Выявление и типирование возбудителей сальмонеллеза молекулярно-генетическими методами

Сальмонеллез (Salmonellosis) — полиэтиологическая инфекционная болезнь с фекально-оральным механизмом передачи, вызываемая бактериями рода Salmonella семейства Enterobacteriaceae, характеризуется разнообразными клиническими проявлениями от бессимптомного носительства до тяжелых септических форм.

При остром течении болезнь у животных проявляется поражением желудочно-кишечного тракта и септицемией, а при подостром и хроническом течении — в виде пневмоний и артритов. У овец, кобыл и реже у коров сальмонеллез сопровождается абортами. У птиц, по мнению Gast (1997), можно выделить три клинические формы сальмонеллеза — пуллороз, тифоидная лихорадка домашней птицы и паратифоидная инфекция.

Источниками возбудителя служат больные и переболевшие животные бактерионосители, включая грызунов и диких птиц. Фактором передачи возбудителя инфекции являются инфицированные корма, вода и предметы ухода за животными. У птиц возможна трансовариальная передача сальмонелл.

Сальмонеллез наносит значительный ущерб животноводству, который складывается из падежа значительной части заболевшего молодняка, отставания в росте и развитии переболевших животных, абортов и расходов, связанных с организацией профилактических и лечебных мероприятий. (Ахмедов A.M., 1983).

У человека сальмонеллез проявляется в виде пищевых токсикоинфекций. Наиболее важным резервуаром сальмонелл, представляющим опасность для инфицирования людей, является домашняя птица.

Во многих европейских странах уровень заболеваемости людей за последние два десятилетия значительно возрос (Oboegbulem, S.I., Collier P.W., Sharp J.C.M., 1993, Информационный бюллетень CDC 2003,.

Информационный бюллетень ЦГСЭН г. Москвы, 2000 г.). Согласно данным Центра контроля и профилактики заболеваний США сальмонеллез ежегодно поражает от 1 до 5 млн. человек, из которых 20 тысяч госпитализируются, а около 500 погибает (Информационный бюллетень CDC, 2002 г.).

В России диагноз устанавливают на основании комплекса клинических, патологоанатомических, эпизоотологических данных и результатов лабораторной диагностики. Широко используемый бактериологический метод выявления сальмонелл путем посева исследуемого материала на среду Эндо или посева через среду накопления с последующей идентификацией в реакциях агглютинации с родовыми и групповыми агглютинирующими сыворотками характеризуется значительной продолжительностью исследования, большой трудоемкостью и высокой себестоимостью. Проведение стандартной процедуры бактериологической идентификации микроорганизмов рода Salmonella занимает 3−4 дня.

Рост заболеваемости сальмонеллезом животных и людей обусловливает необходимость разработки современных высокочувствительных и специфичных методов экспресс диагностики болезни, выявления бактерионосителей, мониторинга кормов для животных, а также первичного животного продукта, полуфабрикатов и готового продукта животного происхождения.

Всем вышеперечисленным требованиям наиболее полно отвечает метод выявления ДНК возбудителя, основанный на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР), который использован в данной работе.

Снижению заболеваемости сальмонеллезом способствует профилактическое использование для вакцинации животных качественных вакцинных препаратов. В связи с этим важной задачей является контроль средств специфической профилактики, применяемых на территории России. Многие из живых вакцинных препаратов изготавливаются из штаммов, являющихся аттенуированными спонтанными мутантами, которые не имеют генетической характеристики. Таким образом, проведение генетического исследования аттенуированных вакцинных штаммов с выявлением их генетических особенностей и создание паспортов вакцинных штаммов является актуальной задачей, решение которой позволит усовершенствовать и стандартизировать контроль над средствами специфической профилактики сальмонеллеза.

Цель и задачи исследования

.

Цель исследований — разработка тест-системы на основе ПЦР для диагностики сальмонеллеза и генотипирование вакцинных штаммов сальмонелл.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

— Разработать диагностический набор на основе ПЦР для выявления ДНК возбудителей сальмонеллеза и определить его аналитические характеристики.

— Выявить генетические различия между штаммами бактерий рода Salmonella, относящимися к разным сероварам.

— Выявить генетические различия между вакцинными и полевыми штаммами бактерий рода Salmonella, относящимися к одному серовару.

— Провести молекулярно-генетическое исследование аттенуированных вакцинных штаммов сальмонелл в сравнительном аспекте с вирулентными штаммами с целью получения их молекулярно-генетической характеристики (молекулярно-генетического паспорта).

Научная новизна исследования.

Выбраны праймеры для амплификации специфичной последовательности генома сальмонелл, на основе которых разработана тест-система, обладающая 100% специфичностью и имеет предел аналитической чувствительности 1*10 гэ/мл образца или 20 гэ в пробе ПЦР.

Впервые установлена возможность типирования вакцинных штаммов сальмонелл молекулярно-генетическими методами. Разработанный подход позволяет типировать вакцинные штаммы сальмонелл на уровне сероваров, а также определять их индивидуальные генетические особенности.

Показано, что мутации в генах, кодирующих РНК-полимеразу и рибосомальные белки, изменяющие их аминокислотную последовательность, являются причиной аттенуации вакцинных штаммов сальмонелл.

Практическое значение работы.

Разработана и внедрена в ветеринарную практику тест-система «CAJI-КОМ» для диагностики сальмонеллеза методом полимеразной цепной реакции. (Сертификат соответствия за № 5 729 201 от 28.01.03).

Впервые в РФ проведено генетическое гипирование штаммов Salmonella на уровне сероваров, а также определены генетические особенности вакцинных штаммов: S. typhimurium 3, S. dublin 6, S. enteritidis 204, S. enteritidis R6 S. gallinarum-pullorum TnlO, S. choleraesuis TS177 и S. abortusovis 125.

Впервые в РФ разработаны идентификационные генетические паспорта вакцинных штаммов сальмонелл S. typhimurium 3, S. dublin 6 и S. abortusovis 125.

Апробация диссертации.

По теме диссертации опубликовано 5 научных статей.

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ВГНКИ (1999;2002 гг.).

Материалы диссертации доложены на Всероссийской научной конференции «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов» (ВГНКИ, г. Москва, 2001 г.), I Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития.» (г. Москва, 2002 г.), IV Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (г. Москва, 2002 г.).

Структура и объем диссертации

.

Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, две главы результатов собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения и приложение. Диссертация иллюстрирована 24 рисунками и 5 таблицами.

Список литературы

содержит 152 источника, в т. ч. 142 зарубежных авторов.

ВЫВОДЫ.

1. Разработанная ПЦР-тест-система для выявления сальмонелл обладает 100% чувствительностью и специфичностью и имеет предел аналитической чувствительности 1*10 гэ/мл образца или 20 гэ в пробе ПЦР.

2. Молекулярно-генетический анализ с помощью модифицированного метода RAPD/RFLP и секвенирования ДНК позволяет дифференцировать вакцинные штаммы сальмонелл на уровне сероваров.

3. Аттенуированные вакцинные штаммы сальмонелл, полученные селекцией на среде с рифампицином в концентрации 100 мкг/мл, имеют мутации в гене троВ, что обусловливает их сниженную вирулентность и резистентность к рифампицину.

4. Аттенуированные вакцинные штаммы сальмонелл, полученные селекцией на среде со стрептомицином в концентрации .500 мкг/мл, имеют мутации в гене rpsL, что обусловливает их сниженную вирулентность и резистентность к стрептомицину.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. Разработана, утверждена и внедрена в практику диагностическая тест-система «САЛ-КОМ» на основе полимеразной цепной реакции (Сертификат соответствия за № 5 729 201, выдан ФГУ ВГНКИ 28.01.2003 г., Регистрационное удостоверение — № Р077−1-4.0−2201 за № ПВР-1−4.0/513, выдано Департаментом ветеринарии Минсельхоз. РФ от 03.09.2002 г.).

2. Результаты проведенных исследований использованы при составлении следующей нормативной документации:

— Наставление по применению тест-системы «САЛ-КОМ» для диагностики сальмонеллеза методом полимеразной цепной реакции за № 13−5-02/0163, утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхоз. РФ от 15.08.2001 г.,.

Заключение

.

В связи с участившимися случаями заболевания сальмонеллезом людей и животных, является актуальным создание тест-систем для скрининга контаминированных сальмонеллами продуктов питания людей и кормов для животных, а также объектов окружающей среды и выявление животныхбактерионосителей. Анализ литературы показывает, что метод Полимеразной цепной реакции (ПЦР) обладает рядом преимуществ по сравнению с традиционным бактериологическим методом выявления сальмонелл, так как сочетает в себе быстроту и простоту исполнения, а также потенциально высокую специфичность и чувствительность при выявлении патогенных микроорганизмов. До ПЦР для выявления ДНК возбудителей использовали ДНК-зондовую детекцию, основанную на гибридизации меченных радиоактивным изотопом или флуоресцентной меткой специфических олигонуклеотидных зондов с образцом выделенной ДНК. Однако ДНКзондовая диагностика имеет существенные ограничения по своей чувствительности, характеризуется трудоемкостью и длительностью: для ее осуществления необходимо выделить интактную ДНК из не менее, чем 10 000 клеток, а сам процесс гибридизации не может быть полностью автоматизирован. В то время, как ПЦР позволяет выявлять единичные микробные клетки. Опубликовано несколько сообщений о применении ПЦР для выявления сальмонелл в продуктах питания и окружающей среде.

Данные ДНК/ДНК гибридизации свидетельствуют о высокой гомологии штаммов внутри рода Salmonella, что объясняет трудности генетического типирования на уровне сероваров. Тем не менее, для типирования сальмонелл можно использовать следующие методы: ПЦРамплификацию со случайными праймерами (RAPD), ПЦР-амплификацию с праймерами, комплементарными повторяющимся (инсерционным) последовательностям IS200 в геноме Salmonella, риботипирование, гель-электрофорез в пульсирующем поле продуктов рестрикции бактериальной геномной ДНК, обработанной редкощепящими эндонуклеазами (ПЭ), AFLP — анализ полиморфизма длин амплифицируемых фрагментов и секвенирование ДНК.

В качестве мишеней для типирования штаммов сальмонелл методом секвенирования могут быть использованы области островков патогенности. Гены, расположенные в этой области (в том числе Inv и Spa), имеются у штаммов всех подвидов S. enterica и показывают структурную и функциональную гомологию с аналогичными последовательностями патогенных штаммов родов Yersinia и Shigella, локализованными в плазмидах. Анализ филогенетических деревьев, построенных на основе последовательностей генов inv и spa, показывает, что эта область хромосомы сальмонелл была приобретена сальмонеллами в результате горизонтального переноса еще до дифференциации на серовары внутри S. enterica, а не в результате последующего переноса между штаммами различных сероваров, поэтому характерные мутации локализованных в них генов можно считать генетическими маркерами сероваров.

Проанализировав публикации, посвященные исследованию факторов патогенности сальмонелл, механизмов возникновения антибиотикорезистентности и снижения вирулентности микроорганизмов, можно сделать предположение, что аттенуация вакцинных штаммов сальмонелл, подвергшихся селекции в среде с высокой концентрацией антибиотиков, может быть обусловлена накоплением мутаций в генах, кодирующих РНК-полимеразу и рибосомальные белки. Поэтому логично выбрать эти области генома для поиска предполагаемых мутаций, являющихся, возможно единственными, индивидуальными генетическими особенностями этих аттенуированных вакцинных штаммов сальмонелл.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Работа выполнена в 1999;2002 гг. в лаборатории молекулярной диагностики Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ФГУ ВГНКИ).

Все использованные в работе олигонуклеотидные праймеры были синтезированы в ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ фосфорамидитным методом на синтезаторе ASM 102 (Новосибирск). ПЦР выполнялась с использованием базовых реагентов производства ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ. 1. Разработка тест-системы для выявления сальмонелл 1.1 Выделение ДНК из различных образцов проводилось методом аффинной сорбции на силикагеле с предшествующим лизированием пробы в гуанидинтиоцианате [Boom R. et al., 1990]:

К 100 мкл исследуемого образца добавляют 300 мкл лизирующего раствора (62% гуанидин тиоцианат, 10 мМ Трис-НС1, 1 мМ ЭДТА, 1% Тритон-Х-100), тщательно перемешивают, прогревают пробирку 7 мин при 65 °C, еще раз тщательно перемешивают. Центрифугируют пробу на настольной центрифуге при 14×10 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость очень аккуратно отбирают отдельными наконечниками с аэрозольным барьером и переносят в новые пробирки. Добавляют 20 мкл суспензии сорбента (40% Si02), хорошо перемешивают содержимое пробирки и оставляют в штативе на 2 мин для осаждения сорбента, еще раз перемешивают и отстаивают 10−12 мин. Осаждают сорбент на настольной о центрифуге при 5×10 об/мин в течение 30 с и отбирают супернатант из каждой пробирки отдельным наконечником. Вносят по 300 мкл отмывочного раствора № 1 (48% гуанидин тиоцианат, 10 мМ Трис-НС1, 1 мМ ЭДТА, 0,1%.

Тритон-Х-100), тщательно ресуспендируют и вновь осаждают в прежнем режиме. Супернатант удаляют. Вносят по 500 мкл отмывочного раствора № 2 (50% этанол, 50 мМ NaCl, 10 мМ Трис-НС1, 1 мМ ЭДТА) ресуспендируют, л осаждают на настольной центрифуге при 10×10 об/мин в течение 30 с и удаляют супернатант. Повторяют процедуру отмывки раствором № 2. Тщательно отбирают супернатант и высушивают осадок сорбента, открыв крышки пробирок в термостате при 65 °C, в течение 10 мин. В пробирки вносят по 50 мкл буфера для элюции ДНК (10 мМ Трис-НС1, 1 мМ ЭДТА), ресуспендируют, помещают в термостат при 65 °G на 5−6 мин, встряхивая через каждую минуту. Осаждают на настольной центрифуге при 14 хЮ об/мин в течение 1 мин. Супернатант, содержащий очищенную ДНК, используют для постановки ПЦР.

1.2 Штаммы микроорганизмов, использованные в работе.

Для оценки аналитической чувствительности разработанной тест-системы использовались следующие штаммы, полученные из коллекции отдела бактерийных препаратов ФГУ ВГНКИ: Salmonella enteritidis S7, Salmonella choleraesuis 370, Salmonella typhimurium 371, Salmonella dublin 373, Salmonella abortusovis 372, Salmonella gallinarum-pullorum «Томилино», Salmonella gallinarum-pullorum TnlO). Штаммы, полученные из коллекции ЦНИИ Эпидемиологии: 5 штаммов Salmonella typhi.

Для оценки аналитической специфичности тест-системы использовались следующие штаммы, полученные из коллекции ФГУ ВГНКИ: Shigella flexneri 851b, Campylobacter fetus subsp. fetus 25 936, Campylobacter jejuni subsp. jejuni 43 435, Klebsiella К 65 SW4, Listeria monocitogenes УСХЧ 19, Listeria monocitogenes УСХЧ 52, Proteus vulgaris 115/98, Pseudomonas aeruginosa ДН cl, Staphilococcus aureus 653, Staphilococcus aureus 29 112, Morganella Morganii 619 с 01, Enterobacter faecalis 356, E. coli Ol, E. coli OIII в концентрации 1*104 — 1*105 микробных клеток/мл, а также материал от здоровых животных и птиц (50 образцов фекалий) и от 100 здоровых людей.

Все использованные в работе суспензии штаммов микроорганизмов хранились при температуре в фосфатном буфере с добавлением криопротектора.

1.3 Клинический материал, использованный в работе.

За 2002 год было проанализировано 170 образцов фекалий голубей, 79 образцов фекалий попугаев, 90 образцов фекалий крыс, 60 образцов фекалий собак, 4 образца фекалий гепардов. Материал от животных был получен из Московского зоопарка, городской Центральной ветеринарной лаборатории, МТКЦ и со станции передержки животных г. Москвы. В работе также использовался клинический материал, собранный от 146 больных людей, находившихся на стационарном лечении в КИБ № 2 г. Москвы в отделении пищевых токсикоинфекций и шигеллезов за период с 01.01.01 по 01.07.02 г. В качестве метода предобработки фекалий использовалось получение бактериальной фракции фекалий путем дифференциального центрифугирования 15−20% суспензии фекалий [Kongmuang U et al., 1994]. Для выделения ДНК использовалось 100 мкл бактериальной фракции.

1.4 Определение предела аналитической чувствительности разработанных методик проводилось с использованием модельного эксперимента с тестированием стандартной панели разведений культур S. enteritidis R6 и S. gallinarum-pullorum ТпЮ в фосфатном буфере и пробах фекалий, не содержащих детектируемых микроорганизмов, в белке куриных яиц и в кормах для животных. Концентрация микроорганизмов в данных культурах измерялась предварительно с использованием метода лимитирующих разведений в двустадийном формате проведения ПЦР [Rodrigo A. G. et al., 1997]. При этом, для определения концентрации штамма Salmonella enteritidis R6 для амплификации использовался подход «гнездовой» ПЦР с применением двух пар праймеров, амплифицирующих участок гена специфического рестрикционного фрагмента Salmonella spp [Aabo S. et al., 1992.].

ПЦР проводилась в объеме 25 мкл на амплификаторе «Терцик» (ДНК-технология, Москва).

2. Молекулярно-генетическое типирование штаммов сальмонелл.

2.1 В работе по молекулярно-генетическому типированию были использованы следующие штаммы из коллекции ФГУ ВГНКИ: S. enteritidis 204, S. enteritidis S7, S. abortusovis 125, S. abortusovis 372, S. dublin 6, S. dublin 373, S. typhimurium 3, S. typhimurium 371, S. gallinarum-pullorum TnlO, S. enteritidis R6, S. choleraesuis TS177, S. choleraesuis 370, S. gallinarum-pullorum «Томилино» .

2.2 Выделение ДНК для проведения типирования штаммов сальмонелл с помощью метода RAPD/RFLP проводилось методом протеиназной обработки и осаждения этанолом с предварительной фенольной экстракцией:

К суспензии бактерий объемом 100−200 мкл добавить экстрагирующий буфер (10 мМ Трис-НС1, 1 мМ ЭДТА, 0,5% додецилсульфат натрия) в отношении 1:10, хорошо перемешать и внести протеиназу К до конечной концентрации 0,1 — 0,5 мг/мл. Перемешать еще раз и инкубировать при 60 °C 1 час. Обработанную суспензию бактерий смешать с равным объемом смеси фенол-хлороформ (1:1) в пробирке объемом 1,5 мл. Перемешать на вортексе до образования эмульсии. Центрифугировать на настольной центрифуге до разделения водной фазы от органической (15−30 сек при максимальной мощности). Верхний водный слой перенести в новую пробирку и добавить повторно равный объем смеси фенол/хлороформ, премешать и центрифугировать при тех же параметрах. Затем к верхней фазе добавить равный объем хлороформа, перемешать и центрифугировать. Отобать водную фазу, добавить одну десятую объема ЗМ натрия ацетата, рН 5,2 и хорошо перемешать. Добавить два объема охлажденного во льду 96% этанола, размешать и инкубировать 10 минут при 0 °C. Провести центрифугирование (10 мин 12 000об/мин), удалить надосадочную жидкость.

Осадок ДНК промыть 70% этанолом, подсушить и растворить в 100 мкл буфера ТЕ.

2.3 Анализ RAPD/RFLP.

Для проведения модифицированного RAPD/RFLP анализа использовался праймер размером 15 п.н., комплементарный с З'-конца сайту рестрикции эндонуклеазы Msel (ttaa), часто встречающемуся в геноме энтеробактерий, с добавлением с 3'- конца селективного нуклеотида. Отжиг праймера проводился в мягких температурных условиях. Фрагменты ПЦР анализировались в 1,5% агарозном геле.

2.4 Амплификация фрагментов гена SpaO.

Для типирования методом секвенирования использовались праймеры для амплификации фрагментов генов invA и SpaO.

Для амплификации гена SpaO использовали специфичные для рода Salmonella праймеры следующего состава:

1) 5Лatg tc (t/a) ttg cgt gtg aga cag-3″ и.

2) 5″ - caa agt tag cgc ctt taa caa ac-3.

Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 66 мМ Tris-HCl рН 8,3, 16,7 мМ (NH4)2S04, 0,05 мг/мл БСА, 0,01% Tween-20, 8% глицерин, 1 мМ MgCl, 0,2 мМ dNTPs, 0,4 мкМ каждого праймера, 2,5 ед./ЮОмкл Taq-полимеразы (ЦНИИ эпидемиологии) и 10−50 нг ДНК.

ПНР проводили по следующей программе: 95 °C — 1 мин, 55 °C — 30 сек., 72 °C — 1 минколичество циклов — 30.

Продукты реакции 1200 п.н. анализировали в 1,5% агарозном геле с маркером — плазмидой pUC19, обработанной рестриктазой Hinfl.

2.5 Амплификация фрагментов гена invA.

Для амплификации фрагментов гена invA использовали специфичные для рода Salmonella праймеры следующего состава:

1) 5″ - atg gtc ttg teg ccc aga tc-3' и.

2) 5regg ate tea tta ate aac aat ac-3.

3) 5Л~ gta ttg ttg att aat gag ate cg-3″ и.

4) 5'- gag ate cat caa att age gga-3.

Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 66 мМ Tris-HCl рН 8,3, 16,7 мМ (NH4)2SC>4, 0,05 мг/мл БСА, 0,01% Tween-20, 8% глицерин, 3 мМ MgCl, 0,2 мМ dNTPs, 0,4 мкМ каждого праймера, 2,5 ед./ЮОмкл Taq-полимеразы (ЦНИИ эпидемиологии) и 10−50 нг ДНК.

ПЦР проводили по следующей программе: 95 °C — 1 мин, 55 °C — 30 сек., 72 °C — 1 минколичество циклов — 30.

Продукты реакции 547 п.н. и 648 п.н. анализировали в 1,5% агарозном геле.

2.6 Проведение филогенетического анализа.

Филогенетичекий анализ выполнялся с использованием программы MegAline из пакета программ DNAStar по алгоритму Clustal V для построения элайнмента и программы Mega2 с использованием алгоритма Neighbor-Joining.

3. Выявление мутаций резистентности к антибиотикам — рифампицину и стрептомицину.

Наличие мутаций определяли методом секвенирования фрагментов амплификации генов rpoB, rpsL, rpsD, rpsE.

3.1 Тестирование резистентности вакцинных штаммов к антибиотикам.

Резистентность вакцинных штаммов сальмонелл к антибиотикам тестировалась на среде Хоттингера с 1,5% агаром с добавлением рифампицина (100 мкг/мл) или стрептомицина (500 мкг/мл).

3.2 Использованные штаммы: S. enteritidis 204, S. enteritidis S7, S. abortusovis 125, S. abortusovis 372, S. typhimurium 3, S. typhimurium 371, S. dublin 6 и S. dublin 373.

3.3 Амплификация гена rpoB.

Для амплификации гена rpoB использовали специфичные для рода Salmonella праймеры следующего состава:

1) 5'-age gtc tgt ctc tgg ggg at -3″ и.

2) 5'- tea gac cga tgt teg gac ct-3.

Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 66 мМ Tris-HCl рН 8,3, 16,7 мМ (NH4)2S04, 0,05 мг/мл БСА, 0,01% Tween-20, 8% глицерин, 1,5 мМ MgCl, 0,2 мМ dNTPs, 0,4 мкМ каждого праймера, 2,5 ед./ЮОмкл Taq-полимеразы (ЦНИИ эпидемиологии) и 10−50 нг ДНК.

ПЦР проводили по следующей программе: 95 °C — 1 мин, 55 °C — 30 сек., 72 °C — 1 минколичество циклов — 30.

Продукты реакции 285 п.н. анализировали в 1,5% агарозном. 3.4 Амплификация фрагментов гена rpsL.

Для амплификации гена rpsL использовали специфичные для рода Salmonella праймеры следующего состава:

1) 5Лcgt cct cat att gtg tga ggg-3' и.

2) 5лgca tgg aaa tac tcc gtt gtt -3.

Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 66 мМ Tris-HCl рН 8,3, 16,7 мМ (NH4)2SC>4, 0,05 мг/мл БСА, 0,01% Tween-20, 8% глицерин, 1,5 мМ MgCl, 0,2 мМ dNTPs, 0,4 мкМ каждого праймера, 2,5 ед./ЮОмкл Taq-полимеразы (ЦНИИ эпидемиологии) и 10−50 нг ДНК.

ПЦР проводили по следующей программе: 95 °C — 1 мин, 55 °C — 30 сек., 72 °C — 1 минколичество циклов — 30.

Продукты реакции 544 п.н. анализировали в 1,5% агарозном геле.

4. Детекция фрагментов ПЦР.

Продукты амплификации анализировались методом горизонтального электрофореза в 1,5 — 1,8% агарозном геле и IX ТБЕ буфере, содержащем бромистый этидий в концентрации 0,25 мкг/мл, с последующей регистрацией результатов системой Gel Doc 2000.

5. Определение концентраций ДНК.

Концентрация геномной ДНК для проведения RAPD/RFLP и продуктов ПЦР для проведения секвенирования определялась методом флюориметрии на ТКО-ЮО (Hoefer Sientific instruments) по инструкции изготовителей инструмента.

6. Секвенирование ДНК.

Секвенирование фрагментов амплификации проводилось с использованием циклического секвенирования по методу Сенгера на амплификаторе GeneAmp® PCR System 2400 (Perkin-Elmer, USA) с набором.

ABI PRISM® Big Dye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction V. l ([PE/ABI], USA), с последующим анализом методом капиллярного электрофореза на ABI-310 PRISM™ Genetic Analyzer (PE/Applied Biosystems). Реакция секвенирования проводилась по следующей программе: 1 мин при 96®-С, затем 25 циклов: 9бОС — Юсек, 550С — 5 сек, 600с — 4 мин и хранение 4 °C. В качестве праймеров для секвенирования использовались те же праймеры, которые были использованы в ПЦР.

7. Клонирование фрагментов ПЦР в фаг A, gtlO.

7.1 Очистка фрагментов ПЦР.

200 мкл фрагмента ПЦР смешать с равным объемом смеси фенол-хлороформ (1:1) в пробирке объемом 1,5 мл. Перемешать до образования эмульсии. Центрифугировать на настольной центрифуге до разделения водной фазы от органической (15−30 сек при максимальной мощности). Верхний водный слой перенести в новую пробирку, добавить повторно равный объем смеси фенол/хлороформ, премешать и центрифугировать. Затем к верхней фазе добавить равный объем хлороформа, перемешать и центрифугировать. Отобрать водную фазу, добавить одну десятую объема ЗМ натрия ацетата и хорошо перемешать. Добавить два объема охлажденного во льду 96% этанола, размешать и инкубировать 10 минут при 0 °C. Провести центрифугирование (10 мин 12 000об/мин), удалить надосадочную жидкость. Осадок промыть 70% этанолом, подсушить и растворить в 50 мкл буфера ТЕ.

7.2 Рестрикция фрагмента ПЦР.

Для проведения рестрикции в пробирке смешать 0,5 мкг ДНК амплифицированного фрагмента в объеме 18 мкл, 2 мкл 10-кратного буфера для рестриктазы EcoRI и 1 мкл рестриктазы EcoRI. Пробирку инкубировать в течение 2 ч при 37 °C.

7.3 Гель-электрофорез, элюция фрагмента из геля.

10 мкл рестрикционной смеси нанести в электрофорезный 1% гель, приготовленный из легкоплавкой агарозы. После проведения электрофореза вырезать кусочек геля, содержащий полосу ДНК (~100мкл), перенести его в пробирку и заморозить при -70°С. Через 10 минут пробирку с гелем разморозить, центрифугировать и отобрать супернатант. 9мкл полученного раствора использовать в реакции лигирования.

7.4 Реакция лигирования.

Для проведения лигирования в одноразовой пробирке типа Эппендорф, смешать 0,5 мкл ДНК фага A, gtl0 (0,1 мкг/мкл), предварительно подвергнутой рестрикции EcoRI, 8 мкл приготовленного фрагмента ПЦР, 1 мкл лигазного буфера (Fermentas) и 1 мкл фермента ДНК-лигаза фага Т4 (1 ед Вейса, Fermentas). Пробирки с реакционной лигазной смесью инкубировать в течение ночи при температуре 16 °C. Полученную лигазную смесь использовать для упаковки в фаговые частицы in vitro.

7.5 Упаковка фаговых частиц.

Пробирки с упаковочными экстрактами N1 и N2 вынуть из холодильника (-70°С) и поместить в лед для оттаивания. 4 мкл лигазной смеси смешать с 10 мкл упаковочного экстракта N1. Затем добавить 15 мкл упаковочного экстракта N2 и смешать. Смесь инкубировать 2 часа при комнатной температуре. Затем добавить 300−500 мкл SM буфера и хлороформа -40 мкл. Приготовленный таким образом препарат можно хранить при +4°С в течение нескольких месяцев.

7.6 Приготовление клеток E.coli.

Отдельную бактериальную колонию (штамм C600Hfl) засеять в 50 мл среды LB и нарастить в колбе объемом 250 мл в течение ночи при 37 °C. Клетки центрифугировать при 3000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалить супернатант и ресуспендировать осадок клеток в ЮшМ MgS04 до концентрации 1,5 *109 кл/мл (OD600=2).

7.7 Высев упакованных частиц фага.

Приготовить 5Ох и 500х разведения упакованных частиц. Смешать в одной пробирке 100 мкл бактериальных клеток E. coli с 200 мкл 50хразведения упакованных частиц фага, во второй пробирке соединить 100 мкл бактериальных клеток E. coli с 200 мкл 500хразведения упакованных частиц фага. Инкубировать 20−30 мин при 37 °C. К каждому образцу добавить по 4 мл расплавленного при 47 °C агара, перемешать и вылить на чашку Петри, содержащую 30 мл агаризованной LB среды, содержащий 10 мМ MgS04. Чашку инкубировать в течение 12−24 часов при 37 °C до появления бляшек бактериофага размером 2−3 мм.

7.8 Отбор клонов и элюция фаговых частиц.

Отобрать прозрачные (рекомбинантные) фаговые бляшки, обкалывая бляшку петлей в 500−1000 мкл SM буфера и элюировать в течение 1 часа при комнатной температуре.

7.9 Наращивание рекомбинантных фаговых частиц.

Смешать 100−200 мкл бактериальных клеток E. coli с 200−400 мкл элюата рекомбинантного фага и инкубировать 20−30 мин при комнатной температуре для осуществления сорбции фага на клетках. Добавить 5 мл среды LB и нарастить при перемешивании в течение ночи при 37 °C. Суспензию клеток центрифугировать и отобрать супернатант, который содержит 108 — Ю10 фаговых частиц в 1 мл. Наличие вставки проверить методом ПЦР.