Разработка принципов биотестирования физиологически активных веществ в объектах природной среды

В наш век экологической напряженности по мере развития промышленности и энергетики, транспорта и современного сельскохозяйственного производства резко возрастает риск ухудшения здоровья населения. В связи с увеличением загрязнения окружающей среды возникает опасность дезинтеграции деятельности важнейших функциональных систем организма, разбалансированности физиологических регуляторных процессов и нарушение гомеостаза, что неизбежно ведет к сокращению продолжительности жизни, повышению детской смертности, развитию болезней и др.

Проблема усугубляется тем, что плохо поставлен контроль за состоянием окружающей среды, не разработаны ПДК для многих групп вредоносных экологических факторов, не всегда выполняются соответствующие санитарно-гигиенические нормы, недостаточно разработаны методы качественного и количественного анализа веществ в тех или иных средах. Многие из действующих химических и других факторов среды обладают высокой физиологической активностью и действуют на организм человека и животных в ничтожных дозах (тяжелые металлы, пестициды, радионуклиды и др.). С другой стороны, не менее важным является индикация и анализ в водной и других средах физиологически активных веществ, которые вовлекаются в обменные физиологические процессы в здоровом организме (макро и микроэлементы, неорганические и органические кислоты, аминокислоты, БН-группы и др.).

Объективную информацию о состоянии окружающей среды и влиянии ее на живые системы могут дать методы биотестирования, характеризующиеся простотой выполнения, не требующие сложного оборудования и дорогостоящих реактивов, а также высокой квалификации исполнителя. Применение биотестирования существенно удешевляет проведение санитарно-химического контроля за содержанием физиологически активных веществ (ФАВ).

Нельзя, однако, не отметить того, что методы биотестирования пока не нашли широкого выхода в практику, несмотря на многочисленные исследования в этом направлении предпринятые в последние 20−30 лет как в нашей стране, так и за рубежом. Это можно объяснить, прежде всего, нерешенностью ряда вопросов, связанных с унификацией биотестов и стандартизацией методов биотестирования, а также нерешенностью проблемы диагностики физиологически активных веществ.

Биотестирование в традиционном исполнении является интегральным методом и дает информацию о суммарном воздействии компонентов среды на живые системы, но не всегда позволяет оценить их качественную составляющую.

Интегральность биотестирования, с одной стороны, позволяет упростить определение суммарного воздействия ФАВ на живые системы, что в ряде случаев является вполне достаточным, с другой, — интегральность не позволяет диагностировать вещества индивидуально или хотя бы по классам токсикантов, что «существенно снижает информативность биотестирования как метода анализа.

Другая важная проблема биотестирования, также требующая решения, — это повышение чувствительности определения ФАВ, особенно тех, физиологическая активность которых недостаточно велика, но они могут представлять экологическую опасность обусловленную сложным характером превращений компонентов загрязнений в объектах окружающей среды,.

В ряду важнейших задач по совершенствованию биотестирования относятся и некоторые воросы методического порядка, такие как сокращение продолжительности выполнения анализа, а также поиск и отбор наиболее чувствительных биотестов, отвечающих требованиям высокой чувствительности, доступности, простоты содержания и культивирования, а также получения биотестов в количествах, достаточных для выполнения массовых анализов.

К настоящему времени в качестве биотестов предложено более сотни организмов различных таксономических гр1тш, большинство из которых представляет лишь теоретический интерес, среди них требованиям практического биотестирования удовлетворяют немногие. Теоретическая база биотестирования на сегодняшний день отстает от задач практического биотестирования, что сдерживает разработку целостной системы биологического контроля за содержанием ФАВ в объектах природной среды.

Цель работы заключалась в разработке концепции универсальной системы биологического контроля и диагностики, которая позволяет проводить качественную и количественную оценку физиологической активности и токсичности компонентов среды с учетом механизмов их действия и значения для организма.

В соответствии с этим поставлены следующие основные задачи исследования:

— выделить среди загрязнителей объектов окружающей среды группы вредных для организма химических агентов, оценить их потенциальную экологическую опасность для человека и сельскохозяйственных животных и обитателей природных экосистем;

— провести поиск и отбор биотестов среди, водных беспозвоночных и микроорганизмов различных таксономических групп, обладающих высокой чувствительностью к веществам различной химической природы;

— выяснить механизмы биологического действия приоритетных ФАВ на различных уровнях организации биологических систем;

— разработать простые и надежные методы биотестирования с использованием микроорганизмов и водных животных, позволяющие на основе знания механизмов биологического действия диагностировать ФАВ в водной среде, пищевых продуктах, кормах, биологических жидкостях и других средах;

— разработать систему биологического контроля качественной и количественной оценки загрязнения объектов окружающей среды токсичными веществами, а также оценки содержания некоторых веществ нутриентов (микроэлементов, аминокислот), участвующих в обменных физиологических процессах в здоровом организме.

Об актуальности работы свидетельствуют проводившиеся в течение 10 лет специальные исследования по планам ГКНТ СССР по разработке теоретических основ и методов биоиндикации и биотестирования качества природных вод с использованием биологических методов контроля, к выполнению которых был привлечен ряд научных учреждений СССР, в том числе и НИИ химии при ННГУ, где в основном выполнена экспериментальная часть данной работы, и исследования по которой были продолжены в Нижегородской ГСХА.

Работа выполнена на основании исследований, проводившихся в соответствии с Координационным планом Минвуза РСФСР по направлению «Определение малых масс и низких концентраций вещества» (тема Г. 50, 81−85 гг.), заданием 02 плана научных исследований ГКНТ СССР (постановление N 468 от 30.11.81) и заданием 0.85.04 плана научных исследований ГКНТ СССР на XII пятилетку (постановление N 555 от 30.10.86) по разработке новых методов биотестирования и биоиндикации природных вод, а также по теме «Изучение и разработка биологических методов обнаружения физиологически активных веществ в воде», выполненной в 1978;1988 гг. по заданию Минздрава СССР.

На защиту выносятся следующие положения.

1. Теоретическое обоснование нового научного физиолого-биохимического направления в биотестировании физиологически активных веществ в объектах природной среды, основанное на учете знания механизмов их биологического действия на живые системы.

2. Разработка на основе нового физиолого-биохимического подхода к биотестированию комплекса методов групповой и специфической диагностики физиологически активных веществ и их количественной оценки в воде, пище, кормах и других средах.

3.Обоснование основных принципов и подходов к биотестированию и разработка концепции универсальной системы биологического контроля и диагностики физиологически активных веществ (токсикантов и нутриентов) в объектах природной среды, основанной на использовании ограниченного количества биотестов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. КАЧЕСТВО ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ЕЕ СОСТОЯНИЯ 1.1. Организм и среда.

Все живые организмы развиваются в тесной связи с окружающей средой и изменение обычных для них условий ведет к усилению, замедлению или прекращению их нормальной жизнедеятельности. Главная характерная особенность живых организмов — способность в процессе жизнедеятельности сохранять состояние внутреннего динамического равновесия (гомеостаза), поддерживаемое регулярным возобновлением основных структур, вещественно-энергетического состава и постоянной саморегуляцией ее компонентов. Саморегуляция в живом мире реализуется через обмен веществ и энергии.

Наряду с гомеостазом обмен веществ — одно из фундаментальных свойств живого вещества. В процессе обмена веществ живые организмы способны сохранять относительное постоянство химического состава и поддерживать функции на относительно постоянном уровне, при этом активно противодействовать колебаниям внешеней среды. В результате обмена веществ и энергии устанавливается единство между живыми организмами и средой обитания.

Из внешней среды в живой организм поступают разнообразные неорганические и органические вещества, одни из которых могут включаться в пластический и энергетический обмен, подвергаясь сложной перестройке, входить в его составдругие, — не участвуя сами в этом процессе, могут существенно влиять на обмен веществ. В обмен веществ могут включаться как необходимые, так и посторонние, являющиеся случайными или даже вредными для организма, вещества. Участие вредных веществ в метаболизме существенно меняет направление обменных процессов и негативно сказывается на жизнедеятельности организма, вызывает те или иные патологические явления, а в ряде случаев и гибель организма. Следует отметить, что некоторые вещества (микроэлементы, витамины, гормоны и др.), при поступлении из внешней среды в зависимости от количества могут при одних концентрациях обеспечивать физиологическую норму организма, а при других — приводить к отравлению организма и развитию ряда патологий. С качеством окружающей среды, особенно с химическим составом воды и почв, и как следствие, растениеводческой продукции, связаны многие эндемические болезни человека и сельскохозяйственных животных. Недостаток или, наоборот, избыток в среде таких элементов, как кобальт, медь, молибден, йод, фтор и некоторых других вызывает специфические реакции организма, нарушение процессов обмена веществ, морфологические изменения, уродства и т. д. Ковальский, 1976].

Так, повышенное содержание молибдена в почвах Армении (более 4 мг/кг) ведет к заболеванию подагрой не только людей, но и сельскохозяйственных животных. Нехватка селена в некоторых провинциях Китая является причиной распространения сердечно-сосудистых заболеваний и инфаркта миокарда среди населения [Кузнецов, 1994], в тя же. время на территориях с высоким содержанием селена наблюдаются интоксикации в виде хронического селеноза, проявляющегося поражением ногтей, выпадением волос и поражением печени [Матвеева, 2000]. Низкое содержание йода в водах и почвах некоторых регионов России является, как известно, причиной ряда заболеваний, обусловленных недостаточностью функций щитовидной железы. В связи с этим перед биохимической экологией стоят, по крайней мере, две важные проблемы, связанные, с одной стороны, с оценкой микроэлементного фона объектов среды, с другой, — его коррекцией в случаях дефицита микроэлементов с целью профилактики заболеваний человека и животных.

Резкие нарушения физиологических процессов вызывает поступление в организм чужеродных веществ (ксенобиотиков) абиогенной и биогенной природы с высокой физиологической активностью, которые приводят к отравлению его в незначительных концентрациях.

Следует отметить, что в настоящее время в окружающей среде циркулирует от 4 — 6 [Телитченко, Остроумов, 1990] до 20 [Матвеева, 2000] млн. различных химических веществ, ежегодно создается от 25−30 до 50 тыс. новых веществ [Яблоков, Остроумов, 1985; Данилов-Данильян, 1997], в ней появились несвойственные для нее факторы физической (радиоактивные вещества, ионизирующие излучения, вибрация, шумы), и биологической (плазмиды) природы.

В эпоху научно-технической революции небывалых масштабов достигло загрязнение практически всех объектов природной среды: атмосферы, гидросферы, почв, объектов живой природы — растениеводческой продукции, кормов и пищевых продуктов.

Среди приоритетных загрязнителей среды на первое место выдвинулись тяжелые металлы, пестициды различных химических классов, полихлорированные бифенилы, диоксины, хлорорганические вещества, СПАВ, отходы различных химических производств. Все эти и целый ряд других веществ-продукты антропогенной деятельности являются чужеродными, непривычными для природной среды, с которыми организмы в своей эволюции ранее не сталкивались и перед ними поставлена задача или адаптироваться к новым условиям, или выработать механизмы их «переработки». Такая переработка ксенобиотиков в процессе биотрансформации путем молекулярной перестройки в одних случаях ведет к их обезвреживанию, в других, наоборот, к увеличению вредоносности (токсификации) веществ для организма (Яблоков, Остроумов, 1985).

Существенное изменение условий обитания и особенно загрязнение среды вредными веществами ведет к коренной перестройке природных экосистем, нарушению в соотношении отдельных популяций организмов, изменению сложившихся трофических взаимоотношений и нередко к деградации природных биоценозов. Внедрясь в живые организмы, некоторые из чужеродных веществ вступают в метаболизм, подвергась биотрансформации, обезвреживаются, другие почти без изменения могут передаваться на другой трофический уровень через цепи питания. В ряде случаев происходит биоаккумуляция вредных веществ по мере продвижения по пищевым цепям. Концентрация некоторых из них, в частности пестицида ДДТ, в процессе миграции по пищевым цепям может увеличиваться в тысячи и миллионы раз [Яблоков, 1990].

Многочисленные антропогенные загрязнители окружающей среды всегда потенциально опасны для организмов природных экосистем и для человека. В процессе эволюции сформировались множественные системы защиты от ксенобиотиков, однако антропогенный рост нагрузок превышает возможности механизмов защиты, что позволяет говорить об экологическом отравлении организма [Матвеева, 2000].

В условиях изменной человеком природной среды некоторые организмы адаптируются, отвечая увеличением численности, адаптационные механизмы других оказываются недостаточными, численность их снижается, третьи в этих условиях могут полностью вымирать.

Загрязняющие вещества (поллютанты) попадая в живой организм подавляют действие белково-ферментных систем, воздействуют на генетические системы, на клеточные биомембраны, нарушают их структуру, проницаемость, мембранный потенциал и т. д. Вредное действие загрязняющих веществ проявляется на всех уровнях организации живых систем: сублеточном, клеточном, тканевом, органном, онтогенетическом, популяционном и биогеоценотически — биосферном.

Некоторые приориетные группы веществ загрязнителей объектов среды, явившиеся объектом внимания в данной работе, и механизм их биологического действия представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Приоритетные группы веществ, загрязнителей объектов среды и механизм их биологического действия.

Группа Вещества.

Механизм действия.

Источник.

1-я Хлор-, фосфор-органические соединеня (карбофос, дихлофос, метафос и др.), карбаматные соединения.

2-я Цианиды (синильная кислота, цианистый калий и натрий).

3-я Катионы металлов.

4-я.

5-я.

6-я.

7-я.

8-я Нё2+, СсГ, ?Ъг Ог N1 Со2+, Ав3″ ', Ве+ и др.) Фенол л2+.

•2+.

Хлор

Эфиры тиосульфо-кислот.

Элементоорганические пероксиды.

Металлоорганические соединения.

9-я Металлы Си, Ъл, Со, Бе и др. в микродозах.

Антихолинэстеразные [Голиков, 1968; агенты, блокирование Покровский, 1976; ферментов группы эстераз. Оксегендлер, 1982] Конкурентное торможение. Нарушение проницаемости мембран. Торможение фермента [Оксегендлер, 1982] цитохромоксидазы, тканевого дыхания, снижение уровня обменных процессов Блокаторы сульфгидрильных [Покровский, 1976; групп биомолекул Оксегендлер, 1982].

Клеточный яд воздействует [Метелев и др., 1971] на митохондрии клетки, нарушает энергетический обмен Окислительное действие.

Торможение биосинтеза [Болдырев, 1971] ферментов.

Процессы окисления с участием [Скурлатов и др., 1994] атомарного кислорода.

Блокаторы сульфгидрильных [Покровский, 1976] групп биомолекул, нарушение проницаемости мембран Активаторы ферментов, входят [Чернавина, 1970] в структуры ферментных белков.

Значительные изменения условий в окружающей среде, могущие причинить вред объектам живой природы, в том числе и здоровью человека получили название факторов риска. Факторами риска в настоящее время являются многие физические стимулы и химические вещества постоянно присутствующие в биосфере и обладающие мутагенным, канцерогенным, бластомогенным, аллергенным действием.

В настоящее время основной стратегией по снижению вредного воздействия вредных факторов среды на живые организмы и здоровье человека является установление санитарно-гигиенических нормативов: предельно допустимых уровней (ПДУ) и предельно допустимых концентраций (ПДК), предельно допустимых выбросов (ПДВ) и сбросов (ПДС) и других нормативов, ограничивающих поступление вредных веществ в окружающую среду. Следует сказать, однако, что даже при соблюдении установленных нормативов так или иначе имеет место загрязнение объектов природной среды, тем более, что в целом ряде случаев установленные нормативы не выполняются. Нельзя не упомянуть и то, что нормативный подход не учитывает проявлений синергизма и антогонизма при совместном воздействии загрязняющих веществ. Это говорит о том, что при решении экологических вопросов, связанных с охраной окружающей среды, сохранением видового разнообразия природных экосистем и здоровья человека в техногенной среде нельзя опираться только на одни нормативы.

Другой путь направленный на охрану среды от загрязнения вредными веществами — осуществление контроля за их состоянием и поведением в окружающей среде. Основными методами контроля на сегодняшний день являются химические, применение которых в условиях многокомпонентного загрязнения физиологически активными веществами становится малоэффективным и, в большинстве своем, теряет экологический смысл. При высокой чувствительности и избирательности химические методы не дают ответа о качестве природной среды и пригодности ее для обитания живых организмов.

Решать такую задачу можно методами, в которых аналитическими индикаторами являются сами живые системы, составляющие органическое единство со средой обитания и чутко реагирующие на изменение любых факторов, в том числе и факторов химической природы. В процессе эволюционного развития у живых организмов сформировались чувствительные анализаторы факторов внешней среды и способность адаптироваться к некоторым факторам достигла высочайшего уровня.

На способности живых систем на различных уровнях их организации отвечать определенными реакциями на изменение факторов среды основаны методы биологического контроля состояния окружающей среды и оценки воздействия как неблагоприятных, так и полезных факторов на организмы, популяции, биоценозы и экосистемы. Одним из таким методов является биотестирование, в котором в качестве чувствительных биологических индикаторов используются различные живые организмы, их органы, ткани, отдельные физиологические системы и биохимические структуры. Биотестирование может быть использовано при оценке факторов риска для принятия решения по снижению неблагоприятного экологического воздействия на экологические системы и здоровье населения. Такая система оценки риска позволяет управлять качеством окружающей среды в интересах здоровья населения на более высоком уровне, чем система, основанная на показаниях химических анализов и на гигиенических нормативах.

Значительную информацию о качестве окружающей среды могут дать простые биосистемы с использованием микроорганизмов и некоторых просто организованых беспозвоночных животных, особенно гидробионтов.

Как микроорганизмы, так и водные беспозвоночные имеют относительно их размеров большую поверхность соприкосновения с окружающей средой, при загрязнении ее сразу же вступают в контакт с загрязнителем, на уровне клеток и их структур испытывая влияние внешних стимулов, которое нетрудно зарегистрировать, а многие водные беспозвоночные к тому же обладают фильтрационным типом питания, что повышает вероятность накопления ими веществ загрязнителей и повышает эффект их воздействия на организм.

При разработке методов биотестирования микроорганизмы привлекли наше внимание в связи с тем, что они имеют небольшие размеры, культуры микроорганизмов легко поддерживать в лабораторных условиях, рост и развитие их не зависят от времени года и не связаны с биологической цикличностью, при выращивании (размножении) они дают однородный материал. Сказанное в значительной степени относится и к мелким водным беспозвоночным животным, кроме того, как те, так и другие обладают высокой чуствительностью к физиологически активным веществам.

ВЫВОДЫ.

1. Проведенными исследованиями осуществлен широкий поиск и отбор организмов среди различных систематических групп микроорганизмов и водных беспозвоночных животных, имеющих небольшие размеры и отвечающие требованиям биотестов по доступности в природе, простоте культивирования и способности быстро воспроизводится (размножаться) в лабораторных условиях, дающие при размножении биологический материал с идентичными свойствами, представляющие простые биологические системы, характеризующиеся высокой чувствительностью к ФАВ, в связи с чем возможностью использования в биологических методах оценки эколого-физиологического состояния объектов окружающей природной среды и контроле веществ, имеющих исключительно важное значение в жизнедеятельности организма.

2. Определена чувствительность более 80 видов и штаммов микроорганизмов, принадлежащих к группам бактерий, актиномицетов, плесневых грибов и дрожжей, а также 10 видов беспозвоночных животных (веслоногих, ветвистоусых, жаброногих ракообразных, личинок комаров, одноклеточных, нематод) к 130 индивидуальным веществам неорганической, органической и элементоорганической природы и их смесям. Выделены в качестве наиболее чувствительных биотестов бактерии Sarcina lutea, Bacillus stearothermophillus, Azotobacter chroococcum, плесневые грибы Aspergillus, niger, Aspergillus awamori, актиномицеты Actinomyces olivaceus, Actinomyces viridochromogenes, дрожжи Torula Candida, одноклеточные Paramecium caudatum, ракообразные Daphnia magna.

3. Определена физиологическая активность и разработаны методы оценки количественного содержания в объектах среды фосфониевых солей и илидов фосфония с предельной нижней концентрацией 0, 2−1,0 мкг/0,1 мл, эфиров тиосульфокислот — 0,0001−0,005 мкг/0,1 мл, металлоорганических соединений — 0,005−1,0 мкг/0,1 мл, фосфорорганических пестицидов — 20−1000 мкг/0,1 мл, катионов тяжелых металлов ртути и цинка с предельной концентрацией 0,01- кадмия — 0,5 таллия-5 мкг/0,1 мл, а также определена физиологическая активность и разработан метод биотестирования элементоорганических пероксидов с использованием инфузорий Paramecium caudatum — с предельным содержанием 0,1−0,001 мкг/мл.

Установлена высокая чувствительность дафний, других ветвистоусых, а также жаброногих рачков (артемий) и личинок комаров рода Culex к фосфорорганическим пестицидам на уровне минимально летальных концентраций Ю’МО" 4 мг/л, дафний и парамеций к катионам тяжелых металлов — 0,001−0,1 мг/л.

Определен уровень минимально летальных концентраций для дафний фенола, цианидов, хлора, брома, йода, ряда неорганических солей, а также хлорорганических (дилдрин, алдрин) и других классов пестицидов. По чувствительности к физиологически активным веществам и другим биологическим показателям требованиям биотестов среди гидробионтов в наибольшей степени отвечают дафнии вида Daphnia magna Straus.

4. Установлено, что дафнии, как и другие гидробионты, внешне практически одинаково реагируют на токсичные вещества, что связано с близостью их ответных реакций, направленных на поддержание гомеостаза при воздействии веществ различной химической природы. При воздействии токсикантов организмы различных таксономических групп отвечают комплексом сходных физиологических реакций, что исключает возможность диагностики веществ путем традиционного биотестирования.

5. Для решения задач диагностики ФАВ в объектах окружающей среды обоснован принципиально новый физиолого-биохимический подход к их биотестированию, базирующийся на учете физиологических механизмов их воздействия на структуры живого организма, учете взаимодействия веществ с некоторыми структурными метаболитами, участвующими в нормальном обмене веществ в живом организме, и в случае проникновения в него токсикантов, участвующими в их обезвреживании.

Разработана методология проведения анализа по диагностике веществ, заключающаяся в предварительном изменении их физиологической активности (детоксикации или токсификации) с последующим биотестированием дафниями. Детоксикация осуществляется веществами антидотного действия, токсификация — применением веществ, химически взаимодействующих с токсикантами и повышающих их токсичность. Изменение физиологической активности вещества в процессе пробоподготовки и знание механизмов его биологического действия позволяют судить о природе тестируемых веществ.

6. Разработан комлекс биологических методов диагностики и количественной оценки в объектах среды физиологически активных веществ, в том числе групповой диагностики катионов тяжелых металлов, фосфорорганических пестицидов, специфической диагностики цианидов, фенола, фосфорорганических пестицидов, производных тиофосфорных кислот. Физиолого-биохимический подход положен в основу методов биотестирования токсичных примесей в хлорированной водопроводной воде, а также количественной оценки цистеина в растворах и биологических жидкостях .

7. В объектах окружающей среды: почве, кормах, других материалах, биологический контроль ФАВ в которых прямым биотестирование с помощью гидробионтов и мироорганизмов не представляется возможным, а также в случаях когда содержание анализируемых веществ в воде и других объектах находится на уровне сублетальных концентраций или их физиологическая активность невелика и не вызывает реакции у биотеста, показана возможность их предварительного экстракционного извлечения из объекта органическими растворителями и концентрирования, с последующим биотестированием дафниями или микроорганизмами. Экстракция позволят излечь вещество, а концентрирование повысить его содержание до уровня, при котором возможно получение ответной реакции биотеста. Разработанная технология применена при биотестировании токсичных примесей в комбикормах, пестицида гранозана в протравленном зерне, трибутилоловоакрилата в воде, а также фосфорорганических пестицидов бутифоса и дихлорофоса при чрезвычайно низком их содержании в воде, соответственно менее 10″ 3 и 10^ мг/л.

8. Установлена зависимость чувствительности организмов к ФАВ от физических и химических факторов среды, влияющих на результаты биотестирования. Создание дополнительной физиологической нагрузки на биотест путем повышения температуры (для гидробионтов) или упрощения химического состава питательной среды и обеднения ее по питательным веществам (для микроорганизмов) понижает их резистентность к внешним факторам, в том числе и к воздействию токсических веществ. Выполнение биотестирования при экстремальных для жизнедеятельности дафний температурах 35−36°С по сравнению с нормой повышает их чувствительность к фосфорорганическим пестицидам, катионам металлов, цианидам, хлору и другим веществам в 2−10 раз, а упрощение химического состава питательной среды, исключение из ее состава белков, аминокислот, других сложных органических веществ повышает чувствительность микроорганизмов в 2−5 раз. Показана целесообразность использования в микробиологических методах биотестирования ФАВ синтетических глюкозо-минеральных питательных сред.

9. Биотестирование является универсальным методом контроля физиологически активных веществ как вредных для живого организма, так и полезных, являющихся жизненно-необходимыми, и поступающих из внешней среды, а также веществ, являющихся нормальными метаболитами и участвующими в обмене веществ в организме.

Установленная нами взаимосвязь между ростом гриба Aspergillus niger и содержанием в воде меди, цинка, железа, стимулирующие в низких концентрациях жизнедеятельность организмов, использована при оценке микроэлементного фона водной среды. Разработанный метод биотестирования по стимуляции жизнедеятельности биотеста позволяет установить доступность микроэлементов в среде для ее обитателей, сделать прогноз обеспеченности ими организмов в пищевой цепи, в том числе человека и сельскохозяйственных животных и в случае дефицита осуществить коррекцию путем введения в пищу или корма.

Разработан микробиологический метод количественной оценки содержания аминокислоты цистеина и других веществ, содержащих SH-группы, яляющихся метаболитами в живом организме и участвующими в пластическом и энергетическом обмене веществ. Метод биотестирования основан на снижении цистеином токсического действия катионов ртути на растущую культуру гриба Aspergillus niger и позволяет количественно оценивать в водном растворе или биологических жидкостях содержание цистеина от 0,5 до 12 мкг в 0,1 мл.

Разработанный метод позволяет заключить о возможности более широкого применения биотестирования для контроля за содержанием в среде многих физиологически активных веществ, имеющих важное регуляторное значение: витаминов, гормонов, аминокислот, антибиотиков и др.

10. Предложена концепция универсальной системы биологического контроля и диагностики физиологически активных веществ в объетах природной среды с использованием ограниченного количества биотестов, позволяющая осуществлять качественно-количественный контроль приоритетных загрязнителей среды: катионов, тяжелых металлов, фосфорорганических пестицидов, цианидов, фенола, токсичных примесей в кормах, в хлорированной водопроводной воде, а также новых для окружающей среды соединений, синтезированных в последние годы, нашедших применение или имеющие перспективу широкого использования в различных отраслях хозяйства, таких как эфиров тиосульфокислот, фосфониевых солей и илидов фосфония, металлоорганических и пероксидных соединений и др.

Большинство методов биотестирования в этой системе основано на использовании в качестве биотеста — рачков вида Daphnia magna.

Дальнейшее совершенствование методов биотестирования на основе изложенной концепции позволит разработать более целостную систему биологического контроля и диагностики ФАВ, перейти от множественности биотестов к нескольким стандартным биотестам, расширить список и повысить порог обнаружения тестируемых веществ, представляющих реальную или потенциальную опасность для здоровья человека, что чрезвычайно важно в условиях нарастающего антропогенного пресса на природную среду, а также веществ, играющих исключительно важную роль в жизнедеятельности человека и животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

• Разработанные биологические методы обнаружения токсичных катионов, фосфорорганичесих пестицидов и цианидов, и внедренные в практику биотестирования производственных сточных вод в ВНИИ ВОДГЕО (а.с. № 1 168 168, а.с. № 1 139 259, а.с. № 1 292 443) предлагаются для использования в оперативном контроле сточных вод промышленных предприятий, а также при осуществлении мониторинга загрязнений природных сред аналитическими лабораториями Госкомприроды и Госкомгидромета РФ.

• Разработанный метод биотестирования токсичности комбикормов внедрен в ОАО птицефабрике «Линдовское» и Сормовском рыбоводно-м хозяйстве в Нижегородской области и рекомендуется для широкого внедрения в практику аналитического контроля зооветеринарных лабораторий при определении качества комбикормов на предприятиях по промышленному выращиванию домашних птиц, а также в рыбоводстве.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Большое разнообразие биотестов используемое в настоящее время затрудняет осуществление контроля физиологически активных веществ (ФАВ) в объектах природной среды. Это прежде всего часто связано с неадекватностью выбираемых тест-систем целям и задачам проводимых исследований. В качестве биотестов предложены биохимические структуры и физиологические функции организма, отдельные органы и ткани растений и животных, а также многие организмы различных таксономических групп. Необходимо отметить, что формирование банка биотестов при развитии биотестирования в значительной степени носило случайный характер, и часто определялось наличием организмов или возможностью их сбора в природе.

Среди предложенных биотестов немало таких, которые представляют чисто научный интерес (например, применение для биоанализа икры морских ежей) и в практическом биотестировании вряд ли могут быть использованы. Проблематично использование для этих целей животных, имеющих большие размеры (некоторые рыбы), а также отлов которых в природе и содержание в лабораторных условиях связано, с нашей точки зрения, с известными трудностями. Целям биотестирования отвечают биотесты, удовлетворяющие следующим требованиям: они должны легко содержаться и быстро воспроизводиться (размножаться) в лабораторных условиях, при размножении давать биологический материал с идентичными свойствами, иметь небольшие размеры и представлять относительно простые биосистемы.

Выбор простых биосистем в качестве биотестов в определенной степени связан с поиском альтернатив традиционному биотестированию с использованием теплокровных животных, применение которых становится все более дорогим и не отвечает требованиям, диктуемым возросшим масштабом появления в окружающей среде новых продуктов, биологический скрининг которых необходимо осуществлять. Принимая во внимание тот факт, что подвергнуть биологическим испытания все вещества, поступающие в широкое использование, и тем более, осуществлять контроль за их состоянием и поведением в объектах среды с использованием традиционных тестов на млекопитающих становится все более не реальным (только в лабораториях США за один год их используют более 60 млн., в мире 100−160 млн.) [Телитченко, Остроумов, 1990], это вынуждает использовать в подобных экспериментах более доступные, дешевые и простые биологические модели.

На основании выполненных исследований с учетом данных мировой литературы нами разработана концепция универсальной системы биологического контроля и диагностики физиологически активных веществ в объектах природной среды с использованием ограниченного количества биотестов. В основу системы положен физиолого-биохимический подход к биотестированию, рассматривающий его как метод, позволяющий осуществлять качественно — количественный контроль в объектах среды не только токсичных, чуждых для живого организма веществ, но и веществ, являющихся для него жизненно-необходимыми, а также осуществлять контроль и количественную оценку содержания физиологически активных веществ, являющихся в живом организме нормальными метаболитами и участвующими в обмене веществ.

Система предусматривает использование в качестве биотестов микроорганизмов и водных беспозвоночных животных, представляющих по своей биологической организации простые биосистемы, являющиеся чувствительными индикаторами качества объектов среды, в которой они обитают, а также индикаторами факторов абиогенной и биогенной природы, оказывающих физиологическое действие на живой организм в чрезвычайно малых количествах.

Предлагаемая система базируется на биотестах, содержание и культивирование которых в лабораторных условиях не представляет трудностей, при размножении они дают массовый и стандартный по биологическим показателям материал. Биотесты имеют небольшие размеры, достаточные для визульного наблюдения или дающие возможность наблюдения за ними с небольшим увеличением микроскопа или лупы. Все они являются чувствительными организмами к физиологически активным веществам различной химической природы.

Система биологического контроля учитывает физиологические особенности биотестов и механизмы биологического действия тестируемых веществ.

В соответствии с физиологическими особенностями (наличие нервной системы, фильтрационный характер питания, быстрая генерация) обосновано использование водных беспозвоночных, и прежде всего ветвистоусых ракообразных, в биотестировании веществ, механизм биологического действия которых связан с воздействием на рецепторы нервной системы. Такими веществами являются фосфорорганические пестициды, представляющие нервно-паралитические яды, в организме животных они вызывают ингибирование холинэстеразных ферментов и нарушение проведения нервного импульса. Воздействие ничтожных количеств этих веществ приводит к иммобилизации и далее летальному исходу.

Эффективно использование водных беспозвоночных также при биотестировании тиоловых ядов-блокаторов сульфгидрильных групп биомолекул, к которым относятся тяжелые металлы, а также цианидов — блокаторов дыхательных ферментов и воздействующих на дыхательную систему, чувствительность их к названным веществам также чрезвычайно высокая и проявляется в начале характерной реакцией иммобилизации животных и далее заканчивается летальным исходом.

В случаях биотестирования веществ, действие которых на нервную или дыхательную системы проявляется слабо или слишком медленно, физиологическую активность их повышают, воздействуя на них предварительно веществами, способными перестроить их молекулы в более токсичные для биотеста соединения. Примером такого анализа является биотестирование фенола и фосфорорганических пестицидов — производных тиофосфорных кислот.

Для ряда веществ с умеренной физиологической активностью (токсичные примеси комбикормов, содержащие остатки пестицидов, афлатоксины, окисленные жиры), а также веществ, содержание которых в объектах среды находится на уровне сублетальных концентраций, вопрос их биотестирования решен путем предварительного экстракционного концентрирования, позволяющего довести концентрацию тестируемого вещества до летального для организма уровня, при котором можно получить ответную реакцию биотеста.

Применение экстракционного концентрирования позволяет расширить возможности биотестирования, поскольку открывает путь для осуществления биологического контроля ФАВ в таких объектах среды как почва, материалы растительного и животного происхождения, корма и других сложных для анализа объектах.

Среди водных беспозвоночных наибольшей чувствительностью к ФАВ обладают ветвистоусые рачки, к которым принадлежат дафнии, цериодафнии, босмины, хидориды, моины и целый ряд других пресноводных ракообразныхиз них требованиям биотестов в наибольшей степени удовлетворяют дафнии вида Daphnia magna Straus. Для дафний хорошо разработана методика лабораторного культивирования, для них характерен высокий темп и партеногенетический тип размножения, при котором отрождаются одни самки, при лабораторном культивировании они не изменяют биологических свойств, незначительные размеры рачков поволяют осуществлять биотестирование небольших объемов жидкости. Самое главное, дафнии являются нормативным стандртным биотестом, включенным в международный стандарт по определению качества воды [Международный стандарт, per. № ИСО 6341−82].

Диагностика и количественная оценка содержания приоритетных загрязнителей природной среды: катионов тяжелых металлов, фосфорорганических пестицидов, цианидов, фенола, фосфорорганических пестицидов, производных тиофосфорных кислот, токсичных примесей в кормах, в хлорированной водопроводной воде достигается использованием единого теста, в качестве которого выступают дафнии.

Нам представляется, что физиолого-биохимический подход к биотестированию позволяет разработать систему биологического контроля и диагностики как перечисленных, так и других физиологически активных веществ при совместном их присутсвии в объектах природной среды.

Система должна базироваться на алгоритме, определяющим последовательность операций при индивидуальной или групповой диагностике прежде всего приоритетных загрязнений при многокомпонентном содержании их в объектах среды.

Такой алгоритм соответствует проведению качественного анализа вещества в химических методах, но в отличие от них здесь достигается обнаружение веществ, обладающих физиологической активностью и представляющих экологическую опасность или, наоборот, имеющих важное значение для жизни организмов природных биоценозов или для здоровья человека.

Исходной позицией для разработки универсальной системы биологического контроля ФАВ является комплекс разработанных нами методов биотестирования индивидуальных веществ и отдельных групп токсикантов на основе физиолого-биохимического подхода к их анализу. Диагностика при совместном присутствии нескольких веществ возможна путем дробного выполнения анализа.

Для веществ, обладающих бактерицидной и фунгицидной активностью, нами впервые обосновано применение микробиологических методов контроля и оценки их содержания в объектах среды с использованием высоко чувствительных биотестов, представляющих некоторые виды бактерий {Bacteria), плесневых грибов {Fungi), дрожжей и актиномицетов {Actinomyces). Они отвечают всем перечисленным выше требованиям биотестов, кроме того, характеризуются быстротой роста на соответствующих питательных средах.

Универсальность системы биологического контроля состоит не только в использовании единого стандартного биотеста при диагностике приоритетных загрязнителей объектов среды, но также и в возможности биотестирования веществ как токсичных для живых организмов, так и веществ, являющихся для них жизненно-небходимыми, или являющихся нормальными метаболитами и участвующими в обмене веществ.

Биологический контроль в объектах среды жизненно-необходимых элементов достигается путем использования метода биотестирования, основанного на стимуляции роста грибов Aspergillus niger или Aspergillus awamori. Микробиологический метод биотестирования позволяет оценить микроэлементный фон среды, выявить доступность их для живых организмов и в случае дефицита осуществить коррекцию путем введения микроэлементов в пищу или корма.

Диагностика и количественная оценка веществ, являющихся в организме нормальными метаболитами и участвующими в обмене веществ, например, незаменимых аминокислот, витаминов, ферментов может быть достигнута применением методов биотестирования с использованием специальных ауксотрофных штаммов микроорганизмов, а также использованием разработанного нами метода биотестирования веществ, содержащих SH-группы, по снижению ими токсического действия катионов ртути с использованием в качестве биотеста гриба Aspergillus niger. Метод позволяет осуществлять количественную оценку аминокислоты цистеина в количествах от 0,5 до 12 мкг в 0,1 мл биосубстрата в присутствии близких по строению серусодержащих аминокислот цистина и метионина.

Микроорганизмы (Sarcirta lutea, Bacillus stearothermophillus, Azotobacter chroococcum, Aspergillus niger, Actinomyces olivaceus, Actinomyces viridochromogenes, Torula Candida) могут быть эффективно использованы при оценке бактерицидной и фунгицидной активности веществ, а также в контроле загрязнений объектов природной среды, обусловленных катионами тяжелых металлов: ртутью, кадмием, таллием, цинком и другими веществами неорганической и органической природы с бактерицидным или фунгицидным действием. Разработанные микробиологические методы позволяют выявлять в чрезвычайно низких концентрациях и количественно оценивать в объектах среды фосфониевые соли и илиды фосфония предельным содержанием 0,2−1,0 мкг/0,1 мл, эфиры тиосульфокислот-0,0001−0,005 мкг/0,1 мл, металлоорганические соединения — 0,005−0,1 мкг/0,1 мл, и метод биотестирования элементоорганических пероксидов с использованием инфузорий Paramecium caudatum — с предельным содержанием 0,1−0,001 мкг/мл.

Ниже приведена схема (рис. 14) осуществления биологического контроля ФАВ в различных объектах среды. При диагностике веществ учитывается возможный характер изменения (снижение или повышение) физиологической активности анализируемых или мешающих компонентов в процессе подготовки пробы для биотестирования, а также будут ли оказывать влияние на биотестирование вещества, дополнительно вводимые в пробу с целью изменения физиологической активности определяемого компонента (или продукты их реакции с этим компонентом), и проведению дальнейшего анализа при диагностике других токсичных компонентов пробы.

Анализ начинают с тех компонентов пробы, физиологическая активность которых в процессе проведения такого системного анализа может быть снижена или нейтрализована, что в дальнейшем позволяет выполнять анализ компонентов, диагностика которых основана на повышении их физиологической активности. При выполнении анализа могут быть варианты с разделением пробы и параллельным биотестированием различных ФАВ.

Выполнение биологического анализа загрязнений в объектах окружающей среды (природных водах, хлорированной водопроводной воде, почве, кормах, растворах различных веществ, биологических жидкостях) в соответствии с привиденной схемой позволяет осуществлять дифференциальную диагностику токсикантов. В частности, можно проводить обнаружение цианидов в присутствии катионов тяжелых металлов, также как и обнаружение катионов металлов в присутствии цианидов. Как в том, так и другом случае один из этих компонентов как мешающий определению «маскируется» путем использования веществ с антидотным действием (в случае катионов металлов — унитиолом, в случае цианидовглюкозой). После такого предварительного маскирования катионов металлов и цианидов можно проводить групповую диагностику фосфорорганических пестицидов, а также фенола и пестицидов — производных тиофосфорных кислот, активируя их соотвественно йодом и бромом.

Схема предусматривает вариант выполнения анализа по определению токсичных примесей в хлорированной водопроводной воде. В этом случае анализ проводят после перевода молекулярного хлора тиосульфатом натрия в хлор-ион.

Общим подходом при диагностике ФАВ является то, что в первую очередь должны быть определены те вещества (компоненты) пробы, физиологическая активность которых в процессе подготовки пробы может быть снята и они могут быть за счет инактивации выведены из анализируемой системы, в связи с чем не будут мешать выявлению группы ФАВ, физиологическую активность которых в дальнейшем необходимо повысить.

Биологический контроль за содержанием ФАВ в сложных для анализа объектах таких, как почва, корма, другие материалы растительного происхождения осуществляется с предварительной экстракцией и концентрированием определяемых компонентов. Экстракционное концентрирование повышает избирательность и чувствительность биотестирования фосфорорганических пестицидов в воде, почве, а также токсичных примесей в кормах.

Как следует из приведенной схемы, биотестирование большинства приоритетных загрязнений среды осуществляется с использованием единого дафниевого теста. Диагностика цистеина в растворах и биологических жидкостях, содержащих смесь аминокислот, как ранее уже было сказано, более эффективна не с дафниями, а микробиологическим путем с использованием плесневого гриба Aspergillus niger. Этот метод по своей сущности принадлежит к биологическим методам анализа, выполняемым на основе физиолого-биохимического подхода к биотестированию.

Изложенная концепция является попыткой упростить систему биологического контроля ФАВ, придать ей универсальность за счет сокращения количества биотестов, дополнить ее принципиально новыми методами диагностики и количественной оценки содержания в объектах природной среды как вредных для организма веществ, так и необходимых для егс жизнедеятельности соединений, являющихся для него или нутриентами, или принимающю участие в нормальном обмене веществ.

Новый взгляд на биотестирование позволяют пересмотреть традиционную точку зрения нг биотестирование как на простую констатацию факта отсутствия или наличия тест-реакции у биотеста на воздействие внешнего фактора. Физиологический подход к биотестированию дает основание рассматривать его как технологию, осуществляемую в условиях, когда биотест находится в стрессовом состоянии и обладает максимальной чувствительностью к воздействию ФАВ. В связи с этим совершенно обосновано при осуществлении биотестирования ФАВ создание дополнительной физиологической нагрузки на биотест путем экстремальных температурных условий с целью повышения его чувствительности и более ранней диагностики определяемых веществ.

В концепции нашел отражение и вопрос создания экстремальных условий при выращивании микроорганизмов как способ создания дополнительной физиологической нагрузки на биотест путем упрощения химического состава питательной среды и обеднения ее по питательным веществам, что также способствует повышению чувствительности биотеста и снижению уровня предельно тестируемых концентраций ФАВ.

Проведенные исследования выполнены на стыке ряда биологических дисциплинэкологии, физиологии, биохимии, а также аналитической химии. Разработанная в результате наших исследований система биологического контроля ФАВ органично интегрируется в каждую из дисциплин, дополняя арсенал аналитических методов, которые могут быть использованы в целях охраны окружающей среды и других целях.

Схема выполнения анализа БАБ в системе выглядит следующим образом: ЫагЗгОз + унигаол биотестирование токсичных примесей в хлорированной воде экстракция.

Анализируемый объект корма, биологические жидкости растворы, сточные воды природные и сточные воды, ~~ водопроводная вода.

Биотесты.

->- Aspergillus niger пестициды-производные тиофосфорных кислот.

Daphnia magna фенол избирательное биотестирование ФОП в воде, токсичных примесей в кормах пропионилхолинэстераза дипироксим 1.

ФОП.

Hg цистеин в смеси аминокислот.

Sarcina lutea Bac. stearothermophilus 1 фосфониевые соли.

Actinomyces olivaceas Azotobacter chroococcum эфиры тиосульфокислот.

Actinomyces olivaceus Aspergillus niger Torula candida.

Л яр. niger А$р. сматоп металлоорганические соединения микроэлементы.

Paramecium caudatum.

Рис. 14 Технологическая схема осуществления биологического контроля физиологически активных веществ в объектах окружающей среды элементоорганические пероксиды.