например, ингибирование нитрогеназы ионами аммония может быть добавлено в модель на регуляторном уровне, так как этот процесс хорошо изучен и уже ведутся работы по созданию мутантов, менее подверженных влиянию аммония (Кагз&ОипсШг, 2010). Хотя в настоящее время недостаточно экспериментальных данных для построения полной картины, объединение потоковой модели метаболизма и модели генетической регуляции метаболизма позволит спланировать соответствующие эксперименты.

В целом, уже в настоящем виде построенная потоковая модель обладает большим исследовательским потенциалом и может быть использована для анализа данных различных экспериментов по производству не только водорода, но и других полезных веществ, и одновременно может применяться для эффективного планирования новых экспериментов.