На современном этапе достигнут большой прогресс в идентификации генов, вовлеченных в этиологию моногенных наследственных болезней. Это связано, как с успешным применением стратегии позиционного клонирования и развитием новых технологий, так и с успехами, достигнутыми в расшифровки генома человека. Основной проблемой сейчас является выявление генов, вовлеченных в патогенез мультифакториальных заболеваний. К такому типу заболеваний относятся, прежде всего, болезни сердечно-сосудистой системы, астма, сахарный диабет, многие нейропсихиатрические и неврологические заболевания. Особый интерес представляет изучение молекулярно-генетических основ мультифакториальных неврологических заболеваний, поскольку это позволит, во-первых, выявить новые закономерности в функционировании нервной системы на всех уровнях — от уровня клетки до организма в целом. Кроме того, выявление генетических маркеров данных заболеваний поможет разработать новые методы их диагностики. Разрабатываемые методы лечения и профилактики, в свою очередь, будут максимально учитывать генетические особенности каждого конкретного человека.
К числу тяжелых неврологических патологий относится болезнь Паркинсона (БП), которая является вторым по распространенности (после болезни Альцгеймера) нейродегенеративным заболеванием человека. Болезнь Паркинсона — это мультисистемное хроническое медленно прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, связанное с нарушением деятельности базальных ганглиев головного мозга. В настоящее время полагают, что в основе БП лежит дегенерация или дисфункция дофаминергических нейронов в черной субстанции, однако причины такой избирательной гибели нейронов полностью не выяснены.
С генетической точки зрения БП представлена двумя формами: семейной и спорадической. В 10−15% случаев заболевание может наследоваться по моногенному аутосомному типу, но в большинстве случаев носит спорадический идиопатический характер. В настоящее время картировано 17 локусов моногенных форм болезни Паркинсона. Анализ известных локусов и генов БП позволил выделить несколько механизмов, вовлеченных в патогенез паркинсонизма. К их числу, в первую очередь, относятся процессы убиквитин зависимой протеасомной деградации белков, которые часто связаны с мутациями в генах паркина (PARK2) и а-синуклеина (iSNCA). Известно, что гомозиготность или компаундная гетерозиготность по мутациям в гене PARK2 является причиной развития заболевания у примерно половины больных с ювенильной аутосомно-рецессивной формой БП и у примерно 10% спорадических больных с ранним началом развития заболевания. Более того, установлено, что даже в гетерозиготном состоянии мутации в гене PARK2 могут вести к субклиническим нарушениям обмена дофамина в полосатом теле. Эти данные позволяют предположить, что гетерозиготность по мутациям в гене PARK2 может приводить к БП или повышать риск ее развития при взаимодействии с другими факторами. Для проверки этой гипотезы необходимо проведение массового скрининга мутаций в гене PARK2 у больных спорадической формой БП. Интересной особенностью мутаций в этом гене является высокая частота делеций или дупликаций, захватывающих целиком один или несколько экзонов. Следовательно, анализ мутаций гена PARK2 целесообразно начинать именно с поиска экзонных делеций и дупликаций. Также, сравнительно недавно появились данные о том, что мутации гена SNCA, связанные с изменением его копийности, могут приводить к развитию семейной формы БП с аутосомно-доминантным типом наследования. Было показано, что дупликации и трипликации гена SNCA встречаются гораздо чаще, чем точковые мутации данного гена.
Цели и задачи работы.
Целью настоящей работы являлось оценить вклад делеций и дупликаций экзонов гена PARK2 и мультипликаций гена SNCA в развитие болезни Паркинсона у пациентов из России.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Разработка быстрого и эффективного метода анализа дозы отдельных экзонов гена PARK2 и гена SNCA на основе ПЦР в реальном времени.
2. Анализ делеций и дупликаций всех 12 экзонов гена PARK2 у пациентов со спорадической формой БП с ранним и поздним началом развития заболевания.
3. Оценка риска развития спорадической БП у носителей делеций/дупликаций экзонов гена PARK2. Анализ корреляции мутаций с изменением копийности с клиническими характеристиками БП.
4. Анализ дупликаций и трипликаций экзонов 4−6 гена SNCA в выборке пациентов с БП.
Научная новизна.
Разработан быстрый и эффективный метод выявления делеций и дупликаций экзонов 1−12 в гене PARK2 и мультипликаций гена SNCA на основе ПЦР в реальном времени технологии TaqMan.
Впервые проведен анализ спорадических больных с ранним началом развития заболевания (<45 лет) из России на наличие экзонных перестроек в гене PARK2. Установлено, что частота больных с экзонными перестройками в гене PARK2 составляет 12,4%, и показано, что наиболее подвержены экзонным перестройкам экзоны 3 и 4. Обнаружено, что относительный риск развития БП у лиц в молодом возрасте при наличии делеций или дупликаций в гене PARK2 повышен в 12,4 раза. Получено подтверждение гипотезы о том, что мутации в гетерозиготном состоянии в гене RARK2 влияют на риск развития заболевания.
Впервые проведен анализ представительной выборки спорадических больных с поздним началом развития заболевания (>45 лет) из России на наличие экзонных перестроек в гене PARK2. Установлено, что частота больных с экзонными перестройками в гене PARK2 составляет 3,8%.
Впервые в российской популяции проведен корреляционный анализ в выборках спорадических больных с ранним и поздним началом развития заболевания между наличием экзонных перестроек в гене PARK2 и характерными клиническими признаками БП. Установлено, что наличие экзонных перестроек способствует существенному снижению возраста начала БП (на 9 лет), развитию дистонии и симметричному протеканию заболевания и не влияет на скорость и тяжесть протекания болезни.
Впервые проведен анализ больных с семейной формой БП с аутосомно-доминантным типом наследования на наличие дупликаций и трипликаций гена SNCA. В результате анализа было показано, что мультипликации гена SNCA не вносят существенного вклада в патогенез БП у больных из России.
Практическая значимость работы.
Показано, что экзонные перестройки в гене PARK2 вносят существенный вклад в патогенез БП у больных из России. Разработан эффективный метод их выявления, подходящий, в том числе, для массового скрининга больных в клинических условиях. Выявление данных мутаций на ранних стадиях заболевания может скорректировать терапию и при грамотном лечении значительно уменьшить тяжесть его протекания. Выявление таких мутаций у лиц из группы риска на доклинической стадии поможет вовремя принять профилактические меры и, если не предотвратит развитие БП, то отодвинет ее появление на более поздний срок и значительно снизит тяжесть протекания заболевания. В будущем, в том числе с использованием результатов данного исследования, возможно создание единого комплексного генетического теста, выявляющего риск развития БП по результатам анализа локусов заболевания.
выводы.
1. Разработан основанный на ПЦР в реальном времени метод анализа дозы отдельных экзонов гена PARK2 и гена SNCA, позволяющий проводить диагностику мутаций с изменением копийности при семейной и спорадической формах болезни Паркинсона.
2. Показано, что делеции и дупликации экзонов гена PARK2 встречаются у 21 из 170 (12,4%) обследованных пациентов со спорадической формой болезни Паркинсона с ранним началом развития (до 45 лет) из России. Наиболее часто у этих больных встречаются делеции экзонов 3, 4 гена PARK2. Риск развития болезни Паркинсона в молодом возрасте у лиц с наличием мутаций с изменением копийности в гене PARK2 повышен в 12,4.
3 раза.
3. У пациентов со спорадической формой болезни Паркинсона с ранним началом развития выявлены корреляции между наличием мутаций с изменением копийности в гене PARK2, возрастом начала заболевания и наличием дистонии. Показано, что у носителей делеций и дупликаций в гене PARK2 возраст начала заболевания в среднем на 9 лет меньше и составляет 24 года.
4. Показано, что мутации с изменением копийности в гене PARK2 встречаются у 7 из 183 (3,8%) обследованных пациентов со спорадической формой болезни Паркинсона с поздним началом развития (после 45 лет) из России. В данной выборке больных выявлена корреляция между наличием мутации с изменением.
I копийности в гене PARK2 и симметричным течением заболевания.
5. У 61 обследованного больного с аутосомно-доминантной формой болезни Паркинсона из России не выявлено дупликаций и трипликаций гена SNCA. i.
1 100 j.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
.
В последнее время особое значение приобретают исследования тяжелых нейродегенеративных заболеваний человека, поскольку эти заболевания широко распространены и в большинстве случаев неизлечимы. Современные технологии позволяют попробовать взглянуть на патогенез данных заболеваний с молекулярно-генетической точки зрения, что дает надежду на их выявление на доклинической стадии и разработку эффективных методов профилактики и лечения. Одним из таких заболеваний является болезнь Паркинсона. К настоящему моменту найдены основные локусы семейных форм БП и ведется активный поиск генетических факторов развития гораздо более распространенной спорадической формы БП. Из литературных данных известно, что наиболее частой генетической причиной развития БП являются мутации в гене PARK2, основную долю которых составляют экзонные делеции и дупликации. Также относительно недавно были получены данные о том, что мутации, связанные с увеличением числа копий гена SNCA, могут быть частой причиной развития семейной формы БП с аутосомно-доминантным типом наследования. Высокая частота данных мутаций требует разработки эффективного метода их типирования. В связи с этим нами был разработан быстрый и точный метод выявления экзонных перестроек в генах PARK2 и SNCA, применимый для массового скрининга больных в клинических условиях. Полученные нами данные подтверждают высокую встречаемость экзонных перестроек в гене PARK2 и их важную роль в патогенезе спорадической формы БП, особенно с ранним началом развития, у больных из России. При анализе спектра делеций и дупликаций экзонов гена PARK2 было установлено, что наиболее часто встречаются экзонные перестройки экзонов 3 и 4. Анализ мультипликаций гена SNCA показал, что данные мутации не играют существенной роли в развитии БП в российской популяции. Таким образом, можно сделать вывод о необходимости анализа делеций и дупликаций экзонов гена PARK2 (в первую очередь, экзонов 3 и 4) у больных из России, особенно на ранних стадиях заболевания, когда с помощью грамотной терапии возможно замедлить развитие заболевания или уменьшить его тяжесть. Также анализ экзонных перестроек в гене PARK2 может быть очень эффективен на доклинических стадиях у родственников спорадических больных, которые составляют группу риска. В случае выявления экзонных перестроек, им может быть предложена терапия, способная, если не остановить развитие заболевания, то сдвинуть его дебют на более поздний срок и снизить тяжесть его протекания.
