1.1 Актуальность исследования Современные представления о молекулярно-биологических механизмах обучения и памяти основаны на положении о кратковременной и долговременной формах хранения информации в мозге. В основе этой теории лежит открытие Г. Мюллера и А. Пильзекера, обнаруживщих в 1900 г., что переход из кратковременной и легко нарушаемой памяти в долговременную устойчивую память происходит у человека в течение первого часа после получения им новой информации. Они назвали этот процесс консолидацией памяти (Muller, Pilzecker, 1900). Однако существующие в настоящее время критерии для определения принадлежности «временному» исследователей, памяти признаку к к кратковременной следует или долговременной По мнению память, по достаточно расплывчаты. одних которая кратковременной относить удерживается от нескольких секунд до нескольких часов, а к долговременной память, которая сохраняется от нескольких часов до нескольких дней, после чего переходит в постоянное хранение. Согласно другим представлениям, кратковременной считают память, которая удерживается в течение нескольких секунд, долговременной память, которая сохраняется от нескольких секунд до нескольких лет (Александров, 2000). Основным шагом в понимании биологических механизмов консолидации памяти стало открытие 1960;х гг., показавшее, что переход памяти из кратковременной в долговременную форму требует синтеза новых молекул РНК и белка, т. е. экспрессии генов (Davis, Squire, 1984). Современные представления о молекулярных механизмах формирования долговременной памяти основаны на концепции о зависящей от синтеза белка консолидации памяти, согласно которой приобретение нового опыта сопровождается индукцией синтеза белка в мозге, в том числе экспрессией так называемых «ранних генов» (Анохин, 1997; Clayton, 2000; Guzowski, 2002). Результатом этого процесса является экспрессия широкого спектра новых белков и последующие структурные изменения определенных синаптических контактов между клетками (Rose, 1995; Анохин, 1997; Kandel, Pittenger, 1999; Isquierdo et al., 2006). Однако в отличие от механизмов формирования долговременной памяти, которые считаются к настоящему времени во многом раскрытыми, механизмы длительного поддержания долговременной памяти все еще остаются неясными 6 (Kandel, Pittenger, 1999). В частности, остается неясным, каким образом в нервных клетках в течение длительного времени сохраняется информация о произошедщих при обучении синаптических перестройках, тогда как это время может во много раз превышать время жизни отдельных белковых молекул. Экспериментальные данные последних лет предполагают, что одним из возможных молекулярных механизмов сохранения вызванных обучением долговременных изменений в нервных клетках может быть реорганизация хроматина и изменение статуса метилирования генов (Weaver et al., 2004; Levenson et al., 2004; Miller, Sweatt, 2007). В то же время, имеются данные, свидетельствующие о том, что механизмы длительного хранения памяти могут вовлекать синтез ДНК. Так, рядом авторов было показано, что обучение может индуцировать в мозге синтез ДНК (Reinis, 1972; Ашапкин и др. 1981, 1983; Giuditta et al, 1986а). Кроме того, в экспериментах с нарушениями памяти ингибиторами синтеза белка и ДНК были получены данные, которые не находят объяснения в теории консолидации памяти. Во-первых, было показано, что память, которая была нарушена блокадой синтеза белка при обучении, может восстанавливаться спонтанно, либо под действием процедуры напоминания или физиологически активных веществ (Quartermain 1970; Squire, Barondes, 1972; Quartermain, Botwinik, 1975; Радюшкин, Анохин, 1997). Во-вторых, было продемонстрировано амнестическое действие ингибиторов синтеза ДНК и антиметаболитов при их введении животным в период около обучения (Reinis, 1972; Анохин с соавт., 1988; Wang et al., 2003). В совокупности, эти данные позволяют предположить, что в мозге могут существовать дополнительные механизмы формирования и поддержания долговременной памяти, вовлекающие синтез ДНК. Для проверки гипотезы о механизмах памяти, требующих синтеза ДНК, необходимы экспериментальные свидетельства того, что (1) консолидация памяти сопровождается синтезом ДНК в мозге и (2) обнаруженный синтез ДНК критически необходим для формирования или поддержания долговременной памяти. Также принципиальным является вопрос о том, насколько универсален такой механизм, т. е. в какой степени он участвует в формировании/поддержании различных видов памяти. Известные к настоящему времени данные о синтезе ДНК при обучении достаточно противоречивы авторами и не дают ДНК основания для заключения, необходим что для обнаруженный синтез действительно формирования памяти (Reinis et al., 1972; Guiditta et al., 1986b). Кроме того, в этих 7 работах преимущественно использовали количественный анализ радиоактивного мечения синтезированной ДНК в гомогенатах мозга недостаточно точный метод, использование которого не позволяет выявить конкретные структуры мозга и клетки, в которых обучение может вызвать синтез ДНК. В то же время, результаты исследований амнезий, вызванных блокадой синтеза ДНК в определенных моделях обучения, не дают ответа на вопрос, действительно ли данный вид обучения, чувствительный к действию ингибиторов синтеза ДНК, индуцирует в мозге синтез ДНК (Анохин с соавт., 1988; Wang et al., 2003). Также остается неясным, насколько чувствительны другие виды памяти (при обучении в других моделях) к действию ингибиторов синтеза ДНК. Настоящая работа объединяет эти два прежде разрозненных направления исследование нарушений памяти, вызванных блокадой синтеза ДНК, и изучение индукции синтеза ДНК в мозге обучением. Это стало возможным благодаря методу иммуногистохимического мечения на срезах мозга клеток, ДНК которых содержит нуклеотидный аналог 5-бромо-2-дезоксиуридин (BrdU). BrdU и близкий ему по структуре и функциям 5-йодо-2-дезоксиуридин (IdU) являются аналогами тимина и могут встраиваться в ДНК в процессе удлинения её цепи. При этом они изменяют свойства новой ДНК таким образом, что нарушаются её основные функции репликация, транскрипция и связывание с белками (Morris, Cramer, 1968; Goz, 1978). BrdU и IdU влияют на функции только той ДНК, которая синтезируется в их присутствии. Поэтому, с одной стороны, введение IdU или BrdU в период около обучения позволяет детектировать именно ту ДНК, которая синтезируется при обучении, с другой стороны, последующее тестирование сохранности памяти дает возможность оценить, насколько необходима новосинтезированная ДНК для формирования/поддержания долговременной памяти. Для доказательства того, что амнестистические эффекты ДНК, IdU и BrdU обусловлены синтеза ДНК влиянием на новосинтезированную амнестическими они были подтверждены аналогичными (З-амино-З1- эффектами ингибиторов дезокситимидина и З-азидо-З-дезокситимидина). Механизмы действия IdU на ДНК изучены более детально (Morris, меньшие дозы Cramer, 1966, 1968), кроме того, в памяти были необходимы 5-бромо-2-дезоксиуридина чем предшествующих исследованиях для нарушения 5-йодо-2-дезоксиуридина, (Анохин, неопубликованные данныеReinis, 1972), в связи с этим в исследованиях амнезии преимущественно использовали IdU. Основные амнестические эффекты 8 IdU были подтверждены для 5-бромо-2-дезоксиуридина, который использовали преимущественно для мечения синтезирующих ДНК клеток. Таким образом, использованный в настоящей работе подход позволяет одновременно оценить уровень синтеза ДНК в мозге при обучении и определить, насколько необходим синтез данной ДНК для формирования памяти. Исследование проводили на новорожденных цыплятах домашней курицы (Gallus gallus). В настоящее время цыплята широко используются для изучения механизмов консолидации и реорганизации памяти (Rose, 2000; Matsushima, 2003). Будучи зрелорождающимися животными, уже через несколько часов после вылупления цыплята готовы активно исследовать окружающую среду. В связи этим у новорожденных цыплят возможен широкий спектр различных видов обучения, таких как импринтинг, зрительная дискриминация пищевых объектов, пространственное обучение и пр. (Rose, 2000; Matsushima, 2003). Отсутствие у новорожденных цыплят индивидуального опыта позволяет предположить, что обучение в первые дни жизни должно вызывать в их мозге значительные пластические перестройки (Rose, 2000). Модели пассивного избегания и импринтинга в настоящее время активно используются для исследования механизмов долговременной пластичности (Rose, 2000; Horn, 2004). Системные и молекулярные механизмы зрительного импринтинга были детально исследованы в работах Хорна с соавторами (Хорн, 1988; Horn, 2004). Известные к настоящему моменту процессы, лежащие в основе молекулярных механизмов консолидации памяти, были подробно изучены на модели пассивного избегания у цыплят Роузом с соавторами (Rose, 2000) и другими исследователями (Andrew, 1991). Таким образом, одним из преимуществ использования новорожденных цыплят в исследованиях механизмов памяти является большое количество известных экспериментальных фактов о системных и молекулярных механизмах памяти у этих животных. Другим преимуществом использования цыплят в настоящей работе является то, что в первые дни жизни череп цыплят не оссифицирован, и это позволяет вводить им необходимые препараты непосредственно в мозг без имплантации канюль, анестезии и пр. Кроме того, незамкнутость гематоэнцефалического барьера у цыплят способствует быстрому проникновению в мозг препаратов, вводимых внутрибрюшинно (Rose, 2000). В работе использовали четыре принципиально различные модели обучения цыплят импринтинг, пространственное обучение в лабиринте, вкусовую аверсию 9 на бусину и пассивное избегание. В основе импринтинга, вкусовой аверсии и пассивного избегания лежит реализация врожденных предрасположенностей цыплят: в случае импринтинга это формирование реакции следования за матерью, в случае пассивного избегания и вкусовой аверсии используется врожденная склонность клевать небольшие яркие объекты. Эти виды обучения относятся к категории раннего обучения и возможны только в критический период первые 1−3 дня после рождения (Bolhuis, 1991; Barber et al., 1998; Rose 2000). В этом возрасте у цыплят наблюдается активный синтез ДНК в паренхиме конечного мозга, чувствительный к действию внешних факторов, в том числе обучения импринтингу и пассивному избеганию (Dermon et al., 2003, Nikolakopoulou et al., 2006; Комиссарова, Анохин, 2007). Как было показано ранее, оба вида обучения вызывают повышение числа содержащих BrdU клеток в различных структурах мозга цыплят уже через 24 ч после обучения. Вкусовая аверсия может быть выработана у цыплят на различные виды пищи (цветная бусинка, зерно, окрашенная вода и пр.) в разном возрасте (Gaston, 1977; Martin, Bellingham, 1979; Barber et al., 1998). В настоящей работе для выработки вкусовой аверсии у новорожденных цыплят использовали цветную бусину. Этот тип вкусовой аверсии также в определенной степени является «ранним» обучением, поскольку отсутствие неофобии и склонность клевать незнакомые объекты проявляется только у новорожденных цыплят. Вкусовая аверсия у цыплят исследована в меньшей степени, чем пассивное избегание и импринтинг, однако было показано, что у млекопитающих формирование памяти в этой модели может быть нарушено введением антиметаболита Ara-C (Wang et al., 2003). В отличие от других трех моделей обучения, пространственное обучение в лабиринте не относится к категории раннего обучения и возможно, начиная с 3−4 дня после рождения (Jakupi, Rickard, 2004). Таким образом, использование широкого спектра моделей обучения для исследования амнестических эффектов IdU, BrdU и ингибиторов синтеза ДНК позволяет определить, насколько универсален описанный ранее феномен нарушения памяти этими препаратами, и, следовательно, насколько универсален может быть ДНК-зависимый механизм формирования и поддержания долговременной памяти. 10.
6. выводы.
1. Установлено, что из четырех исследованных моделей обучения цыплят (импринтинг, пассивное избегание, вкусовая аверсия, обучение в лабиринте) введение нуклеотидного аналога 5'-йодо-2'-дезоксиуридина приводит к развитию амнезии только в модели вкусовой аверсии. Эти данные указывают на отличие механизмов консолидации памяти при вкусовой аверсии от механизмов формирования памяти в других моделях обучения. Показано, что вызванная 1сШ амнезия развивается более, чем через 6 ч после обучения, при этом память доступна для нарушения 1сШ в течение менее, чем 2 ч после обучения.
2. Показано, что при обучении цыплят в модели вкусовой аверсии амнестическим действием обладает внутрибрюшинное введение аналога 1сШ — 5'-бромо-2'-дезоксиуридина и субстратных ингибиторов синтеза ДНК З'-амино-З'-дезокситимидина и З'-азидо-З'-дезокситимидина, а также внутримозговое введение З'-азидо-З'-дезокситимидина. Эти данные указывают на необходимость синтеза ДНК для поддержания памяти при вкусовой аверсии, а также косвенно подтверждают, что амнестическое действие 5'-йодо-2'-дезоксиуридина связано с его включением в ДНК.
3. Установлено, что среди исследованных структур мозга цыпленка имеются области (промежуточный медиальный мезопаллиум — 1ММ), где обучение вкусовой аверсии индуцирует синтез ДНК, который может быть выявлен путем иммуногистохимического мечения ВгсШ через 2 ч после обучения. Через 24 ч после обучения повышенное включение ВгсШ, обнаруженное через 2 ч после обучения в промежуточном медиальном мезопаллиуме, нивелируется повышением включения ВгсШ у контрольных животных.
4. Показано, что в мозге цыплят имеются также структуры, где через 24 ч после обучения наблюдается снижение уровня включения ВгсШ — дорсальный гиперпаллиум и апикальный гиперпаллиум.
5. Полученные данные позволяют предположить, что для формирования долговременной памяти в модели вкусовой аверсии у цыплят требуется синтез ДНК непосредственно после обучения. Этот синтез, по-видимому, протекает в промежуточном медиальном мезопаллиуме — области мозга, критически необходимой для этого вида памяти.
5.5.
Заключение
.
В настоящей работе на модели обучения цыплят вкусовой аверсии впервые была продемонстрирована индукция включения BrdU клетками промежуточного медиального мезопаллиума при обучении, которая, очевидно, обусловлена синтезом ДНК в этих клетках при обучении. Также было показано, что обнаруженный синтез ДНК критически необходим для поддержания долговременной памяти при вусовой аверсии, поскольку введение животным веществ, нарушающих синтез или транскрипцию/репликацию той ДНК, которая была детектирована при обучении, приводило к развитию амнезии.
Амнестические эффекты «антиметаболитов» и ингибиторов синтеза ДНК были обнаружены только для модели вкусовой аверсии. Эти данные указывают на возможное принципиальное различие молекулярных механизмов формирования и хранения долговременной памяти при вкусовой аверсии от других исследованных моделей (импринтинг, пассивное избегание, обучение в лабиринте). Эта гипотеза также подтверждается отсутствием индукции синтеза ДНК при обучении в модели импринтинга.
В совокупности, амнестические эффекты 5'-йодо-2'-дезоксиуридина, 5'-бромо-2'-дезоксиуридина, З'-амино-З'-дезокситимидина и З'-азидо-З'-дезокситимидина предполагают, что для формирования памяти при вкусовой аверсии необходим синтез ДНК, который может представлять собой обратную транскрипцию определенных молекул РНК, кроме того, критической для поддержания памяти является транскрипция данной ДНК или её репликация.
В то же время, избирательная зависимость памяти в модели вкусовой аверсии от синтеза ДНК предполагает, что этот феномен не может лежать в основе универсального механизма формирования и хранения различных видов долговременной памяти.
