Помощь в написании студенческих работ
Антистрессовый сервис

Изоцитратлиаза из сои

Диссертация: Изоцитратлиаза из сои
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Получение в электрофоретически гомогенном состоянии ключевого фермента глиоксилатного цикла изоцитратлиазы из семян сои позволило провести сравнительное исследование физико-химических, кинетических и регуляторных свойств изоцитратлиазы. Установлено, что основные свойства изучаемого фермента мало отличаются по своим характеристикам (молекулярной массе, сродству к различным субстратам, рН оптимуму… Читать ещё >

Изоцитратлиаза из сои (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Содержание

  • Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
    • 1. 1. Распространение глиоксилатного цикла, динамика активности изоцитратлиазы в растениях и её изоферментный состав
      • 1. 1. 1. Распространение глиоксилатного цикла
        • 1. 1. 1. 1. Распространение глиоксилатного цикла у растений
        • 1. 1. 1. 2. Распространение глиоксилатного цикла у микроорганизм ов
        • 1. 1. 1. 3. Распространение глиоксилатного цикла у животных
      • 1. 1. 2. Динамика активности изоцитратлиазы в растениях
      • 1. 1. 3. Изоферментный состав
    • 1. 2. Субклеточная локализация изоцитратлиазы
    • 1. 3. Анализ схемы очистки изоцитратлиазы
      • 1. 3. 1. Разрушение клеток и экстракция
      • 1. 3. 2. Фракционирование солями
      • 1. 3. 3. Гель-фильтрация
      • 1. 3. 4. Аффинная хроматография
      • 1. 3. 5. Ионообменная хроматография
    • 1. 4. Кинетические и регуляторные свойства изоцитратлиазы
      • 1. 4. 1. Колебание значений константы Михаэлиса-Ментен
      • 1. 4. 2. Значения рН оптимума
      • 1. 4. 3. Величины температурного оптимума
      • 1. 4. 4. Влияние катионов металлов
      • 1. 4. 5. Действие метаболитов
    • 1. 5. Молекулярные аспекты функционирования изоферментов изоцитратлиазы
      • 1. 5. 1. Идентификация генов изоцитратлиазы
      • 1. 5. 2. Роль дифференциальной экспрессии генов в адаптации и развитии организмов и факторы экспрессии
        • 1. 5. 2. 1. Роль дифференциальной экспрессии генов
        • 1. 5. 2. 2. Факторы экспрессии
  • Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТ
    • 2. 1. Цель и задачи
    • 2. 2. Объекты и методы исследования
      • 2. 2. 1. Объекты исследования
      • 2. 2. 2. Методы исследования
        • 2. 2. 2. 1. Схема очистки изоцитратлиазы
        • 2. 2. 2. 1. 1. Получение экстрактов
        • 2. 2. 2. 1. 2 Высаливание сульфатом аммония
        • 2. 2. 2. 1. 3. Гель-фильтрация на сефадексе С
        • 2. 2. 2. 1. 4. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе
        • 2. 2. 2. 1. 5. Гель-хроматография на сефадексе
        • 2. 2. 2. 2. Определение активности ферментов
        • 2. 2. 2. 3. Определение количества белка
        • 2. 2. 2. 4. Определение молекулярной массы нативного фермента
        • 2. 2. 2. 5. Электрофоретические исследования
        • 2. 2. 2. 5. 1. Определение гомогенности ферментов
        • 2. 2. 2. 5. 2. Специфическое проявление изоцитратлиазы
        • 2. 1. 2. 5. 3. Определение молекулярной массы субъединиц фермента методом ЗБЗ-ПААГ-электрофореза
        • 2. 2. 2. 6. Субклеточная локализация изоцитратлиазы
        • 2. 2. 2. 6. 1. Дифференциальное центрифугирование
        • 2. 2. 2. 6. 1. Изоплотностное центрифугирование
        • 2. 2. 2. 7. Кинетические характеристики и регуляция активности ферментов
        • 2. 2. 2. 7. 1. Величины константы Михаэлиса-Ментен
        • 2. 2. 2. 7. 2. Значения рН оптимума
        • 2. 2. 2. 7. 3. Влияние катионов металлов на активность изоформ
        • 2. 2. 2. 7. 4. Регуляция метаболитами
        • 2. 2. 2. 8. Разработка условий длительного хранения изоцитратлиазы
        • 2. 2. 2. 9. Идентификация генов ich и ich и регуляция их экспрессии
        • 2. 2. 2. 9. 1. Экстракция суммарной РНК по методу фенол-хлороформной экстракции
        • 2. 2. 2. 9. 2. Экстракция суммарной РНК помощью колонок Bio-Rad
        • 2. 2. 2. 9. 3. Выделение геномной ДНК с мочевиной
        • 2. 2. 2. 9. 4. Определение количества РНК
        • 2. 2. 2. 9. 5. Определение количества ДНК
        • 2. 2. 2. 9. 6. Проведение обратной транскрипции мРНК
        • 2. 2. 2. 9. 7. Подбор праймеров
        • 2. 2. 2. 9. 8. Проведение полимеразной цепной реакции
        • 2. 2. 2. 9. 9. Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени
        • 2. 2. 2. 9. 10. Выделение ДНК из полиакриламидных гелей
        • 2. 2. 2. 9. 11. Секвенирование ПЦР-продукта
        • 2. 2. 2. 9. 12 Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот
        • 2. 2. 2. 10. Статистическая обработка данных
    • 2. 3. Результаты и их обсуждение
      • 2. 3. 1. Динамика активности изоцитратлиазы в прорастающих семенах сои разных сортов
      • 2. 3. 2. Субклеточная локализация изоферментов изоцитратлиазы в прорастающих семенах сои
      • 2. 3. 3. Очистка изоцитратлиазы из сои разных сортов
        • 2. 3. 3. 1. Очистка изоцитратлиазы из сои вьетнамского сорта
  • DT-84″
    • 2. 3. 3. 2. Очистка изоцитратлиазы из сои сорта Воронежский-31″
      • 2. 3. 3. 3. Очистка изоцитратлиазы из сои белорусского сорта «Игорь»
      • 2. 3. 4. Электрофоретический анализ очищенных препаратов изоцитратлиазы
      • 2. 3. 5. Физико-химические, кинетические и регуляторные характеристики
      • 2. 3. 5. 1. Молекулярная масса и субъединичное строение изоформ изоцитратлиазы
      • 2. 3. 5. 2. Влияние концентрации изоцитрата на активность изоцитратлиазы
      • 2. 3. 5. 3. Значения pH оптимума
      • 2. 3. 5. 4. Влияние катионов металлов на активность изоформ
      • 2. 3. 5. 4. Влияние глицина и гликолата на активность изоферментов изоцитратлиазы
      • 2. 3. 6. Условия длительного хранения изоцитратлиазы
      • 2. 3. 7. Идентификация генов ich и ich и регуляция их экспрессии
      • 2. 3. 7. 1. Подбор праймеров
      • 2. 3. 7. 2. Идентификация генов методом ОТ-ПЦР
      • 2. 3. 7. 3. Секвенирование ПЦР-продуктов
      • 2. 3. 7. 4. Уровень экспрессии генов icl? и ich в онтогенезе проростков сои

Актуальность проблемы. В последнее время ферменты глиоксилатного цикла являются объектами значительного количества исследований. Глиоксилат-ный цикл выступает важнейшим этапом глюконеогенеза, т. к. осуществляет синтез из двух молекул ацетил-КоА одной молекулы сукцината, используемой в дальнейших реакциях, что обеспечивает синтез углеводов. Этот метаболический процесс имеет широкое распространение в природе, функционируя в различные физиологические периоды жизни многих организмов. В жирозапасающих тканях растений основной функцией глиоксилатного цикла считается участие в глюконеогенезе при мобилизации запасных жиров. У высших растений малатсинтаза и, особенно, изоцитратлиаза присутствуют в тканях, активно утилизирующих жиры. Обычно активность глиоксилатного цикла коррелирует с содержанием жира в семенах. Епринцев А. Т. с соавт. (2007) показали, что при прорастании семян запасные жиры, являющиеся водонерастворимыми, превращаются в углеводы, которые дальше транспортируются к метаболически активным точкам, где утилизируются в энергетических и анаболических процессах. Физиологическая роль глиоксилатного цикла для растений — важный этап глюконеогенеза, обеспечивающий растущий организм в условиях гетеротрофного питания доступными формами органического вещества [12].

Ключевыми ферментами глиоксилатного цикла являются изоцитратлиаза (ИЦЛКФ 4.1.3.1) и малатсинтаза. Изоцитратлиаза — фермент «метаболической вилки», как правило, является матриксным ферментом глиоксисом [19]. ИЦЛ легко высвобождается из органелл после осмотического шока, причём при наличии нескольких изоформ фермента никаких различий в их локализации не наблюдалось. Ферменты в одинаковой степени солюбилизируются из глиоксисом в растворимую фракцию при выделении органелл и одинаково хорошо освобождаются из них при осмотическом шоке. При градиентном фракционировании клеточных органелл процент солюбилизации изоцитратлиазы из глиоксисом оказывался неодинаковым для разных растений. В семядолях сои было обнаружено две формы изоцитратлиазы в глиоксисомах. Однако, в настоящее время, в ряде работ показано, что в зелёных листьях изоцитратлиаза локализована в пероксисомальной фракции [88]. В клетке могут одновременно присутствовать пероксисомальная и глиоксисомальная ИЦЛ, выполняющие по всей видимости, различные функции в метаболизме растительной клетки [141]. Два уникальных фермента глиоксилатного цикла изоцитратлиаза и малатсинтаза присутствуют в развивающихся семенах, листьях, пыльце и в других органах (корни, лепестки и плоды), а также в различных типах клеточных культур и т. д. После прорастания важнейшей функцией масличной пероксисомы в АгаЫс1ор31 $ зр. является трансформация жирных кислот в углеводы до начала фотоавтотрофного роста. Ферменты глиоксилатного цикла изоцитратлиаза и малатсинтаза преобразуют ацетил-КоА из жирных кислот в субстраты глюконеогенеза и находятся в пероксисомах зрелых проросших семян и саженцев [117].

К настоящему времени ИЦЛ очищена до гомогенного состояния из многих видов микроорганизмов, грибов [ЮЗ], высших растений [19], нематод [118], клещей [101], насекомых [10] и крыс [157]. Известно, что изоцитратлиаза в растениях представлена несколькими изоформами, имеющими различную локализацию в клетке.

В последнее время сообщается об использовании этого фермента при диагностике заболеваний растений. Так, Бауер П. С соавт. (Р. Воууег е1. а1., 2000) показали, что созданная ими конструкция гибрида промотора гена ИЦЛ АТеигоярога сгазяа с геном флуоресцирующего белка, экспрессировалась и заметно индуцировалась во время инфекции в паразите пшеницы Тарез1а уа11ипс1ае [53].

В настоящее время одной из важнейших культур в растительном мире признана соя, семена которой являются великолепной комбинацией жирных кислот и высокоценного растительного белка, в связи с чем служат объектом большого количества исследований. Отличительной особенностью сои является самое высокое содержание фосфолипидов по сравнению с другими культурами. Фосфолипиды способствуют регенерации мембран, увеличивают детоксика-ционную способность печени, обладают антиоксидантной активностью, снижают у диабетиков потребность в инсулине, предотвращают дегенеративные изменения в нервных клетках, мышцах, укрепляют капилляры. Полиненасыщенные жирные кислоты являются предшественниками в биосинтезе гормоноподобных веществ —- простагландинов, одной из многочисленных функций которых является препятствование отложению холестерина в стенках кровеносных сосудов, приводящего к образованию атеросклеротических бляшек. Наличие очень большого количества токоферолов в соевом масле обусловливает его способность в наибольшей степени повышать защитные свойства организма, замедлять старение. Поэтому представляется чрезвычайно важным охарактеризовать регуляторные свойства, ферментов сои в прорастающих семенах и особенно при смене типов питания.

Цель работы. Целью нашей работы являлось получение в гомогенном состоянии препаратов изоформ изоцитратлиазы из сои, изучение их физико-химических, регуляторных и кинетических характеристик, выявление генетической детерминированности и исследование уровня экспрессии генов изоцитратлиазы у прорастающих семян. Задачи исследования.

1. Выявить динамику активности, изоферментный состав и субклеточную локализацию изоцитратлиазы в проростках сои.

2. Получить электрофоретически гомогенные ферментные препараты изоцитратлиазы из проростков сои.

3. Изучить физико-химические, кинетические и регуляторные характеристики изоцитратлиазы.

4. Разработать высокоспецифические праймеры для идентификации генов ИЦЛ с использованием методов сравнительной геномики.

5. Провести ОТ-ПЦР анализ мРНК для идентификации генов, кодирующих изоферменты изоцитратлиазы.

6. Секвенировать участки генов изоферментов изоцитратлиазы из сои и провести сравнительный анализ с генами ИЦЛ других организмов.

7. Провести количественный анализ уровня экспрессии генов изоцитратлиазы сои на разных этапах онтогенеза методом ПЦР в реальном времени.

Научная новизна. Изменение в динамике активности изоцитратлиазы на первых этапах прорастания связано с мобилизацией запасных жиров и липидов. Выявлена чёткая зависимость генезиса активности изоцитратлиазы от сорта сои и условий выращивания.

Полученные результаты изучения субклеточной локализации изоцитратлиазы позволяют предположить, что в клетке изоцитратлиаза может находиться в глиоксисомальной, пероксисомальной и цитоплазматической фракциях. Большая часть активности изоцитратлиазы сосредоточена в пероксисомах, тогда как в цитоплазме активность фермента находится в пределах загрязнения.

Получение гомогенных препаратов изоформ изоцитратлиазы из проростков сои позволило исследовать их физико-химические, кинетические и регуляторные характеристики.

В данной работе праймеры для амплификации гена ИЦЛ были подобраны на основе сравнительного анализа последовательностей нуклеотидов изоцитратлиазы из различных организмов. Секвенирование полученных в ходе ПЦР продуктов показало, что выделенные после очистки изоформы изоцитратлиазы имеют различную генетическую детерминированность, т. е. являются изоферментами, обладающими различной функциональной значимостью.

Выявлена зависимость изменения уровня экспрессии генов и 1с12 от времени прорастания семян и зеленения проростков сои. Полученные данные по динамике экспрессии генов изоцитратлиазы позволяют оценить изменение скорости функционирования глиоксилатного цикла и выдвинуть предположение о его роли в метаболизме при прорастании семян и переходе их к фотосинтезу. В первые дни прорастания зародыш ещё не способен к фотосинтезу и получает необходимую энергию в процессе дыхания. Происходит активация глюконеогенетических процессов, физиологическая роль которых заключается в мобилизации запасных веществ. Однако, по мере зеленения проростков функцию обеспечения растения энергией берёт на себя фотосинтез, в связи с чем интенсивность глюконеогенеза значительно снижается по сравнению с первыми днями.

Практическая значимость. С помощью четырёхстадийной очистки с высокой эффективностью можно получать электрофоретически гомогенные препараты изоформ изоцитратлиазы. Использование изоформ ИЦЛ, выделенных из семядолей семян сои, открывает большие возможности для применения фермента в качестве аналитического реагента и создания на его основе биосенсоров для биохимических и кинетических анализов, в частности, для определения концентрации глиоксиловой кислоты (прямая реакция) или изоцитрата (обратная реакция) в биохимических пробах.

Материалы диссертационной работы используются в ходе учебного процесса на биолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета, при чтении лекций по биохимии, физиологии растений и молекулярной биологии, спецкурсов по энзимологии и генетической инженерии, кроме того, они находят применение при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на студенческой научной конференции по итогам работы за 2006 год (ВГПУ, 2007), 12-й международной Пущинской конференции молодых учёных «Биология — наука 21-ого века» (Пущино,.

2008), международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007), 3-й международной конференции «Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья» (Белгород, 2008), межрегиональных конференциях, посвященных памяти А. А. Землянухина «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2007, 2008, 2009, 2010).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 12 публикациях — 7 статьях и 5 тезисах.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (212 источников). Иллюстрационный материал включает 36 рисунков, 6 таблиц.

ВЫВОДЫ.

1. Динамика активности изоцитратлиазы из Glycine max L. сортов «Воронежский-31», вьетнамского «DT-84» и белорусского «Игорь» показала, что она имеет колоколообразный вид. Максимальные значения активности изоцитратлиазы при прорастании сои на свету наблюдали на 5-й день у вьетнамского сорта «DT-84» и сорта «Воронежский-31», на 3-й день — у растений белорусского сорта «Игорь». В темноте картина динамики активности отличается только у растений сорта «Воронежский-31».

2. В семядолях проростков сои присутствуют две формы фермента — ИЦЛ, с относительной электрофоретической подвижностью Rf— 0,28 и ИЦЛ2 с. Rf— 0,44. Исследуемый фермент имеет преимущественно пероксисо-мальную локализацию, поскольку величина активности фермента в цитоплазме находится в пределах загрязнения. Функции выделенных изоформ в семядолях семян сои различны: первая изоформа обеспечивает функционирование глиоксилатного цикла, а вторая участвует в метаболизме органических кислот.

3. Использование модифицированной схемы очистки позволило получить гомогенные препараты изоферментов изоцитратлиазы из сои разных сортов. Так, параметры препаратов фермента из сои вьетнамского сорта «DT-84» составили: удельная активность ИЦЛ1 2,50 Е/мг белка, при этом степень очистки 62,50 разавыход — 9,77%. Для второй изоформы (ИЦЛ2) значение удельной активности равнялось 3,56 Е/мг белка, а степень очистки — 89,00 развыход — 10,87%.

4. Значения молекулярной массы первого изофермента составляло 272 кДа, а второго — 246 кДа. С помощью гель-хроматографии на сефадексе G-200 и SDS-ПААГ-электрофореза было установлено, что ИЦЛ, и ИЦЛ2 состоят из четырёх одинаковых субъединиц, т. е. являются гомотетрамерами с молекулярной массой субъединиц 66 кДа. Выделенные изоферменты отличались по электрофоретической подвижности и четвертичной структуре.

5. Механизм ферментативного действия изучаемого фермента подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен. Значения константы Михаэлиса, характеризующие сродство изоцитратлиазы к субстрату (изоцитрату), для первой изоформы составляли 16 мкМ, для второй изоформы — 50 мкМ, т. е. первый изофермент обладает большим сродством к субстрату.

6. Комплекс Mg2+ с изоцитратом является истинным субстратом ИЦЛ. Глиоксисомальная форма изоцитратлиазы (ИЦЛ,) является Mg-зависимым ферментом, тогда как ИЦЛ2 активировалась ионами Мп2+, т. е. является Mn-зависимой. Другие однои двухвалентные катионы (Са2+, К+ и Na+) мало эффективны в регуляции активности изоформ изоцитратлиазы.

7. Влияние различной концентрации фотодыхательных метаболитов — глицина и гликолата на активность изоформы ИЦЛ показало, что глицин активировал ИЦЛ, в концентрации 5 мкМ. Дальнейшее увеличение концентрации приводило к понижению активности фермента. Максимальную активность — ИЦЛ (наблюдали в присутствии гликолата с концентрацией 100 мкМ. Было обнаружено, что ИЦЛ2 проявляла наибольшую активность при 5 мкМ концентрации глицина и гликолата.

8. Были использованы различные методики выделения РНК. Подобранные нами праймеры позволили получить два ПЦР-продукта гена изоцитратлиазы.

9. Секвенирование полученных ампликонов подтвердило их специфичность, а методами сравнительной геномики было установлено, что гомология гена icl 1 с кДНК ИЦЛ Glycine max sa92d05. yl Gm-cl004 и кДНК ИЦЛ Glycine max sam76e08. yl Gm-cl069 составляет 98,3% и 97,9%, соответственно. Для icl2 она равняется 98,5% и 88,2% гомологии с кДНК Glycine max GMFL01−09-J11 и кДНК Glycine max GMFL01−15-P18, соответственно.

10. Динамика экспрессии генов ici] и icl2 при прорастании семян и зеленении проростков сои показала, что относительные концентрации транскриптов генов ici 1 и icl2 являются максимальными на 3-й день экспозиции, а к 6-му дню значительно снижаются. К 9-му дню наблюдается отсутствие транскрипции ici], в то время как уровень экспрессии icl2 возрастает, что обусловлено физиологическим переходом (зеленением), вызывающим доминирование фотосинтеза и снижение интенсивности глюконеогенеза. Изменение уровня экспрессии исследуемых генов чётко коррелирует с динамикой активности изоферментов ИЦЛ в сое при прорастании, являясь одним из важных механизмов их функциональной регуляции.

И. Разработана гипотетическая схема регуляции функционирования изоферментов изоцитратлиазы в сое, показывающая, что функциональный переход растений к автотрофному питанию вызывает интенсификацию экспрессии icl2. Функционирование данного изофермента (ИЦЛ2) не связано с работой глиоксилатного цикла.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Анализ полученных данных по динамике изоцитратлиазной активности показывает сортовую специфичность, обусловленную их генотипическими свойствами. Изменение в динамике активности изоцитратлиазы на первых этапах прорастания связано с мобилизацией запасных жиров и липидов. Выявлена чёткая зависимость генезиса активности изоцитратлиазы от сорта сои и условий выращивания.

Большая часть активности изоцитратлиазы сосредоточена в пероксисомах, активность фермента в цитоплазме находится в пределах значений загрязнения. В некоторых публикациях есть сообщения, что внутриклеточное распределение изоцитратлиазы в сое связано с глиоксисомаль-ной и пероксисомальной фракциями. В момент функционального перехода растительных тканей, вызванного сменой типа питания в клетках, одновременно присутствуют как глиоксисомы, так и пероксисомы с соответствующей им системой ферментов [68].

С помощью многостадийной очистки можно получать в электрофотрети-чески гомогенном состоянии препараты двух изоферментов изоцитратлиазы из сои разных сортов. Применение ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе с линейным градиентом концентрации КС1 позволило получить в высокоочищенном состоянии две изоформы изоцитратлиазы из семядолей Glycine max L. с Rf — 0,28 (ИЦЛ,) и Rf — 0,44 (ИЦЛ2) и провести их сравнительный анализ. Использование изоформ изоцитратлиазы, выделенных из семядолей сои, открывает большие возможности для применения фермента в качестве аналитического реагента и создания на его основе биосенсоров для биохимических и кинетических анализов, в частности для определения концентрации глиоксиловой кислоты (прямая реакция) или изоцитрата (обратная реакция) в биохимических пробах [47, 183].

Получение в электрофоретически гомогенном состоянии ключевого фермента глиоксилатного цикла изоцитратлиазы из семян сои позволило провести сравнительное исследование физико-химических, кинетических и регуляторных свойств изоцитратлиазы. Установлено, что основные свойства изучаемого фермента мало отличаются по своим характеристикам (молекулярной массе, сродству к различным субстратам, рН оптимуму, влиянию катионов металлов и т. д.) от ИЦЛ из других организмов. Было выявлено, что ИЦЛ, и ИЦЛ2 состоят из четырёх одинаковых субъединиц с молекулярной массой 66 кДа, т. е. являются гомотетрамерами. Согласно большинству данных литературы, изоцитратлиаза из других объектов, как правило, имеет чётное число субъединиц с молекулярной массой 60 кДа. Выделенные и очищенные до гомогенного состояния изоформы изоцитратлиазы обладают различным сродством к субстрату. Это свидетельствует, главным образом, о различии форм изоцитратлиазы, что позволяет предположить их различную генетическую детерминированность [135]. Было выявлено, что глиоксисомальная форма изоцитратлиазы (ИЦЛ[) является Mg-зависимым ферментом, тогда как ИЦЛ2 активировалась ионами Мп2+, т. е. является Mn-зависимой. Другие однои двухвалентные катионы (Са2+, К+ и Na+) мало эффективны в регуляции активности изоформ изоцитратлиазы. Полученные нами данные коррелируют с результатами, проведёнными на других объектах исследования. ИЦЛ, выделенной из семядолей проростка Lupinus, необходимо присутствие Mg2+ тоже в концентрации 5 мМ, при этом достигается максимальная активация ИЦЛ [203].

Большое внимание было уделено молекулярным аспектам функционирования изоферментов изоцитратлиазы, т. е. идентификации генов ici! и icl2 и регуляции их экспрессии. В нашей работе был использован метод подбора праймеров по последовательности нуклеотидов из различных организмов. Нам удалось получить два продукта гена изоцитратлиазы. Было выявлено, что в семенах сои существуют два гена ИЦЛ — ici 1 и icl2.

Нуклеотидная последовательность iclj имеет 98,3% гомологию с к ДНК ИЦЛ из клонотеки Glycine max sa92d05. yl Gm-cl004- 97,9% — Glycine max sam76e08. yl Gm-cl069. У второго продукта была прочитана последовательность длиной 594 н.п. Эта последовательность нуклеотидов на 98,5% соответствует кДНК ИЦЛ из клонотеки Glycine max GMFL01−09-J11 и 88,2% — Glycine max GMFL01−15-P18. Полученные продукты отличаются по своему нуклеотидному составу друг от друга и имеют гомологию между собой 19,9%. Следовательно, наличие двух форм фермента и двух ПТ IP-продуктов с геноспецифическими праймерами является результатом работы двух разных генов, кодирующих ИЦЛ в геноме сои.

В данной работе выявлена зависимость изменения уровня экспрессии генов iclj и icl2 от времени прорастания семян и в процессе зеленения проростков сои. Изменение уровня экспрессии исследуемых генов чётко коррелирует с полученными данными о суммарной активности ИЦЛ в сое при прорастании, и, вероятно, является одним из механизмов её регуляции. После зеленения семядолей сои, уровень экспрессии генов, ответственных за глиоксисомальную функцию, резко снижается, и преобладает фотодыхательная деятельность пероксисом [68]. Данные по динамике экспрессии генов изоцитратлиазы позволяют оценить изменение скорости функционирования глиоксилатного цикла и выдвинуть предположение о его роли в метаболизме при прорастании семян и переходе их к фотосинтезу. В первые дни прорастания зародыш ещё не способен к фотосинтезу и получает необходимую энергию в процессе дыхания. Происходит активация глюконеогенетических процессов, физиологическая роль которых заключается в мобилизации запасных веществ. Однако, по мере зеленения проростков функцию обеспечения растения энергией берёт на себя фотосинтез, в связи с чем интенсивность глюконеогенеза значительно снижается по сравнению с первыми днями.

На основании полученных результатов разработана гипотетическая схема участия изоферментов изоцитратлиазы в регуляции мобилизации запасных жиров и фотодыхания в клетках семядолей сои в процессе функционального перехода. Установлена различная генетическая детерминированность изоформ исследуемого фермента. Предполагается, что функционирование в клетках зелёных растений ИЦЛ2 не связано с работой глиоксилатного цикла (рис. 36).

ЖЁЛТЫЕ (ЭТИОЛИРОВАННЫЕ^ СЕМЯДОЛИ.

Глутамат — 2-ОГ •.

Изоцитрат ицл2.

Глицин Гликолат.

Глиоксилат?-^-Глицин-V" — Глицин.

Глутамат н, о.

2-ОГ о2.

——-Глицерат-^-1^^^" Серии ——Серии.

ФОТОДЫХАНИЕ ЗЕЛЁНЫХ СЕМЯДОЛЕЙ.

Рис. 36. Гипотетическая схема участия изоферментов ИЦЛ в мобилизации запасных жиров и фотодыхании в клетках семядолей сои в процессе функционального перехода.

ГЦ — глиоксилатный цикл, ТАГ — триацилглицерол, ЖК — жирные кислоты, ФЕП — фосфоренол пиру ват, 2-ОГ — 2-оксоглутарат, 1 — липаза, 2 — малатдегидрогеназа, 3 — цитратсинтаза, 4 — аконитатгидра-таза, 5 — изоцитратлиаза (ИЦЛ,), 6 — малатсинтаза, Р — рибулёза-бисфосфаткарбоксилаза, Г — гликолатоксидаза, К — каталаза.

Показать весь текст

Список литературы

  1. Ф. Современная генетика в 3-х т. / Ф. Айала. — М.: Мир, 1988. — 998 с.
  2. И. В. Основы физической химии ферментативного катализа / И. В. Березин, К. Мартинек. — М.: Высш. шк., 1977. — 280 с.
  3. Т. Т. Биологическая химия: Учебник.— 3-е изд., перераб. и доп. / Т. Т. Березов, Б. Ф. Коровкин. —М.: Медицина, 1998. — 704 с.
  4. С. В. Субклеточная локализация и свойства ферментов глиоксилатного цикла в печени крыс с аллоксановым диабетом / С. В. Волвенкин, В. Н. Попов, А. Т. Епринцев // Биохимия. — 1999. — Т. 64, Вып. 9. —С. 1185−1191.
  5. А. М. Краткий справочник по физиологии растений / А. М. Гродзинский, Д. М. Гродзинский. —- Киев: Наукова думка, 1973. — 273 с.
  6. Г. Гель-хроматография / Г. Детерман. — М.: Мир, 1970. — 173 с.
  7. М. Ферменты: в 3-х т. / М. Диксон, Э. Уэбб- перевод с англ. Л. М. Гинодмана, М. И. Левянт- под ред. В. К. Антонова, А. Е. Браунштейна. — М.: Мир, 1982. — 1117 с.
  8. А. Т. Полимеразная цепная реакция как универсальный метод диагностики и идентификации генов / А. Т. Епринцев, Е. А. Москалёв, В. Н. Попов // Системный анализ и управление в биомедицинскихсистемах. — 2001. — T. 54, № 1. — С. 9−14.
  9. А. Т. Очистка и физико-химические свойства изоцитратлиазы из куколок бабочки P. machaon L. / А. Т. Епринцев, М. Ю. Шевченко, В. Н. Попов. // Биохимия. — 2004. — Т. 69, № 4. — С. 467−472.
  10. А. Т. Экспрессия и регуляция ферментов глиоксилатного цикла / А. Т. Епринцев, В. Н. Попов, М. Ю. Шевченко. — Воронеж.: Центрально-Черноземное книжное издательство, 2005. —224с.
  11. А. Т. Глиоксилатный цикл: Универсиальный механизм адаптации? / А. Т. Епринцев, В. Н. Попов, М. Ю. Шевченко. — М.: ИКЦ «Академкнига», 2007. — 228 с.
  12. Землянухин JL А. Очистка и свойства изоцитратлиазы из подсолнечника / JI. А. Землянухин, А. У. Игамбердиев, А. А. Землянухин // Биохимия. — 1984. — Т. 49, Вып. 3. — С. 387−393.
  13. А. А. Регуляция активности изоцитратлиазы в растениях конопли / А. А. Землянухин, А. У. Игамбердиев // Физиология растений. — 1985. — Т. 32, Вып. 4. — С. 739−746.
  14. А. А. Глиоксилатный цикл растений / А. А. Землянухин, JI. А. Землянухин, А. Т. Епринцев, А. У. Игамбердиев / ВГУ. — Воронеж, 1986. — 148 с.
  15. А. А. Большой практикум по физиологии растений. Учеб. пособие / А. А. Землянухин / JI. А. Землянухин. — Воронеж: ВГУ, 1996. — 188с.
  16. А. У. Внеглиоксисомальная форма изоцитратлиазы высших растений / А. У. Игамбердиев, А. А. Землянухин, И. В. Мещерякова // Физиология растений. — 1986. — Т. 33, Вып.6. — С. 1113−1120.
  17. А. У. Исследование кинетических свойств и модификаций аминокислотных остатков изоцитратлиазы из щитка кукурузы / А. У. Игамбердиев, А. А. Землянухин // Биохимия. — 1987. — Т. 52, Вып. 8. — С. 1286−1293.
  18. А. У. Микротельца в метаболизме растений / А. У. Игамбердиев / ВГУ. — Воронеж, 1990. — 148 с.
  19. А. У. Роль пероксисом в организации метаболизма растений / А. У. Игамбердиев // Соросовский Образовательный журнал. — 2000.—Т. 6, № 12. —С. 113−124.
  20. М. А. Физико-химические и кинетические характеристики изоцитратлиазы из МасвомопаБ ШрипММа / М. А. Климова // Весник ВГУ. Серия. Химия, Биология, Фармация. — 2004. — № 2. ¦— С. 139−141.
  21. А. Т. Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств: Учебно-методическое пособие для вузов (Практикум) / М. А. Климова, А. Т. Епринцев. — Воронеж: Изд-во ВГУ, 2008, — 36 с.
  22. Ф. Регуляция ферментативной активности / Ф. Коэн — Москва: Мир, 1986. — 144 с.
  23. Г. Ф. Биометрия / Г. Ф. Лакин. — Москва: Высшая школа, 1990. — 352 с.
  24. Н. П. Субстратное обеспечение энергетического гомеостаза при голодании / Н. П. Лебкова // Бюл. эксперим. биологии и медицины. — 1991. — № 11. — С.475−480.
  25. А. Биохимия / А. Ленинджер. — М.: Мир, 1985. — 1056 с.
  26. Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сэмбрук. — М.: Мир, 1984. — 480с.
  27. Е. В. Субклеточная локализация активности изоцитратлиазы из щитков кукурузы / Е. В. Маслова, Д. Н. Федорин, В. Ю. Башмаков и др. // Вестник ВГУ. Серия: Химия, Биология, Фармация. — 2007. — № 2. —С. 71−74.
  28. Г. Диск-электрофорез / Г. Мауэр / Пер. с англ. — Москва: Мир, 1971. —222 с.
  29. JI. А. Исследование биологических макромолекул / Л. А. Остерман. — Москва: Мир, 1983. — 297 с.
  30. С. Е. Практикум по биохимии / С. Е. Северин, Г. А. Соловьева. — М.: Изд-во МГУ. — 1989. — 509 с.
  31. Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс. — М.: Изд-во Мир. — 1985. —358 с.
  32. В. Ю. Действие стрессоров на дифференциальную экспрессию генов в ходе развития Neurospora crassa / В. Ю. Соколовский, Т. А. Белозерская // Успехи биол.химии. — 2000. — Т. 40. — С. 85−152.
  33. Л. Биохимия- Пер. с англ. / Л. Страйер. — М.: Мир, 1984 — Т. 1 — 232 с.
  34. Г. А. Вероятность и статистика в биологии и химии / Г. А. Чернышев, В. H Стариков. — Воронеж: ВГУ, 1998. — 270 с.
  35. В. И. Фотодыхание / В. И. Чиков // Соросовский Образовательный Журнал. 1996. — № 11. — С. 2−8
  36. М. Ю. Выделение и очистка изоцитратлиазы из куколок бабочки P. machaon L. / M. Ю. Шевченко, Е. А. Москалёв, А. Т. Епринцев // Биология — наука XXI века: Материалы 7-й Пущинской конф. молодых учёных, Пущино. — 2003. — Т. 1. — С. 390−391.
  37. М. Ю. Очистка изоцитратлиазы из печени эмбрионов Gallus domesticus L. / M. Ю. Шевченко и др. // Сорбционные хроматографи-ческие процессы. — 2006. — Т. 6, Вып. 5. — С. 851−854.
  38. Abba S. The role of the glyoxylate cycle in the symbiotic fungus Tuber borchii: expression analysis and subcellular localization/ S. Abba // Biomedical and Life Sciences. — 2007. — Vol. 52, No. 3−4. — P. 159−170.
  39. Arai Y. Proteomic Analysis of Highly Purified Peroxisomes from Etiolated Soybean Cotyledons / Y. Arai // Plant and Cell Physiology. — 2008.— Vol. 49, I. 4. — P. 526−539.
  40. Asakura M. Multiple Contributions of Peroxisomal Metabolic Function to Fungal Pathogenicity in Colletotrichum lagenarium / M. Asakura, T. Okuno, Y. Takano // Applied and Environmental Microbiology. — 2006. — Vol. 72, No. 9. — P. 6345−6354.
  41. Atomi H. Peroxisomal Isocitrate Lyase of the «-Alkane-Assimilating Yeast: Gene Analysis and Characterization / H. Atomi et. al. // Journal of Biochemistry. — 1990. — Vol. 107, No. 2. — 262 p.
  42. Bahk Y. Y. Acidic isocitrate lyase from Acinetobacter calcoaceticus Grown on malonat / Y. Y. Bahk // Korean Biochem. — 1987. — Vol. 20, No. 2. — P. 191−197.
  43. Bailon P. Affinity chromatography. Methods and protocols / P. Bailon // Humana Press. — 2000. — 240 p.
  44. Bassi A. S. Carbon Paste Biosensor Based on Crude Soybean Seed Hull Extracts for Phenol Detection / A. S. Bassi, C. McGrath // J. Agric. Food Chem. — 1999. — Vol. 47. — P. 322−326.
  45. Beeching J. R. Nucleic acid (cDNA) and amino acid sequences of isocitrate lyase from castor bean / J. R. Beeching // Plant Molecular Biology. — 1987. — Vol. 8, No. 6. —P. 471−475.
  46. Bellion E. Two Distinct Isocitrate Lyases from a Pseudomonas Species / E. Bellion // J Bacteriol. — 1975. — Vol. 122, No. 2. — P. 557−564.
  47. Bentrup K. H. Z. Characterization of Activity and Expression of Isocitrate Lyase in Mycobacterium avium and Mycobacterium tuberculosis / K. H. Z. Bentrup //Journal of Bacteriol. — 1999. — Vol. 181, No. 23. — P. 7161−7167.
  48. Birnboim H. C. A rapid alkaline extraction procedure for screeningrecombinant plasmid DNA / H. C. Birnboim, J. Doly // Nucleic Acid Res. — 1979,—Vol. 7. —P. 1513−1523.
  49. Blackburn P. Ribonuclease inhibitor from human placenta: interaction with derivatives of ribonuclease A / P. Blackburn, B. L. Jailkhani // J Biol Chem. — 1979. — Vol. 254. — P. 12 488−12 493.
  50. Bowyer P. Use of an isocitrate lyase promoter—GFP fusion to monitor carbon metabolism of the plant pathogen Tapesia yallimdae during infection of wheat / P. Bowyer, E. Mueller, J. Lucas // Mol. Plant Pathol. — 2000. — V. 1, No. 1.—P. 253−262.
  51. Britton K. L. The structure and domain organization of Escherichia coli isocitrate lyase / K. L. Britton // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. — 2001.—Vol. 57, Part9.—P. 1209−1218.
  52. Canovas D. Developmental regulation of the glyoxylate cycle in the human pathogen Penicillhtm marneffei / D. Canovas, A. Andrianopoulos // Mol Microbiol. —2006. —Vol. 62, No. 6. —P. 1725−1738.
  53. Chaves R. S. Isocitrate lyase localisation in Saccharomyces cerevisiae cells / R. S. Chaves//Gene. — 1997. —Vol. 198,1. 1−2. —P. 165−169.
  54. Chomczynski P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction / Chomczynski P., Sacchi N. // Anal. Biochem. — 1987. — Vol. 162. — P. 156−159
  55. Cioni M. Comparative biochemistry of the glyoxylate cycle / M. Cioni, G. Pinzauti, P. Vanni // Comp. Biochem. Physiol. — 1981. — Vol.70, No. 1. — P. 1−26.
  56. Comai L. Coordinate Expression of Transcriptionally Regulated Isocitrate Lyase and Malate Synthase Genes in Brassica napus L / L. Comai // The Plant Cell. — 1989.—Vol. 1,1 3.— P. 293−300.
  57. Davis B. J. A new high-resolution electrophoresis method / B. J. Davis, L. Ornstein // Delivered at the society for the study at the New York Academy of Medicine. — 1959.—P. 112−118.
  58. Davis W. L. Glyoxylate cycle in the rat liver: effect of vitamin D3-treatment / W. L. Davis, J. L. Matthews, D. B. Goodman // Faseb J. — 1989. — Vol. 3. — P. 1651−1655.
  59. Davis W. L. Hibernation activates glyoxylate cycle and gluconeogenesis in black bear brown adipose tissue / W. L. Davis, D. B. Goodman, L. A. Crawford // Biochim Biophys Acta. — 1990. — Vol. 1051, No. 3. — P. 276−278.
  60. Davis W. L. Evidence for the glyoxylate cycle in human liver / W. L. Davis, D. B. Goodman // Source Anatomical Record. — 1992. — V. 234, No. 4. — P. 461−468.
  61. De Bellis L. Localization of glyoxylate-cycle marker enzymes in peroxisomes of senescent leaves and green cotyledons / L. De Bellis, P. Picciarelli, L. Pistelli // Planta. — 1990. — Vol. 180, No. 3. — P. 435−439.
  62. De Hoop M. J. Import of proteins into peroxisomes and other microbodies / M. J. De Hoop, A. B. Geert // Biochem J. — 1992. — Vol. 286. — P. 657−669.
  63. De Lucas J. R. Purification and properties of isocitrate lyase from Aspergillus nidulans, a model enzyme to study catabolite inactivation in filamentous fungi / J. R. De Lucas et. al. // Microbiol. — 1997. — Vol. 101. — P. 410 414.
  64. Delkin G. Specific elements of the glyoxylate pathway play a significant role in the functional transition of the soybean cotyledon during seedling development / G. Delkin, L. Vodkin // BMC Genomics. — 2007. — Vol. 8, No. 468.—P. 1−22.
  65. Dunn M. F. Major roles of isocitrate lyase and malate synthase in bacterial and fungal pathogenesis / M. F. Dunn, J. A. Ramirez-Trujillo, I. Hernandez-Lucas // Microbiology. —2009. —Vol. 155,1. 10.—P. 3166−3175.
  66. Eastmond P. J. Postgerminative growth and lipid catabolism in oilseeds lacking the glyoxylate cycle / P. J. Eastmond, V. Germain, P. R. Lange // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2000. — Vol. 97,1. 10. — P. 5669−5674.
  67. Eprintsev A. T. Physicochemical and kinetic characteristics of isoforms of isocitrate lyase from corn / A. T. Eprintsev, E. V. Maslova, D. N. Fedorin et. al. // Biochemistry (Mosc). — 2009. — Vol. 74,1. 5. — P. 528−532.
  68. Ernesto J. M. tuberculosis isocitrate lyases 1 and 2 are jointly required for in vivo growth and virulence / J. Ernesto // Nature Medicine. — 2005. — Vol. 11. — P. 638−644.
  69. Eubel H. Isolation and subfractionation of plant mitochondria for proteomic analysis / H. Eubel, L. J. Heazlewood, A. H. Millar // Plant Proteomics, Methods in Molecular Biology. — 2007. — Vol. 355. — P. 49−62.
  70. Fargeix C. Soybean (Glycine max L.) and bacteroid glyoxylate cycle activities during nodular senescence / C. Fargeix, K. Gindro, F. Widmer // J. Plant Physiol. — 2004. — Vol. 161. — P. 183−190.
  71. Fernandez E. The ICL1 gene from Saccaaromyces cerevisiae II E. Fernandez, F. Moreno // Biochem. — 1992. — Vol. 204, No. 1. — P. 983−990.
  72. Firenzuoli A. M. Enzymes of glyozylate cycle in conifers / A. M. Firenzuoli, P. Vanni, E. Mastronuzzi // Plant Physiol. — 1968. — V. 43, No. 7. — P. 11 251 128.
  73. Forster A. Overexpression of the ICL1 gene changes the product ratio of citricacid production by Yarrowia lipolytica // A. Forster et. al. // Appl Microbiol Biotechnol. — 2007. — Vol. 77, No. 4. — P. 861−870.
  74. Frevert J. Purification and Glycoprotein Nature of Glyoxysomal Isocitrate Lyase from Cucumber Cotyledons / J. Frevert, H. Kindl // Eur J Biochem. — 1978. — Vol. 92. — P. 35−43.
  75. Frevert J. Occurrence and biosynthesis of glyoxysomal enzymes in ripening cucumber seeds / J. Frevert, W. Koller, H. Kindl // Physiol.Chem. — 1980. — Vol. 361, No. 10.—P. 1557−1565.
  76. Gemmrich A. R. Isocitrate lyase in germinating spores of the fern Anemia phyllitids / A. R. Gemmrich // Phytochemistry. — 1979. — Vol. 18, No. 6. — P. 1143−1146.
  77. Giachetti E. Effect of Mg2+ and Mn2+ on isocitrate lyase, a non-essentially metal-ion-activated enzyme A graphical approach for the discrimination of the model for activation / E. Giachetti, P. Vanni // Biochem J. — 1991. — Vol. 276. — P. 223−230.
  78. Godavari H. R. Isocitrate lyase in green leaves / H. R. Godavari// Plant Physiol. — 1973. — Vol. 51, No. 6 — P. 863−867.
  79. Goodman D. B. Glyoxylate cycle in toad urinary bladder: possible stimulation by aldosterone / D. B. Goodman, W. L. Davis, R. G. Jones // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1980. — Vol. 77, No. 3. — P. 1521−1525.
  80. Guo Y. Transcriptome of Arabidopsis leaf senescence / Y. Guo et. al. // Plant Cell EnViron. — 2004. — Vol. 27. — P. 521−549.
  81. Hashimoto K. Peroxisomal localization of a myosin XI isoform in Arabidopsis thaliana / K. Hashimoto, H. Igarashi, S. Mano et. al. // Plant Cell Physiol. — 2005. — Vol. 46. — P. 782−789.
  82. Hayashi M. Functional transformation of plant peroxisomes / M. Hayashi, K. Toriyama, M. Kondo et. al. // Cell Biochemistry and Biophysics. — 2000. — Vol. 32,1. 1−3.—P. 295−304.
  83. Hayashi M. Arabidopsis thaliana — A model organism to study plantperoxisomes / M. Hayashi, M. Nishimura // Biochimica et Biophysica Acta (BBA). —2006.—Vol. 1763,1. 12. — P. 1382−1391.
  84. Holmes R. P. The absence of glyoxylate cycle enzymes in rodent and embrionic chick liver / R. P. Holmes // Biochim. Biophys. Acta. — 1993. — Vol. 1158. —P. 47−51.
  85. Hou W. C. Activity staining of isocitrate lyase after electrophoresis on either native or sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels / W. C. Hou et. al. // Electrophoresis. — 2001. — Vol. 22, No. 13. — P. 2653−2658.
  86. Hoyt J. C. Purification and Characterization of Acinetobacter calcoaceticus Isocitrate Lyase / J. C. Hoyt // J Bacteriol. — 1991. — Vol. 173, No. 21. — P. 6844−6848.
  87. Hunt L. Subcellular Localization of Isocitrate Lyase in Nongreen Tissue Culture Cells / L. Hunt // Plant Physiology. — 1978. — Vol. 61. — P. 10 101 013.
  88. Hynes M. J. Genetic Analysis of the Role of Peroxisomes in the Utilization of Acetate and Fatty Acids in Aspergillus nidulans / M. J. Hynes // Genetics. — 2008. —Vol. 178.—P. 1355−1369.
  89. Idnurm A. Isocitrate Lyase Is Essential for Pathogenicity of the Fungus Leptosphaeria maculans to Canola (Brassica napus) / A. Idnurm, B. J. Howlett // Eukaryot Cell. — 2002. — Vol. 1, No. 5. — P. 719−724.
  90. Idnurm A. Peroxisome Function Regulates Growth on Glucose in the Basidiomycete Fungus Cryptococcus neoformans / A. Idnurm // Eukdaryotic Cell. — 2007. — Vol. 6, No. 1. — P. 60−72.
  91. Ishii A. Isozymes of Isocitrate Dehydrogenase from an Obligately Psychrophilic Bacterium, Vibrio Sp. Strain ABE-1: Purification, and
  92. Modulation of Activities by Growth Conditions / A. Ishii // The Journal of Biochemistry. — 1987. — Vol. 102,1. 6. — P. 1489−1498.
  93. John P. C. L. The Purification and Properties of Isocitrate Lyase from Chlorella / P. C. L. John // Biochem J. — 1967. — Vol. 105, No. 1. — P. 409 416.
  94. Kamel M. Y. Biochemical studies of tick embriogenesis. Purification and partial characterisation of isocitrate lyase from eggs of the tick Hyalomma dromedarii / M. Y. Kamel, A. S. Fahmy // Comp. Biochem. Physiol. B. — 1982.—Vol. 72. —P. 107−115.
  95. Karlekar K. Salt mediated changes in some enzymes of carbohydrate metabolism in halotolerant Cladosporium sphaerospermum / K. Karlekar, T. V. Parekh, H. S. Chhatpar 11 Journal of Biosciences. — 1985. — Vol. 9, No. 3−4.—P. 197−201.
  96. N., Amano Y., Nakadate M. // Ferment and Bioeng. 1989. — V. 67. No. 3. —P. 153−157.
  97. Khan F. R. Purification and properties of isocitrate lyase from flax seedlings / F. R. Khan, M. Saleemuddin, M. Siddiqi et. al. //Arch. Biochem. Biophys. — 1977.—Vol. 183. —P. 13−23.
  98. Khan F. R. McFadden B. A. Embryogenesis and the glyoxylate cycle // FEBS Lett. — 1980.-Vol. 115. —P. 312−314.
  99. Khan F. R. Isocitrate Lyase from Flax. Terminal Residues, Composition, Active Site, and Catalysis / F. R. Khan, B. A. McFadden // Plant Physiol. — 1982. — Vol. 70, No. 4. — P. 943−948.
  100. Kochlcina V. M. Isolation, Purification, and Crystallization of Aspartate Aminotransferase from Wheat Grain / V. M. Kochkina // Biochemistry
  101. Moscow). — 2004. — Vol. 69, No. 8. — P. 897−900.
  102. Kornberg H. L. Synthesis of cell constituents from C2-units by a modigied tricarboxylic acid cycle / H. L. Kornberg, H. A. Krebs // Nature. — 1957. — Vol.179. — P. 988−991.
  103. Kretzschmar U. Function and transcriptional regulation of the isocitrate lyase in Pseudomoncis aeruginosa / U. Kretzschmar et. al. // Arch Microbiol. — 2008.—Vol. 190, No. 2.—P. 151−158.
  104. Kunze M. A central role for the peroxisomal membrane in glyoxylate cycle function / M. Kunze, I. Pracharoenwattana, S. M. Smith et. al. // Biochim Biophys Acta. — 2006. — Vol. 1763.—P. 1441−1452.
  105. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during te assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. — 1970. — V. 227. — P. 680−683.
  106. Large P. J. Subcellular location of the enzymes of purine breakdown in theyeast Candida famata grown on uric acid / P. J. Large, H. R. Waterham, M. Veenhuis // FEMS Microbiology Letters. — 1990. — Vol. 72, I. 3. — P. 303 307.
  107. Lee M. S. Oilseed isocitrate lyases lacking their essential type 1 peroxisomal targeting signal are piggybacked to glyoxysomes / M. S. Lee, R. T. Mullen, R. N. Trelease // Plant Cell. — 1997. — Vol. 9. — P. 185−197.
  108. Li J. Differential expression of isocitrate lyase in P. marneffei phagocytized by nonstimulated and stimulated murine macrophages / J. Li et. al. // Chinese. — 2007. — Vol. 27, No. 5. — P. 631−634.
  109. Lin S. F. Purification, Identification, and Characterization of Peanut Isocitrate Lyase / S. F. Lin, P. L. Ong, C. R. Jhou et. al. // J Agric Food. Chem. —2008. — Vol. 26. — P. 1845−1851.
  110. Lingard M.J. Peroxisome-associated matrix protein degradation in Arabidopsis / M. J. Lingard, M. Monroe-Augustus, B. Bartel // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2009. — Vol. 106, No. 11. — P. 45 614 566.
  111. Liu F., Thatcher J. D., Epstein H. F. // Biochemistry. — 1997. — V. 36, No. 1. — P. 255−260.
  112. Liu S. Crystal structures of 2-methylisocitrate lyase in complex with product and with isocitrate inhibitor provide insight into lyase substrate specificity, catalysis and evolution / S. Liu et. al. // Biochemistry. — 2005. — Vol.44. — P. 2949−2962.
  113. Lopez M. Enzyme activity and dynamics in near-anhydrous conditions / M. Lopez, V. Kurkal-Siebert, R. Dunn //. Nature proceedings. — 2009. — hdl: 10 101/npre.2009.3884.1.
  114. Lopez-Boado Y. S. Purification of isocitrate lyase from Saccharomyces cerevisiae / Y. S. Lopez-Boado, P. Herrero, M. Fernandez et. al. // Yeast. — 1988. — Vol. 4, Issue 1. — P. 41−46.
  115. Lowry O. H. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O. H. Lowry, N. J. Rosenbourgh, A. L. Farr, R. J. Randall // J. Biol. Chem. — 1951.—V. 194. —P. 265−275.
  116. Luttik A. H. The Saccharomyces cerevisiae ICL2 Gene Encodes a Mitochondrial 2-Methylisocitrate Lyase Involved in Propionyl-Co-A Metabolism / A. H. Luttik et. al. // Journal of Bacteriology. — 2000. — Vol. 182, No. 5. —P. 7007−7013
  117. MacKintosh C. Purification and regulatory properties of isocitrate lyase from Escherichia coli ML308 / C. MacKintosh, H. G. Nimmo // Biochem J. — 1988. — Vol. 250. —P. 25−31.
  118. Maharjan R. P. The role of isocitrate lyase and the glyoxylate cycle in Escherichia coli growing under glucose limitation / R. P. Maharjan et. al. // Res Microbiol. — 2005. — Vol.156, No. 2. — P. 178−183.
  119. Malhotra 0. P. Isolation and characterization of isocitrate lyase of castor endosperm / O. P. Malhotra, P. K. Srivastava // Arch Biochem Biophys. — 1982.—Vol. 214, No. 1. —P. 164−171.
  120. Mano S. Plant peroxisomes / S. Mano, N. Nishimura // Vitam Horm. — 2005. —Vol. 72. —P. 111−154.
  121. Masaaki U. Properties of isocitrate lyase from an alkane-utilizable yeast, Candida tropicalis I / U. Masaaki, M. Ueda, T. Matsuki et. al. // Agr. And Biol. Chem.— 1986.— Vol. 50, No. 1.—P. 127−134.
  122. Mateos R. M. Peroxisomes from pepper fruits (Capsicum annuum L.): purification, characterisation and antioxidant activity / R. M. Mateos // J Plant Physiol.—2003.—Vol. 160,1. 12. —P. 1507−1516.
  123. Masayoshi M. Isolation, Hyperexpression, and Sequencing of the ace A Gene Encoding Isocitrate Lyase in Escherichia coli / M. Masayoshi // J. of Bacteriology. — 1988. — Vol. 170,1. 10. — P. 4528−4536.
  124. McFadden B. A. Itaconate, an Isocitrate Lyase-Directed Inhibitor in Pseudomonas indigofera / B. A. McFadden // J Bacteriol. — 1977. —Vol. 131, No. 1.—P. 136−144.
  125. McKinney J. D. Persistanse of Mycobacterium tuberculosis in macrophages and mice requires the glyoxylate shunt enzyme isocitrate lyase / J. D. McKinney, Z. U. Honer, K. Bentrup // Nature. — 2000. — Vol. 406. — P. 735 738.
  126. Mullen R. T. Isocitrate lyase from germinated loblolly pine megagametophytes: enzyme purification and immunocharacterization / R. T. Mullen, D. J.
  127. Gifford // Plant Physiol, and Biochem. — 1995. — Vol. 33, No. 1. — P. 87−95.
  128. Munir E. New role for glyoxylate cycle enzymes in wood-rotting basidiomycetes in relation to biosynthesis of oxalic acid / E. Munir, J. Yoon, T. Tokimatsu et. al. // Journal of Wood Science. — 2001. — Vol. 47, No. 5. — P. 368−373.
  129. Munoz-Elias E. J. M. tuberculosis isocitrate lyases 1 and 2 are jointly required for in vivo growth and virulence / E. J. Munoz-Elias, J. D. McKinney // Nature Medicine. — 2005. — Vol. 11. — P. 638−644.
  130. Nguyen A. T. Metal-catalyzed oxidation induces carbonylation of peroxisomal proteins and loss of enzymatic activities / A. T. Nguyen, R. P. Donaldson // Arch Biochem Biophys. — 2005. — Vol.439, No.l. — P. 25−31.
  131. Nishimura M. Leaf peroxisomes are directly transformed to glyoxysomes during senescence of pumpkin cotyledons / M. Nishimura, Y. Takeuchi, L. De Bellis, I. Hara-Nishimura // PROTOPLASMA. — 1993. — Vol. 175, No. 3−4,—P. 131−137.
  132. Nyathi Y. Plant peroxisomes as a source of signalling molecules / Y. Nyathi, A. Baker//Biochim Biophys Acta. — 2006. — Vol. 1763,1. 12. —P. 1478−1495.
  133. Okay ama H. High-efficiency cloning of full-length cDNA- construction and screening of cDNA expression libraries for mammalian cells / H. Okayama // Methods Enzymol. — 1987. — Vol. 154. — P. 3−28.
  134. Olsen L. J. Targeting of Glyoxysomal Proteins to Peroxisomes in Leaves and
  135. Roots of a Higher Plant / L. J. Olsen, W. F. Ettinger, B. Damsz et. al. // Plant Cell. — 1993. — Vol. 5,1. 8. — P. 941−952.
  136. Ono K. Purification and Characterization of Isocitrate Lyase from Ethanol-grown Euglena gracilis / K. Ono, M. Okihashi, H. Inui // Journal of Eukaryotic Microbiology. — 1994. — Vol. 41,1. 6. — P. 536−539.
  137. Ono K. Presence of glyoxylate cycle enzymes in the mitochondria of Euglena gracilis / K. Ono, M. Kondo, T. Osafune // Journal of Eukaryotic Microbiology. —2003. — Vol. 50,1. 2. — P. 92−96.
  138. Onyeocha I. Targeting of castor bean glyoxysomal isocitrate lyase to tobacco leaf peroxisomes / I. Onyeocha, R. Behari, D. Hill, A. Baker // Plant Mol Biol. — 1993. — Vol. 22. — P. 385−396.
  139. Palma J. M. Proteome of plant peroxisomes: new perspectives on the role of these organelles in cell biology / J. M. Palma, F. J. Corpas, L. A. del Rio // Proteomics. — 2009. — Vol. 9. — P. 2301−2312.
  140. Phue J. N. Transcription levels of key metabolic genes are the cause for different glucose utilization pathways in E. coli B (BL21) and E. coli K (JM109) / J. N. Phue, J. Shiloach // J. Biotechnol. — 2004. — Vol. 109, No. 2. —P. 21−30.
  141. Piekarska K. The activity of the glyoxylate cycle in peroxisomes of Candida albicans depends on a functional (3-oxidation pathway: evidence for reduced metabolite transport across the peroxisomal membrane / K. Piekarska, G.
  142. Hardy, E. Mol et. al. // Microbiology. — 2008. — Vol. 154. — P. 30 613 072.
  143. Pinzauti G. Isocitrate lyase of conifers {Pinus pined) / G. Pinzauti, E. Giachetti, P. Vanni // Int. J. Biochem. — 1982. — Vol.14, No. 4. — P. 267−275.
  144. Piques M. Ribosome and transcript copy numbers, polysome occupancy and enzyme dynamics in Arabidopsis / M. Piques, W. X. Schulze, M. Hohne et. al. // Mol Syst Biol. — 2009. — Vol. 5, No. 314.
  145. Pistelli L. Effect of Leaf Senescence on Glyoxylate Cycle Enzyme activities / L. Pistelli, P. Perata, A. Alpi // Australian Journal of Plant Physiology. — 1992. — Vol. 19, tto. 6. — P. 723−729.
  146. Pistelli L. Evidences of glyoxylate cycle in peroxisomes of senescent cotyledons / L. Pistelli // Plant Sci. — 1995. — Vol. 109, No. 1. — P. 13−21.
  147. Polanowski A. J. Soybean isocitrate lyase: Purification, immunoassay and N-terminal sequence / A. J. Polanowski, R. L. Obendorf // Plant Physiol. Biochem. — 1991. — Vol. 29. — P. 119−129.
  148. Popov V.N. Induction of glyoxylate cycle enzymes in rat liver upon food starvation / V. N. Popov, A. U. Igamberdiev, C. Schnarrenberger et. al. // FEBS Lett. — 1996. — Vol. 390. — P. 258−260.
  149. Popov V.N. Glyoxylate cycle enzymes are present in liver peroxisomes of alloxan-treated rats / V. N. Popov, S. V. Volvenkin, A. T. Eprintsev // FEBS Lett. — 1998. — Vol. 440. — P. 55−58.
  150. Pracharoenwattana I. When is a peroxisome not a peroxisome? / I. Pracharoenwattana, S. M. Smith // Trends Plant Sci. — 2008. — Vol. 13. — P. 522−525.
  151. Ranaldi F. Multisite Inhibition of Pinns pinea Isocitrate Lyase by Phosphate / F. Ranaldi, P. Vanni, E. Giachetti // Plant Physiol. — 2000. — Vol. 124. — P. 1131−1138.
  152. Ranaldi F. Enzyme catalysis in microgravity: steady-state kinetic analysis of the isocitrate lyase reaction, F. Ranaldi, P. Vanni, E. Giachetti // Biophys
  153. Chem. —2003.— Vol. 103.— P. 169−177.
  154. Reeves H. C. Determination of isocitrate lyase activity in poly aery lamide gels / H. C. Reeves, M. J. Volk // Anal. Biochem. — 1972. — Vol. 48, No. 2. — P. 437−441.
  155. Regev-Rudzki N. Yeast Aconitase in Two Locations and Two Metabolic Pathways: Seeing Small Amounts Is Believing / N. Regev-Rudzki, S. Karniely, N. N. Ben-Haim et. al. // MBoC in Press. — 2005. — Vol. 16, I. 9. — P. 4163−4171.
  156. Rehman A. Cysteine 195 has a critical functional role in catalysis by isocitrate lyase from Escherichia coli / A. Rehman, B. A. McFadden // Curr. Microbiol. — 1997. — Vol. 35. — P. 267−269
  157. Reiss U. Isocitrate lyase from the free-living nematode, Turbatrix aceti.
  158. Purification and properties / U. Reiss, M. Rothstein // Biochemistry. —1974. — Vol. 13. —P. 1796−1800.
  159. Reynolds S. J. Regulation of expression of the cucumber isocitrate lyase gene in cotyledons upon seed germination and by sucrose / S. J. Reynolds, S. M. Smith // Plant Molecular Biology. — 1995. — Vol. 29, No. 5. — P. 885−896.
  160. Rickie B. T. Ontogeny of cotton seeds: gametogenesis, embryogenesis, germination, and seedling growth / B. T. Rickie, K. D. Chapman // Physiology of cotton. — 2010. — P. 332−341.
  161. Robertson E. F. Purification and characterization of isocitrate lyase from Escherichia coli / E. F. Robertson, H. C. Reeves // Current microbiology. — 1986. —Vol. 14, No. 6. — P. 347−350.
  162. Rua J. Isocitrate lyase from Phycomyces blakesleeanus. The role of Mg2+ ions, kinetics and evidence for two classes of modifiable thiol groups / J. Rua, D. de
  163. , F. Busto et. al. // Biochem J. — 1990. — Vol. 272. — P. 359−367.
  164. Rubin H. Subcellular localization of glyoxylate cycle enzymes in Suum ascaris larvae / H. Rubin, R. N. Trelease // J Cell Biol. — 1976. — Vol. 70. — P. 374−383.
  165. Ruchti M. Isocitrate Lyase from Germinating Soybean Cotyledons: Purification and Characterization / M. Ruchti, F. Widmer // Journal of Experimental Botany. — 1986. — Vol. 37, No. 1. — P. 1685−1690.
  166. Sariaslani F. S. Control of Isocitrate Lyase in Nocardia salmonicolor / F. S. Sariaslani, A. W. Westwood, I. J. Higgins // Journal of General Microbiology. — 2001. — Vol. 91. — P. 315−324.
  167. Schnarrenberger C. Development of microbodies in sunflower cotyledons and castor bean endosperm during germination / C. Schnarrenberger, A. Oeser, N.E. Tolbert // Plant Physiol. — 1971. — Vol. 48, No. 5. — P. 566−574.
  168. Schobel F. Aspergillus fumigatus Does Not Require Fatty Acid Metabolism via Isocitrate Lyase for Development of Invasive Aspergillosis Felicitas / F. Schobel, O. Ibrahim-Granet, R Ave // Infection and Immunity. — 2007. — Vol. 75, No. 3.—P. 1237−1244.
  169. Sharma V. Structure of isocitrate lyase, a persistence factor of Mycobacterium tuberculosis / V. Sharma, H. Bentrup, J. D. McKinney et. al. // Nat. Struct. Biol. — 2000. — Vol.7. — P. 663−668.
  170. Shevchenko A. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained Polyacrylamide / A. Shevchenko, H. Wilm, O. Vorm // Anal. Chem. — 1996. —Vol. 68.—P. 850−858.
  171. Shi L. Hydrogen peroxide biosensor based on direct electrochemistry of soybean peroxidase immobilized on single-walled carbon nanohorn modified electrode / L. Shi, X. Liu, W. Niu, H. Li et. al. // Biosens Bioelectron. — 2009. —Vol. 24, —P. 1159−1163.
  172. Shiio I. Isocitrate lyase from Pseudomonas indigoferal. Preparation, amino acid composition and molecular weight / I. Shiio, T. Shiio, B. A. McFadden // Biochim. Biophys. Acta. — 1965. — Vol. 96,1. 1. — P. 114−122.
  173. Siddiqui A. A. Cloning and expression of isocitrate lyase from human round worm Strongyloides stercoralis / A. A. Siddiqui, C. S. Stanley, S. L. Berk // Parasite. — 2000. — Vol. 7. — P. 233−236.
  174. Simanshu D. K. Crystal structure of Salmonella typhimurium 2-methylisocitrate lyase (PrpB) and its complex with pyruvate and Mg2+ / D. K. Simanshu et. al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2003. —Vol. 311.— P. 193−201.
  175. Singh V. K. Kinetic modeling of tricarboxylic acid cycle and glyoxylate bypassin Mycobacterium tuberculosis, and its application to assessment of drug targets / V. K. Singh, I. Ghosh // Theor Biol Med Model. — 2006.
  176. Sjogren R. E. Evidence for Multiple Forms of Isocitrate Lyase in Neurospora crassa / R. E. Sjogren, A. H. Romano // J Bacteriol. — 1967. —¦ Vol. 93. — R 1638−1643.
  177. Song S. Can the glyoxylate pathway contributes to fat-indused hepatic insulin resistance? / S. Song // Med. Hypotheses. — 2000. — Vol. 54. — P. 739−747.
  178. Stabenau H. Glycolate metabolism in green algae / H. Stabenau, U. Winkler // Physiologia Plantarum. — 2005. — Vol. 123,1. 3. — P. 235−245.
  179. Surendranathan K. K. Properties of an Mg2-independent isocitrate lyase from gamma irradiated preclimacteric banana {Musa cavendishii) / K. K. Surendranathan, P. M. Nair // Proc. Indian Acad. Sci. — 1978. — Vol. 87, Ser. B, No. 4.— P. 119−126.
  180. Taylor K. M. Localization and targeting of isocitrate lyases in Saccharomyces cerevisiae / K. M. Taylor, C. P. Kaplan, X. Gao // Biochem J. — 1996. — Vol. 319.—P. 255−262.
  181. Theologis A. Sequence and analysis of chromosome 1 of the plant Arabidopsis thaliana / A. Theologis et. al. //Nature. — 2000. — Vol. 408. — P. 816−820.
  182. Turley R. B. Characterization of a cDNA clone encoding the complete amino acid sequence of cotton isocitrate lyase / R. B. Turley, S. M. Choe, R. N.
  183. Trelease // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) — Gene Structure and Expression. — 1990. —Vol. 1049,-1. 2. —P. 223−226.
  184. Tzachi B. Kinetic Outlier Detection (KOD) in real-time PCR / / B. Tzachi // Nucleic Acids Research. — 2003. —Vol. 31. —P. 105−109. .
  185. Uhrigshardt H. Evidence for an operative glyoxylate cycle in the thermoacidophilic crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius / H. Uhrigshardt et. al. // FEBS Lett. — 2002. — Vol. 513. — P. 223−229.
  186. Van den Bosch H. Biochemistry of peroxisomes / H. Van den Bosch // Annual Review of Biochemistry. — 1992. — Vol. 61. — P. 157−197.
  187. Vanni P. Studies on isocitrate lyase isolated from Lupinus colyledons / P. Vanni, M. T. Vincenzini, F. M. Nerozz et. al. // Can. J. Biochem. — 1979. — Vol.57, No. 9. —P. 1131−1137.
  188. Vincenzin M. T. Isolation and properties of isocitrate lyase from Lupinus seed/ M. T. Vincenzini, F. Nerozzi, F. F. Vincieri // Phytochemistry. — 1980. — Vol. 19,1. 5, — 1980, P. 769−774.
  189. Volvenkin S. V. Subcellular Localization and Properties of Glyoxylate Cycle Enzymes in the Liver of Rats with Alloxan Diabetes / S. V. Volvenkin, V. N. Popov, A. T. Eprintsev // Biochemistry (Mosc). — 1999. — Vol. 64. — P. 994−999.
  190. Wall D. M. Isocitrate Lyase Activity Is Required for Virulence of the1. tracellular Pathogen Rhodococcits equi / D. M. Wall, P. S. Duffy, C. DuPont // Infect Immun. — 2005. — Vol. 73. — P. 6736−6741.
  191. Watanabe S. Purification and Characterization of a Cold-adapted Isocitrate Lyase and a Malate Synthase from Colwellia maris, a Psychrophilic Bacterium / S. Watanab // Biosci Biotechnol Biochem. — 2001. — Vol. 65. — P. 1095−1103.
  192. Wolfson P. J. Inhibition of Isocitrate Lyase: the Basis for Inhibition of Growth of Two Arthrobacter Species by Pyruvate / P. J. Wolfson, T. A. Krulwich // Journal of bacteriology. — 1972. — P. 356−364.
  193. Zhang J. Z. Isocitrate Lyase and Malate Synthase Genes from Brassica napus L. Are Active in Pollen / J. Z. Zhang, D. L. Laudencia-Chingcuanco, L. Comai et. al. // Plant Physiol. — 1994. — Vol. 104,1. 3. — P. 857−864.
  194. Zhang J. Z. DNA sequences that activate isocitrate lyase gene expression during late embryogenesis and during postgerminative growth / J. Z. Zhang, C. M. Santes, M. L. Engel et. al. // Plant Physiol. — 1996. — Vol. 110,1. 4. — P. 1069−1079.
Заполнить форму текущей работой

Сессия? Спокойно!