Помощь в написании студенческих работ
Антистрессовый сервис

Протеолиз, сопряженный с гидролизом АТР. 
Структурно-функциональное исследование Lon-протеиназы Escherichia coli

Диссертация: Протеолиз, сопряженный с гидролизом АТР. Структурно-функциональное исследование Lon-протеиназы Escherichia coli
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Lon (или Ьа)-протеиназа Escherichia coli, обнаруженная в 1970;х годах, явилась исторически первой АТР-зависимой протеиназой, и долгое время служила модельным ферментом для исследования АТР-зависимого протеолиза. Гомоолигомерная Ьоп-протеиназа — редкий представитель ААА±белков, АТР-азный и функциональный компоненты которых объединены в единой полипептидной цепи. Это обстоятельство значительно… Читать ещё >

Протеолиз, сопряженный с гидролизом АТР. Структурно-функциональное исследование Lon-протеиназы Escherichia coli (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Содержание

  • РАЗДЕЛ 1. ФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ СЕЛЕКТИВНОЙ ДЕГРАДАЦИИ БЕЛКОВ (Обзор литературы)
  • Глава 1. ААА±белки
    • 1. 1. Строение и классификация ААА±белков
    • 1. 2. ААА±АТР-азы и контроль качества внутриклеточных белков
      • 1. 2. 1. Шапероновые системы бактерий
      • 1. 2. 2. Широкая специфичность и высокая селективность AAA'-АТР-аз
      • 1. 2. 3. Адапторные белки
  • Глава 2. Протеолитические системы, осуществляющие селективную деградацию внутриклеточных белков
    • 2. 1. А TP-зависимая деградация белков у эубактерий 2.2. А TP-зависимая деградация белков у эукариот
    • 2. 3. АТР-зависимая деградация белков в архебактериях
    • 2. 4. Общие характеристики функционирования энергозависимых протеиназ и протеолитических комплексов
      • 2. 4. 1. Общий моторный модуль AAA -протеиназ
      • 2. 4. 2. Связь между АТР-азными и пептидазными составляющими
  • ААА±протеиназ
    • 2. 4. 3. Общая стратегия узнавания мишеней, А TP-зависимыми протеиназами
    • 2. 4. 4. Катализ процесса механического разворачивания белков ААА±АТР-азами
    • 2. 4. 5. Энергетическая цена селективного протеолиза
    • 2. 4. 6. Энергозависимое разрушение стабильных белковых комплексов

Селективный протеолиз — важнейший механизм поддержания внутриклеточного гомеостаза — осуществляется энергозависимыми протеиназами, относящимися к выявленному в 1990;х г. г. и интенсивно изучаемому суперсемейству ААА±белков (ЛТР-аз, ассоциированных с различными клеточными активностями). Выполняя функции регуляции клеточного метаболизма и контроля качества внутриклеточных белков, ААА±протеиназы обеспечивают быстрый обмен короткоживущих регуляторных белков и удаляют мутантные, поврежденные или денатурированные белки и. тем самым, играют ключевую роль в таких жизненно важных процессах, как деление и дифференциация клеток, ответ на действие стрессогенных факторов и др. В прокариотах ААА±протеиназы представлены пятью семействами (Lon, FtsH, ClpAP, ClpXP, HslUV), в эукариотах селективный протеолиз осуществляется мультикаталитическими комплексами — 265-протеасомами, регуляторные составляющие которых содержат АТР-азы АААт-типа.

Уникальными свойствами ААА±протеиназ, отличающими их от классических протеолитических ферментов служат: (1) высокая селективность при отборе мишеней из общего пула внутриклеточных белков, большая часть которых не должна повреждаться- (2) сопряжение протеолитической активности с гидролизом АТР- (3) процессивиый механизм деградации белков (с образованием 10−15-членных пептидов) при отсутствии выраженной специфичности по отношению к аминокислотам, образующим расщепляемые связи- (4) мулътисубъединичная (гомоили гетеролигомерная) организация.

Lon (или Ьа)-протеиназа Escherichia coli, обнаруженная в 1970;х годах, явилась исторически первой АТР-зависимой протеиназой, и долгое время служила модельным ферментом для исследования АТР-зависимого протеолиза. Гомоолигомерная Ьоп-протеиназа — редкий представитель ААА±белков, АТР-азный и функциональный компоненты которых объединены в единой полипептидной цепи. Это обстоятельство значительно осложнило исследование энзиматических свойств и структуры фермента. К настоящему времени больший прогресс достигнут в изучении гетероолигомерных ClpAP, ClpXP и HslUV протеиназ, АТРазные и протеолитические компоненты которых представляют отдельные субъединицы. Вместе с тем основные проблемы АТР-зависимого протеолиза — механизм высокой селективности ферментов, роль гидролиза АТР в протеолизе и механизм сопряжения гидролиза АТР и процессивного протеолиза — пока остаются не до конца выясненными.

Цель и задачи исследования

Целью работы явилось структурно-функциональное исследование семейства АТР-зависимых Ьоп-протеиназ с использованием в качестве модельного фермента Ьоп-протеиназы из Е. coli (далее — Ьоп-протеиназа или? cLon). Для достижения поставленной цели потребовалось решить следующие задачи:

1. Идентифицировать каталитические остатки протеолитического центра Ьоп-протеиназ и выявить клановую и групповую принадлежность семейства Lon (в классификации пептидгидролаз MEROPS).

2. Охарактеризовать доменную организацию Ьоп-протеиназ, изучить междоменные взаимодействия в? cLon и исследовать свойства изолированных доменов фермента и их комбинаций.

3. Изучить функционирование АТР-азных и протеолитических центров? cLon, исследовать их взаимовлияние и выявить факторы, определяющие процессивный характер механизма функционирования фермента.

4. Определить пространственную структуру? cLon и/или изолированных доменов фермента.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые установлено, что в протеолитических центрах Ьоп-протеиназ функционирует каталитическая диада Ser-Lys. Выявлена уникальность семейства Lon среди серин-лизиновых пептидгидролаз. Обнаружено, что семейство Ьоп-протеиназ представлено двумя подсемействами (А и В), различающимися окружением каталитических остатков протеолитического центра, структурной организацией АТР-азного домена и общей архитектурой молекулы.

Установлена доменная организация ферментов семейства Ьоп-протеиназ. подтвержденная получением изолированных N-концевого (N-), АТР-азного (А-), а-спирализованного (а-) и протеолитического (Р-) доменов, а также АР-фрагмента EcLon с помощью ограниченного протеолиза. В ходе исследования междоменных взаимодействий показано, что изолированные Аи Рдомены фермента, содержащие соответствующие каталитические центры, существуют в растворе как мономерыР-домен является низкоэффективной пептидазой, не способной гидролизовать белковый субстрат ни в индивидуальном состоянии, ни в сочетании с А-доменом (АР-фрагмент, тетрамер), протеолитическая активность присуща только полноразмерному ферментуизолированный А-домен не гидролизует АТР, но проявляет АТРгазную активность в составе полноразмерной Ьоп-протеиназы или ее АР-фрагментаN-домен, мономерный в индивидуальном состоянии, имеет важное значение как для олигомеризации Ьоп-протеиназы, так и для проявления ферментом функциональной активности. Выдвинута гипотеза о роли N-домена как интегрированного адапторного белка Ьоп-протеиназы.

Проведено первое систематическое исследование функционирования АТР-азных и протеолитических центров? cLon. Выявлено отсутствие прямой корреляции между АТР-азной и пептидазной активностями. Показано, что необходимыми факторами реализации процессивного протеолиза служат гидролиз АТР и олигомерность фермента. Обнаружен дополнительный центр связывания белкового субстрата, расположенный в области, включающей N-домен и АААт-модуль.

С помощью сайт-направленного мутагенеза выявлен ряд функционально значимых остатков Ьоп-протеиназ, локализованных в АТР-азном и протеолитическом доменах. Установлено, что функциональная активность мутантных форм? cLon. определенная in vitro. коррелирует с активностью тех же форм in vivo. Методом комплементации мутаций показано существование в нативном ферменте двух путей передачи сигнала от АТР-азных центров к протеолитическим — внутрии межсубъединичного.

Впервые определена кристаллическая структура протеолитического и а-спирализованного доменов? cLon. Показано, что в то время как структура а-домена соответствует общей топологии а-доменов ААА±белков, Р-домен фермента имеет уникальную тип пространственной структуры. Полученные результаты послужили основанием для выделения Ьоп-протеиназ в самостоятельное структурное семейство, представляющее индивидуальный клан SJ в классификации пептидгидролаз MEROPS.

Результаты работы внесли вклад в расширение представлений о строении и механизме действия Ьоп-протеиназ как внутриклеточных «машин селективной деструкции белков» и могут способствовать углубленному пониманию общих закономерностей функционирования АТР-зависимых протеолитических ферментов.

выводы.

1. Проведено структурно-функциональное изучение АТР-зависимых Ьоп-протеиназ с использованием в качестве модельного фермента Ьоп-протеиназы из Escherichia coli (?cLon). Сопоставлением первичных структур ферментов семейства Lon выявлена их доменная организация, подтвержденная получением индивидуальных N-концевого, АТР-азного, а-спирализованного и протеолитического доменов? cLon с помощью ограниченного протеолиза.

2. Анализом аминокислотных последовательностей ферментов семейства Lon и сайт-направленным мутагенезом EcLon установлено, что в протеолитических центрах Lon-прртеиназ функционирует каталитическая диада Ser-Lys. Выявлена уникальность семейства Lon среди серин-лизиновых пептидгидролаз.

3. Установлено, что семейство Lon-протеиназ состоит из двух подсемейств (LonA и LonB), различающихся окружением каталитических остатков протеолитического центра, структурной организацией АТР-азного домена и общей архитектурой молекулы (наличие N-концевого домена у LonA-протеиназ и вставочного трансмембранного домена в ААА±модуле LonB-протеиназ).

4. Изучены особенности функционирования АТР-азных и протеолитических центров EcLon. Установлено, что необходимыми факторами реализации процессивного протеолиза являются гидролиз АТР и олигомерность фермента. Выявлено отсутствие прямой корреляции между АТР-азной и пептидазной активностями. Обнаружен дополнительный центр связывания белкового субстрата, расположенный в области, включающей N-концевой и АТР-азный домены.

5. Для идентификации функционально значимых остатков Lon-протеиназы получено и охарактеризовано 17 точечных мутантов фермента с заменами в АТР-азном и протеолитическом доменах. Установлено, что функциональная активность мутантных форм Lon-протеиназы, определенная in vitro, коррелирует с активностью тех же форм in vivo (биолюминесцентный Lux-тест).

6. Охарактеризован уникальный мутант Lon-K362Q с заменой в Р-петле ААА±модуля, взаимодействие которого с комплексом ADP-Mg — ингибитором нативной Lon-протеиназы — вызывает активацию пептидазного центра. Показано, что свойства Lon-K362Q обусловлены нарушением межсубъединичных взаимодействий, характерных для нативного фермента. Комплементацией мутаций (Lon-K362Q и Lon-S679A) показано существование в нативной Ьоп-протеиназе двух путей передачи сигнала от АТР-азных центров к протеолитическим — внутри-и межсубъединичного.

7. Для исследования междоменных взаимодействий получены и охарактеризованы укороченные формы Ьоп-протеиназы, представляющие индивидуальные домены фермента и их комбинации. При этом установлено, что.

— изолированные протеолитический и АТР-азный домены фермента существуют в растворе, соответственно, в форме мономеров (в отличие от каталитических субъединиц гетероолигомерных АТР-зависимых протеиназ, образующих циклические гексаили гептамеры);

— протеолитический домен проявляет исключительно пептидазную активность как в изолированном состоянии, так и в сочетании с АТР-азным доменом (АР-фрагмент) — только в составе полноразмерного фермента Р-домен приобретает способность к гидролизу белкового субстрата;

— АТР-азный домен не обладает ферментативной активностью, но способен гидролизовать АТР в составе как полноразмерной Ьоп-протеиназы, так и ее АР-фрагмента;

— N-домен важен для олигомеризации Ьоп-протеиназы и имеет ключевое значение для проявления ферментом протеолитической активности. Выдвинута гипотеза о роли N-домена как интегрированного адапторного белка Ьоп-протеиназы.

8. Впервые определена кристаллическая структура протеолитического и а-спирализованного доменов, полученных ограниченным протеолизом Ьоп-протеиназы Е. coli. Подтверждено наличие каталитической диады Ser-Lys и выявлен ряд остатков, участвующих в формировании активного центра фермента. Показано, что структура а-домена соответствует общей топологии а-доменов ААА±белков.

9. Установлено, что протеолитический домен Lon-протеиназы Е. coli имеет уникальный тип пространственной структуры, что позволило выделить Lon-протеиназы в самостоятельное структурное семейство, представляющее индивидуальный клан SJ в классификации пептидгидролаз MEROPS.

Автор считает своим долгом выразить глубокую признательность своему научному руководителю чл.-корр. РАН, профессору Владимиру Констатиновичу Антонову (19 271 992), инициировавшему исследования в области АТР-зависимого протеолиза в лаборатории химии протеолитических ферментов ИБХ РАН.

Автор приносит искреннюю благодарность своим коллегам — А. Ю. Америку, Л. Г. Чистяковой и Н. И. Дергоусовой, в совместной работе с которыми начиналось изучение Ьоп-протеиназы из Escherichia coli.

Автор выражает глубокую благодарность С. А. Котовой, М. Н. Сизой, Н. Н. Старковой, Ф. С. Расуловой, Э. Э. Мельникову, К. Б. Цирульникову, О. В. Маховской, А. Г. Халатовой, А. А. Степнову — сотрудникам и аспирантам, изучение которыми различных аспектов АТР-зависимого протеолиза способствовало накоплению фактического материала, лежащего в основе данной работы.

Особую благодарность автор приносит д.х.н. Л. М. Гинодману за активное участие в обсуждении направлений исследования, полезные дискуссии, ценные практические рекомендации и критические замечания.

Искренняя благодарность всем сотрудникам лаборатории химии протеолитических ферментов и особенно — заведующему лабораторией, профессору Л. Д. Румшу, за доброжелательный интерес и внимание к работе, полезные советы, безотказную помощь и поддержку.

заключение

).

Проведенное в настоящей работе структурно-функциональное исследование АТР-зависимых Ьоп-протеиназ позволило идентифицировать каталитическую диаду Ser-Lys в активных центрах ферментов и при этом выявить уникальность семейства Lon среди серин-лизиновых пептидгидролаз. Внутри семейства Lon-протеиназ обнаружено два подсемейства, различающихся доменной организацией и строением консенсусных фрагментов. На примере Lon-протеиназы из Е. coli исследовано функционирование АТР-азных и протеолитических центров ферментов LonA-подсемейства и изучены межцентровые взаимодействия. Установлено, что необходимыми факторами реализации процессивного протеолиза служат гидролиз АТР и олигомерность Lon-протеиназы. Получены сведения о междоменных взаимодействиях в Lon-протеиназе и охарактеризованы свойства изолированных доменов фермента и некоторых их комбинаций. Определена кристаллическая структура протеолитического и а-спирализованного доменов Lon-протеиназы. Тем самым получена существенная информация о строении и функционировании внутриклеточных АТР-зависимых Lon-протеиназ.

Вместе с тем до последнего времени остаются неисследованными многие аспекты функционирования Ьоп-протеиназ. Например, неясно, как Lon-протеиназы узнают свои белковые мишени, как взаимодействие с АТР влияет на конформационные изменения ферментов и на активность их протеолитических центров, каково олигомерное состояние функциональной формы Lon-протеиназ и конформационное состояние отдельных субъединиц в олигомере фермента и, наконец, какова пространственная структура полноразмерных ферментов. Получение ответов на эти и многие другие вопросы составляет программу дальнейшего изучения Lon-протеиназ.

Обнаружение двух подсемейств в семействе Ьоп-протеиназ предопределяет в качестве одного из основных направлений сравнительное исследование представителей подсемейств ЬопА и LonB с целью получения данных о влиянии выявленных между ними различий на свойства и механизм функционирования ферментов. Работа в этом направлении уже проводится. В частности, проведено выделение LonB-протеиназы из Archaeoglobus fulgidus (Д/LonB) и начато изучение свойств фермента [349]. Ограниченным протеолизом получен протеолитический домен AfLonB и определена его кристаллическая структура, отличающаяся по ряду параметров от структуры соответствующего домена.

ЬопА-протеиназы из Е. coli при сохранении общего уникального типа пространственной укладки, описанной в Главе 5 [35°].

Продолжается исследование пространственного строения Ьоп-протеиназы Е. coli. Определена кристаллическая структура 119-членного N-концевого субдомена фермента, представляющая новый уникальный тип белковых структур [351]. Проводятся эксперименты по кристаллизации как полноразмерного фермента, так и его фрагментов, содержащих АТР-азный домен.

Выявленная ключевая роль олигомеризации Ьоп-протеиназы для реализации процессивного протеолиза ставит задачи определения олигомерного состояния LonAи ЬопВ-ферментов на разных стадиях их функционирования, а также выявления роли отдельных доменов в поддержании олигомерной стр^тстуры. Кроме того, требует определенности предположение о существовании Ьоп-протеиназы в виде динамической совокупности ряда форм различной степени олигомерности.

Можно полагать, что дальнейшее продолжение исследования Ьоп-протеиназ послужит основой создания феноменологической схемы функционирования этих ферментов.

РАЗДЕЛ 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. МАТЕРИАЛЫ 3.1.1. Реактивы.

В работе были использованы: дрожжевой экстракт, триптон, бакто-агар («Difco», Англия) — агароза («Bio-Rad», США) — трис-(гидроксиметил)-аминометан (Tris), 3-(N-морфолино)-пропансульфоновая кислота (MOPS), Ы-(2-гидроксиэтил)пиперазин-К'-(2-этансульфоновая кислота) (HEPES), этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), додецилсульфат натрия (SDS), (3-меркаптоэтанол, М, М, М', М'-тетраметилэтилендиамин (TEMED), персульфат аммония (PSA), кумасси R-250, дитиотреитол (DTT), глицерин, бычий сывороточный альбумин (BSA), а-казеин, (3-казеин, дефосфорилированный казеин, бромистый этидий, фенилборная кислота (PheB (OH)2), фенилметилсульфонилфторид (PMSF). 4,4'-дитиодипиридин (DTDP), Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl (РерТВЕ), ADP, <�х, р-метилен-АТР (АМРСРР), изопропил-Р-О-тиогалактопиранозид (IPTG) («Sigma», США) — аллил (55.65)-6-[(11)-ацетоксютил]-пенем-3-карбоксилат (ААРС) (Англия) — АТР («Boehringer Mannheim», Германия) — 2'-дезоксирибонуклеозид-трифосфаты (dNTPs) («Reanai», Венгрия) — акриламид, метиленбисакриламид («Bio-Rad», США) — ампициллин, нитроцеллюлоза, сцинтиллятор («Serva», Германия) — бромфеноловый синий («Koch Light», Англия) — глицин, глюкоза, трихлоруксусная кислота (ТХУ), трифторуксусная кислота (TFA), гуанидин гидрохлорид, мочевина, ацетат натрия, ацетат цинка дигидрат, молибдат аммония ((NH4)6Mo7024×4Н2О), фенол, метанол, этанол, изопропанол, хлороформ, ацетонитрил, диметилсульфоксид (ДМСО), мочевина, дигидрофосфат калия, тригидрат гидрофосфата калия, хлорид магния, хлорид натрия, гидроксид натрия, соляная кислота («Реахим», Россия), голубой декстран и белковые стандарты для электрофореза («Pharmacia», Швеция) — нитроцеллюлозные мембраны NA-45 («Schleicher & Schuell», Германия),.

В качестве компонентов буферов использовали соли фирмы «Мегк» (Германия) и отечественного производства квалификации «ос.ч.» или «х.ч.» .

Для выделения белков использовали сорбенты: фосфоцеллюлоза Р-11 («Whatman», Англия) — DEAE-Toyopearl, DEAE-Sephacel, Q-сефароза, гепарин-сефароза, Superose-6, Sephacryl S-300, Superdex 75 («Pharmacia», Швеция), глутатион-агароза («Sigma», США).

3.1.2. Ферменты.

Эндонуклеазы рестрикции — фирм «MBI» (Литва) и «Boehringer Mannheim» (Германия) — ДНК-лигаза фага Т4, РНКаза, А — фирмы «Boehringer Mannheim» (Германия) — фрагмент Кленова ДНК-полимеразы E. coli, Klen-Taq-полимераза, бактериальная щелочная фосфотаза (ВАР), SequenaseTM v.2.0 («USB», США) — лизоцим яичного белка («Реахим», Россия).

3.1.3. Штаммы Е. coli.

АВ 1899 [ F-, recA99, thr-1, leu-6, thi-1, lacYl, galK2, ara-12, xyl-5, mtl-1, proA2, his.

4, argE3, str-31, tsx-33, lon-100 ].

HB 101 [ F-, hsdS20 (rb-, mb+), recA13, ara-14, proA2, lacYl, galK2, rpsL20 (Smr), xyl.

5, mtl-1, surE44 ].

MH-I [araD139, lacX74, galU, galK, hsr-, hms, strA].

BL21(DE3) [F", ompT, hsdSB (rb", mb"), gal, dcm, lacYl, (DE3)].

Rosetta (DE3)pRARE [F, ompT, hsdSB (V, mb"), gal, dcm, lacYl, (DE3) pLys SRARE2,.

Cmr)].

3.2. МЕТОДЫ.

3.2.1. Сопоставление аминокислотных последовательностей белков.

Первичные структуры Ьоп-протеиназ из различных источников и других ферментов получены из баз данных MEROPS и SwissProt. Сравнение аминокислотных последовательностей проводили с использованием программы MULTIALIGN программного пакета DNASTAR.

Ъ.2.2. Процедуры, использованные при работе с клетками.

Клонирование гена lon Е. coli, а также его модифицированных форм, приводящих к образованию мутантных или укороченных форм Ьоп-протеиназы проводили в штаммах Е. coli АВ 1899/pBR/cw и BL 21. Получение компетентных клеток Е. coli АВ 1899 и трансформацию их плазмидной ДНК проводили по стандартным методикам, описанным в руководстве [j52]. Экспрессию гена lon или его модифицированных форм проводили согласно методам, описанным в [270].

3.2.3. Сайт-направленный мутагенез гена lon.

Материалом для проведения мутагенеза служила векторная конструкция pBR-lon, полученная в результате клонирования гена lon с собственной регуляторной областью в плазмиде pBR327 [ ]. Аминокислотные замены произведены с учетом частоты ого встречаемости естественных мутаций в белках [ ]. Мутации, приводящие к заменам K362Q, S679A были введены методом геп-дуплексного мутагенеза, описанным в работе [276].

Введение

других мутаций было осуществлено при использовании четырехпраймерного метода мутагенеза (SOE, splicing by overlapping extension), основанного на полимеразной цепной реакции (ПЦР) [j21]. Нуклеотидную последовательность полученных мутантов подтверждали секвенированием по методу Sanger.

3.2.4. Выделение и очистка Ьоп-протеиназы, ее мутантных и укороченных форм.

Для выделения и очистки Ьоп-протеиназы, ее мутантных, модифицированных и укороченных форм применяли стандартные методы белковой химии с использованием ряда стадий ионообменной, аффинной и эксклюзионной хроматографии [270, Зз4]. На начальных этапах выделения форм фермента, содержащих ААА±модуль, в качестве необходимой стадии использовали хроматографию на фосфоцеллюлозе Р-11. Содержание белка определяли по методу Бредфорд f55], белковый состав препаратов анализировали с о помощью диск-электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS [ ]. ,.

Для примера ниже приведена методика выделения полноразмерной нативной Ьоп-протеиназы.

Буферные растворы: 50 мМ Tris-HCl, рН 7.5, 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA (А) — 20 мМ Tris-HCl, рН 7.5, 5 мМ EDTA (В) — 50 мМ К-фосфат, рН 6.8, 10% (v/v) глицерин, 1 мМ EDTA (С) — 300 мМ К-фосфат, рН 6.8, 10% (v/v) глицерин, 1 мМ EDTA (D) — 50 мМ Tris-HCl, рН 7.5, 10% (v/v) глицерин, 1 мМ EDTA (Е) — 50 мМ Tris-HCl, рН 7.5, 0.25 М NaCl (F) — 50 мМ Tris-HCl, рН 7.3,10% (v/v) глицерин (G) — 20 мМ К-фосфат, рН 8.0, 0.3 М NaCl (Н) — 20 мМ К-фосфат, рН 8.0, 1 мМ DTT (I) — 20 мМ HEPES. рН 7.0. 1 мМ DTT (J) — 20 мМ Tris-HCl, рН 8.0, 0.15 М NaCl, 1 мМ DTT (К) — 50 мМ Tris-HCl, рН 8.0 (L) — 20 мМ Tris-HCl, рН 7.5, 0.15 М NaCl (М) — 50 мМ HEPES, рН 7.0~(N).

Получение бесклеточного экстракта.

Клетки /о/7-дефицитного штамма BL21, трансформированные плазмидой pBR-lon, выращивали в течение ночи при 37 °C на среде LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллинаосаждали центрифугированием, дважды промывали буфером, А и хранили при -80 °С. 40 г размороженных клеток суспендировали в 140 мл буфера В и обрабатывали 2 часа лизоцимом (конечная концентрация 0.1 мг/мл, 4 °С). Частично лизированные клетки разрушали с помощью ультразвука (4 °С, 15 кГц, 3×1 мин, дезинтегратор УЗДН-4А), образовавшийся гомогенат центрифугировали (3 ч- 40 000 х g), получали бесклеточный экстракт.

Хроматография на фосфоцеллюлозе Р-11.

Бесклеточный экстракт разбавляли в 5 раз буфером С и наносили на колонку с фосфоцеллюлозой Р-11 (150 мл), уравновешенной буфером С, со скоростью 1 мл/мин. Колонку промывали 1 л того же буфера с и элюировали белок 600 мл буфера D со скоростью 3 мл/мин, фракции, содержащие целевой белок, хранили при 4 °C не более ночи и использовали далее для хроматографии на DEAE-Toyopearl или Q-сефарозе.

Хроматография на О-сефарозе.

Объединенные фракции разбавляли в 4 раза охлажденным до 4 °C буфером Е, фильтровали через целлюлозный мембранный фильтр (0.2 мкм) и наносили на три последовательно соединенных колонки (по 5 мл) с Q-сефарозой HP, уравновешенной тем же буфером, со скоростью 1 мл/минпромывали 150 мл буфера Е и элюировали связавшиеся белки 225 мл линейного градиента концентрации NaCl (0 -1.0 М) в буфере Е. Фракции, десорбировавшиеся в области 0.2 — 0.5 М NaCl, объединяли, и использовали для дальнейшей очистки или добавляли глицерин до 50% концентрации и хранили при -20 °С.

Хроматография на гепарин-сефарозе.

Объединенный элюат после хроматографии на Q-сефарозе наносили со скоростью 1 мл/мин на колонку с гепарин-сефарозой (HiTrap Heparin-Sepharose HP, 5 мл), уравновешенной буфером Е, содержащим 300 мМ NaClпромывали 50 мл буфера Есвязавшиеся белки элюировали в условиях линейного градиента концентрации NaCl (0.3 -1 М) в буфере Е. Фракции, десорбировавшиеся в области 0.4 — 0.7 М NaCl, объединяли, и использовали для дальнейшей очистки или добавляли глицерин до 50% концентрации и хранили при -20 °С.

Гель-фильтрация на Сефакриле.

Объединенный элюат после хроматографии на гепарин-сефарозе концентрировали с помощью мембранных фильтров Centriprep 50 и хроматографировали на колонке со смолой HiPrep 26/60 Sephacryl S-300, уравновешенной буфером F.

Выход Ьоп-протеиназы составляет около 100 мг из 40 г сырых клеток. Чистота препарата около 95%.

Выделение гибридных форм Ьоп-протеиназы с использованием аффинной хроматографии на глутатион-агарозе.

Ночную культуру трансформированных соответствующей плазмидой бактерий (среда LB, содержащая 100 мкг/мл ампициллина) разбавляли в соотношении 1:100 этой же средой с добавлением антибиотика и наращивали биомассу при 37 °C и интенсивной аэрации до достижения оптического поглощения Абоо =0.3−0.5. Добавляли IPTG до конечной концентрации 0.5 мМ. Индукцию проводили в течение 3−4 часов, затем клетки осаждали центрифугированием. Осадок клеток, полученный из 200 мл культуры, ресуспендировали в 5 мл охлажденного 50 мМ трис-НС1-буфера (рН 7.3), содержащего 10% глицерин (буфер G). Полученную суспензию обрабатывали с помощью ультразвукового дезинтегратора, разбавляли до 10 мл тем же буфером и центрифугировали (30 мин, 40 000g). Полученный бесклеточный экстракт наносили со скоростью 3 мл/ч на колонку (1×3 см) с глутатион-агарозой, предварительно уравновешенной буфером А. Элюцию белка осуществляли буфером G, содержащим 5 мМ восстановленный глутатион.

Гидролиз гибридных белков тромбином проводили 2 ч при 25 °C в 1.5 мл реакционной смеси, содержащей 0.5 мг гибридного белка и 6 мкл тромбина (330 ед. акт./мл) в буфере G.

3,2.5. Ограниченный протеолиз Ьоп-протеиназы и ее мутантных форм.

Выделение фрагментов фермента.

Протеолитический домен. 100 мг мутанта Lon-S679A инкубировали 2 ч при 30 °C с 250 мкг а-химотрипсина в 50 мл буфера Н, добавляли PMSF до 1 мМ, разбавляли в 4 раза (при 4°С) буфером I, фильтровали через мембранный фильтр (0.45 мкм) и наносили на колонку с HiTrap Heparin-Sepharose HP (5 мл), уравновешенной буфером I, несвязавшиеся фракции, содержащие целевой белок, концентрировали с помощью мембранных фильтров YM-10, разбавляли в 10 раз буфером J и хроматографировали на.

HiTrap Q-Sepharose HP (5 мл) в буфере J, белки элюировали 100 мл линейного градиента концентрации NaCl (0 — 1 М) в буфере J. Фракции, десорбировавшиеся в области 0.1 — 0.2 М NaCl, объединяли, концентрировали с помощью мембранных фильтров Centriprep 10 и хроматографировали на колонке HiLoad 26/60 Superdex 75 в буфере К. а-Спирализованный домен. 100 мл реакционной смеси, содержащей 0.5 мг/мл Lon-S679A и 20 мкг/мл а-химотрипсина, инкубировали 3 ч при 37 °C в буфере L, добавляли [3-меркаптоэтанол до 1% (v/v) и хроматографировали на HiTrap Q-Sepharose HP (5 мл) в том же буфере, несвязавшиеся фракции, содержащие целевой белок, концентрировали с помощью мембранных фильтров Centriprep 10 и хроматографировали на колонке HiLoad 26/60 Superdex 75 в буфере М.

Получение N-домена, AAA*-модуля и АР-фрагмента EcLon проводили в среде, содержащей 1 мМ ADP и 20 мМ MgCb (только при получении АР).

100 мг очищенного препарата? cLon обрабатывали 0.5 мг а-химотрипсина (2 ч при 30°С) в 50 мл буфера F, добавляли PMSF до 1 мМ, фильтровали (при 4°С) через мембранный фильтр (0.2 мкм) и хроматографировали на HiTrap Heparin-Sepharose HP (5 мл) в том же буфере, элюция 50 мл линейного градиента концентрации NaCl (0.2 — 1 М) в буфере F. Несвязавшиеся фракции разбавляли в 6 раз буфером N и концентрировали с помощью мембран 10 000 MWCO до 50 мл, процедуру повторяли трижды, затем белковый раствор хроматографировали на HiTrap Q-Sepharose HP (5 мл) в буфере N, белки элюировали 50 мл линейного градиента концентрации NaCl (0 — 0.5 М) в буфере N. Фракции, десорбировавшиеся в области 0.2 — 0.3 М NaCl, объединяли, концентрировали и хроматографировали на колонке HiLoad 26/60 Superdex 75 в буфере N, выделяли N-домен.

Фракции элюата после хроматографии на HiTrap Heparin-Sepharose HP (0.4 — 0.8 М NaCl) разбавляли в 3 раза 50 мМ трис-НС1-буфером, рН 7.5 и хроматографировали на HiTrap Q-Sepharose HP (5 мл) в последнем буфере. Несвязавшиеся фракции, содержащие ААА±модуль, концентрировали и хроматографировали на колонке HiLoad 26/60 Superdex 75. Элюат с HiTrap Q-Sepharose HP (20 мл 50 мМ трис-НС1-буфера, рН 7.5, 0.4 М NaCl) концентрировали с помощью Amicon Ultra 10 000 MWCO и хроматографировали на HiPrep 26/60 Sephacryl S-300, уравновешенной буфером F, получали АР-фрагмент.

Средний выход очищенных препаратов фрагментов из 100 мг полноразмерной. EcLon составляет 20 мг для N-домена, 30 мг для ААА±модуля, 40 мг для АР-фрагмента и 15 мг для Р-домена.

3.2.6. Исследование смешанных олигомеров Ьоп-протеиназы.

Для обеспечения диссоциации на субъединицы мутантные формы Ьоп-протеиназы.

Ser679Ala и Lys362Gln инкубировали в присутствии 1 М NaCl в течение 2 ч, затем смешивали в эквимолярных количествах и подвергали диализу против 50 мМ Tris-HCl (рН 7.5) в течение ночи. Протеолитическую активность полученных препаратов оценивали по гидролизу [14С]-ацетил-а-казеина.

3.2.7. Тестирование ферментативной активности.

При обработке данных использовали программу «Origin» .

АТР-зависимый гидролиз [14С1-ацетил-а-казеина.

Протеолитическую активность нативной и мутантных форм фермента тестировали по радиоактивности кислоторастворимых продуктов деградации ацетилированного казеина в присутствии и в отсутствие АТР.

Реакцию проводили при 37 °C в 1000 мкл реакционной смеси состава: 50 mM Tris-HCl, рН 8.0- 20 мМ MgCb- 5 мМ АТР- 5% глицерин, 0.1 М NaCl- 0.3 мг/мл [|4С]-ацетил-сх-казеина- 10−40 мкг/мл Ьоп-протеиназы.

В контрольном опыте для учета АТР-независимого протеолиза аликвоту АТР заменяли аликвотой 50 мМ Tris-HClбуфера, рН 8.0.

Реакционную' смесь параллельно с контрольной (аликвоты по 150 мкл) через равные интервалы времени (15 мин) отбирали в пробирки, содержащие 50 мкл 5% BSA, встряхивали, добавляли 500 мкл 15% ТХУ, встряхивали и осаждали при 4 °C. Через 60 мин после отбора аликвоты суспензию белка центрифугировали на миницентрифуге (10 мин, 12 000 об./мин). Отбирали 600 мкл надосадочной жидкости в сцинтилляционный флакон, содержащий 5 мл сцинтилляционной жидкости (СЖ), и измеряли уровень радиоактивности.

По значениям счета как функции от времени, определяли скорость гидролиза казеина Vo, выраженную в условных единицах (cpm/min).

Удельную АТР-зависимую активность фермента рассчитывали по формуле: А = Cs AV0 / (О.С. — Ф.С.) / СЕ, {моль / (моль х мин)}, где.

AV0 {cpm/min} - разность скоростей гидролиза казеина в присутствии и в отсутствие АТРО.С. и Ф.С. {срт} - общий и фоновый счет препарата казеина при стандартизованной процедуре осаждения в отсутствие ферментаCs и Се {М} - молярная концентрация субстрата (казеина) и фермента (в расчете на субъединицу) соответственно.

Реакцию проводили при разных концентрациях фермента, и полученные значения i удельной активности усредняли.

Определение протеолитической и автолитической активностей Ьоп-протеиназы с помощью диск-электрофореза.

Активность Ьоп-протеиназы при гидролизе (3-казеина определяли электрофоретически.

200 мкл 50 мМ Tris-HCl-буфера, рН 8.0, содержащего 20 мМ MgCh, 5 мМ АТР или АМРСРР, 0.5 мг/мл казеина и 75 мкг/мл Ьоп-протеиназы, инкубировали при 37 °C. Из реакционной смеси через равные промежутки времени (10−30 мин) отбирали аликвоты (по 20 мкл) в пробирки, содержащие по 7 мкл лизирующего буфера (4х) для образцов, денатурировали кипячением, наносили по 20 мкл на гель и проводили электрофорез. Активность фермента определяли по убыли полосы, соответствующей р-казеину.

При исследовании автолитической активности Ьоп-протеиназы из смеси, содержащей 50 мМ Tris-HCl-буфер, рН 8.0, различные эффекторы (5 мМ АТР, 20 mM MgCl2, 0.5 мг/мл мелиттина) и 0,5 мг/мл фермента, через равные промежутки времени (60 мин) отбирали аликвоты (20 мкл), добавляли лизирующий буфер для образцов, кипятили и проводили электрофорез. Эффективность автолиза детектировали по убыли полосы, соответствующей Ьоп-протеиназе.

Гидролиз мелиттина.

Продукты гидролиза мелиттина Ьоп-протеиназой и ее модифицированными формами детектировали с помощью масс-спектрометрии. Состав реакционной смеси: 200 мкл 50 мМ Tris-HCl-буфера, рН 8.0, 20 mM MgCl2, 5 мМ АТР или АМРСРР, 0.5 мг/мл мелиттина и 75 мкг/мл Ьоп-протеиназы, инкубация при 37 °C. Из реакционной смеси отбирали аликвоты по 20 мкл и добавляли раствор 2 для обессоливания образцов для масс-спектрометрии.

Приготовление образцов для масс-спектрометрии.

К 20 мкл реакционной смеси добавляли 5 мкл раствора, содержащего 8 М гуанидин гидрохлорид и 2.5% TFA, и наносили на микроколонки ZipTip (Millipore) С4 или С18 (смола помещена в наконечник для автоматической пипетки), промытые раствором 50% ацетонитрилом и уравновешенные 0.1% TFA. Смолу промывали 2−3 раза 0.1% TFA и 2 раза раствором тем же раствором, но содержащим 5% метанол (для полного обессоливания образца), смесь пептидов и белков элюировали 2 раза по 10 мкл раствора, содержащего 50% ацетонитрил и 0.1% TFA.

Масс-спектрометрический анализ проводили на приборе MALDI-MS Vision 2000 (Thermo BioAnalysis, США) в линейном режиме с использованием в качестве матрицы раствора 2% 2,5-дигидроксибензойной кислоты.

Гидуолиз Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl.

Гидролиз тиоэфира регистрировали спектрофотометрически [ ] по величине оптического поглощения 4-тиопиридона (?324 = 19 800 М" 1 х см" 1), образующегося в результате взаимодействия продукта гидролиза (бензилтиолата, Bzl-S") с 4,4'-дитиодипиридином (DTDP), используя либо непрерывную регистрацию сигнала, либо метод отбора проб. В первом случае DTDP содержался в реакционной смеси (условия приведения реакции — см. «Гидролиз АТР») в концентрации 1 мМво втором случае — в «остановочном» реагенте (50 мМ Tris-HCl, рН 8- 8 М мочевина- 2 мМ DTDP).

При тестировании «методом отбора проб» реакцию проводили в 3 мл реакционной смеси. Аликвоты по 400 мкл отбирали в кварцевые кюветы, содержащие равный объем «остановочного» реагента, встряхивали и определяли оптическое поглощение раствора.

Гидролиз АТР.

Гидролиз АТР тестировали по накоплению в реакции неорганического фосфата [304]. Реакцию проводили при 37 °C в 1500 мкл реакционной смеси состава: 50 мМ Tris-HCI-буфер, рН 8- 0.3 — 3 мМ АТР- 15 мМ MgCl2- дефосфорилированный казеин — 1 мг/мл- 0.1 М NaCl, 5% глицеринфермент — 20 — 100 мкг/мл. В контрольном опыте аликвоту фермента заменяли аликвотой 50 мМ Tris-HCl-буфера, рН 8- 1 М NaCl, 50% глицерин.

При определении начальных скоростей реакционную смесь (аликвоты по 200 мкл), параллельно с контрольной, через равные промежутки времени отбирали в кварцевые кюветы, содержащие 600 мкл реагента для определения неорганического фосфата, встряхивали и определяли оптическое поглощение при длине волны 350 нм (?350= 7800 М" 1 х см" 1).

3.2.8. Исследование олигомерного состояния нативной Lon-протеиназы.

Аналитическое ультрацентрифугирование.

Эксперименты проводили в аналитической ультрацентрифуге модель Е (Beckman, США, серийный номер 11 243 MFG), снабженной УФ-сканером, монохроматором с ксенон-ртутной лампой, мультиплексором и модифицированным однокоординатным самописцем (Recorder 110 710−10 005, Houston Instrument) с отклонением пера до 20 см при оптическом поглощении 0,2 и общем увеличении по радиусу 16 раз. Графически сглаженные седиментограммы для разных моментов времени сводили на один кадр для точной идентификации положения и формы границ седиментации отдельных компонентов в разные моменты времени.

Скоростную седиментацию проводили в двухсекторных угольных кюветах (номер по каталогу Beckman 306 493) при температурах, близких к 20 °C. Концентрация ферментов составляла 0.5−1.0 мг/мл.

Зональную седиментацию активного фермента проводили в двухсекторной кювете тип 1 (номер по каталогу Beckman 331 359). Раствор фермента (0.1−0.5 мг/мл) в 20 мМ Tris-HCl-буфере, рН 8.0, объемом 5−7 мкл, наслаивали на 0.42 мл растворителя, содержащего 50 мМ Tris-HCl-буфер, рН 8.0, 0.1 М NaCl, 10% DMSO, 2 мМ DTDP, 1 мМ Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl, 0.2−2.0 мМ АТР, ADP, АМРСРР, 1−20 мМ MgCb. Температура экспериментов 26−28°С. Наслоение происходило при 2000;5000 об/мин. На этой скорости центрифугирование вели 10−15 мин, затем скорость вращения ротора ступенчато увеличивали до 11 000, 22 000, 34 000 об./мин (60, 30, 60 мин, соответственно). Регистрацию оптического поглощения по радиусу проводили при длинах волн 324 или 340 нм с максимальной скоростью сканирования.

Эксклюзионная хроматография.

Четвертичная структура Ьоп-протеиназы была исследована с использованием гель-фильтрации методом FPLC на колонке Superose-б. Регистрация веществ на выходе из колонки осуществлялась с помощью ультрафиолетового детектора при Х=254 нм. Для определения олигомерного состояния Ьоп-протеиназы использовали калибровочнто зависимость коэффициента удерживания Kav от логарифма молекулярной массы белка. Для построения этой зависимости проводили гель-фильтрацию белков-стандартов с известной молекулярной массой (тироглобулин, 669 кДаапоферритин, 443 кДакаталаза, 240 кДаальдолаза, 160 кДа).

Исходные образцы центрифугировали (5 мин, 12 000 об./мин). 220 мкл образца i наносили на колонку объемом 24 мл. Гель-фильтрацию проводили в 50 мМ Трис-НС1-буфере, рН 7.5, содержащем 0.15 М NaCl и 1 мМ DTT при скорости потока 0.33 мл/мин и рабочем давлении 0.6 МПа. Элюат фракционировали, определяли концентрацию белка. Основные фракции анализировали с помощью диск-электрофореза и использовали для определения ферментативной активности в реакции гидролиза Р-казеина.

3.2.9. Кристаллизация индивидуальных доменов Ьоп-протеиназы.

Кристаллизацию фрагментов Ьоп-протеиназы проводили методом висячей капли, содержащей одинаковые количества белкового и резервуарного растворов. В случае а-домена белковый раствор концентрировали до 10 мг/млрезервуарный раствор содержал 30% PEG 3000 (или 20% PEG 8000), 0.1 М CHES, рН 9.5. В течение 14 дней при комнатной температуре кристаллы достигали размера 0.4×0.1×0.05 mmj. Затем кристаллы переносили в криозащитный раствор, состоящий из 80% маточного раствора и 20% этиленгликоля.

В случае Р-домена белковый раствор содержал от 18 до 24 мг/млрезервуарный раствор содержал 2 М (NH^SO^ 0.1 М PIPES, рН 6.5. Типичные кристаллы размером 0.2×0.1×0.1 mmj вырастали за 5−10 дней при комнатной температуре. Кристаллы хранили в криозащитном растворе, состоящем из 80% маточного раствора и 20% этиленгликоля.

Показать весь текст

Список литературы

  1. В. (1998) The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell, 92(3), 291−294.
  2. A.L. (1995) Molecular chaperones. Resurrection or destruction? Curr. Biol, 5(5), 455 458.
  3. S., Wickner S., Maurizi M.R. (1997) Protein quality control: triage by chaperones and proteases. Genes Dev., 11(7), 815−823.
  4. Suzuki C.K., Rep M., van Dijl J.M., Suda K, Grivell L.A., Schatz G. (1997) ATP-dependent proteases that also chaperone protein biogenesis. Trends Biochem. Sci., 22(4), 118−123.
  5. S.M., Helenius A. (1989) Protein oligomerization in the endoplasmic reticulum. Annu. Rev. Cell Biol, 5, 277−307.
  6. S., Maurizi M.R., Gottesman S. (1999) Posttranslational quality control: folding, refolding, and degrading proteins. Science, 286(5446), 1888−1893.
  7. L.M., Leipe D.D., Koonin E.V., Aravind L. (2004) Evolutionary history and higher order classification of AAA+ ATPases. J. Struct. Biol, 146(1−2), 11−31.
  8. F., Duguet M. (1995) A 200-amino acid ATPase module in search of a basic function. Bioessays, 17(7), 639−650.
  9. A. (1997) Sequence analysis of the AAA protein family. Protein Sci., 6(10), 2043−2058.
  10. S., Latterich M. (1998) The AAA team: related ATPases with diverse functions. Trends Cell. Biol., 8(2), 65−71.
  11. Lupas A. N, Martin J. (2002) AAA proteins. Curr. Opin. Struct. Biol, 12(6), 746−753.
  12. Frickey T, Lupas A.N. (2004) Phylogenetic analysis of AAA proteins. J. Struct. Biol., 146(1−2), 2−10.
  13. Zhang X, Shaw A, Bates P.A., Newman R. H, Gowen В., Orlova E, Gorman M. A, Kondo H., Dokumo P., Lallv J., Leonard G, Meyer H, van Heel M, Freemont P. S. (2000) Structure of the AAA ATPase p97. Mol. Cell, 6(6), 1473−1484.
  14. Lenzen C.U., Steinmann D, Whiteheart S. W, Weis W.I. (1998) Crystal structure of the hexamerization domain of N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein. Cell, 94(4), 525−536.
  15. Yu R. C, Hanson P. I, Jahn R. Brunger A.T. (1998) Structure of the ATP-dependent oligomerization domain of N-ethylmaleimide sensitive factor complexed with ATP. Nat. Struct. Biol., 5(9), 803−81 1.
  16. Supp D. M, Witte D. P, Potter S. S, Brueckner M. (1997) Mutation of an axonemal dynein affects left-right asymmetry in inversus viscerum mice. Nature, 389(6654), 963−966.
  17. Neuwald A.F.-Aravind L, Spouge J. L, Koonin E.V. (1999) AAA+: A class of chaperone-like ATPases associated with the assembly, operation, and disassembly of protein complexes. Genome Res., 9(1), 27−43.
  18. Guenther B, Onrust R" Sali A, O’Donnell M, Kuriyan J. (1997) Crystal structure of the 5' subunit of the clamp-loader complex of E. coli DNA polymerase III. Cell, 91(3), 335−345.
  19. Bochtler M, Hartmann C, Song H. K, Bourenkov G. P, Bartunik H. D, Huber R. (2000) The structures of HslU and the ATP-dependent protease HsIU-HsIV. Nature, 403(6771), 800−805.
  20. Li J, Sha B. (2002) Crystal structure of?. coli HsplOO ClpB nucleotide-binding domain 1 (NBD1) and mechanistic studies on ClpB ATPase activity. J. Mol. Biol, 318(4), 1127−1137.
  21. S., Brzozowski A.M., Verma C., Karata K., Ogura Т., Wilkinson A.J. (2002) The crystal structure of the AAA domain of the ATP-dependent protease FtsH of Escherichia coli at 1.5 A resolution. Structure (Camb), 10(8), 1073−1083.
  22. H., Tsuchiya D., Makyio H., Yoshida M., Morikawa K. (2002) Hexameric ring structure of the ATPase domain of the membrane-integrated metal loprotease FtsH from Thermus thermophilus HB8. Structure (Camb), 10(10), 1415−1423.
  23. Liu J., Smith C.L., DeRyckere D., DeAngelis K., Martin G.S., Berger J.M. (2000) Structure and function of Cdc6/Cdcl8: implications for origin recognition and checkpoint control. Mol. Cell, 6(3), 637−648.
  24. D.A., Lindquist S.L. (2002) Analysis of the AAA sensor-2 motif in the C-terminal ATPase domain of Hspl04 with a site-specific fluorescent probe of nucleotide binding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(5), 2732−2737.
  25. M.R., Stege P., Scheffzek K., Wittinghofer A. (1997) Confirmation of the arginine-finger hypothesis for the GAP-stimulated GTP-hydrolysis reaction of Ras. Nat. Struct. Biol., 4(9), 686−689.
  26. S.M., Fass D. (1999) Crystal structure of the Secl8p N-terminal domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(26), 14 759−14 764.
  27. May A.P., Misura K.M., Whiteheart S.W., Weis W.I. (1999) Crystal structure of the amino-terminal domain ofN-ethylmaleimide-sensitive fusion protein. Nat. Cell. Biol., 1(3), 175−182.
  28. Yu R.C., Jahn R., Brunger A.T. (1999) NSF N-terminal domain crystal structure: models ofNSF function. Mol. Cell, 4(1), 97−107.
  29. Castillo R.M., Mizuguchi K, Dhanaraj V., Albert A., Blundell T.L., Murzin A.G. (1999) A six-stranded double-yP barrel is shared by several protein superfamilies. Structure Fold Des., 7(2), 227 236.
  30. Т., Whiteheart S.W., Wilkinson A.J. (2004) Conserved arginine residues implicated in ATP hydrolysis, nucleotide-sensing, and inter-subunit interactions in AAA and AAA+ ATPases. J. Struct. Biol., 146(1−2), 106−112.
  31. Hartl F.U., Hayer-Hartl M. (2002) Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein. Science, 295(5561), 1852−1858.
  32. B.H. (2002) Контроль качества: белки и органеллы. Биохимия, 67(2), 205−219.
  33. P., Houry W.A. (2004) Chaperone networks in bacteria: analysis of protein homeostasis in minimal cells. J. Struct. Biol, 146(1−2), 79−89.
  34. M.R. (2002) Love it or cleave it: tough choices in protein quality control. Nat. Struct. Biol., 9(6), 410−412.
  35. D.A., Mogk A., Bukau B. (2002) Protein folding and degradation in bacteria: to degrade or not to degrade? That is the question. Cell. Mol. Life Sci., 59(10), 1607−1616.
  36. A. (2003) Protein unfolding~an important process in vivo? Curr. Opin. Struct. Biol, 13(1), 98−109.
  37. R., Bukau B. (2003) Proteolysis in prokaryotes: protein quality control and regulatory principles. Mol. Microbiol., 49(6), 1451−1462.
  38. J., Bukau В., Mogk A. (2004) Unscrambling an egg: protein disaggregation by AAA+ proteins. Microb. Cell. Fact., 3(1), 98−109.
  39. J.M., Bewley M.C. (2002) Protein quality control in bacterial cells: integrated networks of chaperones and ATP-dependent proteases. Genet. Eng. (NY), 24, 17−47.
  40. S., Maurizi M.R., Wickner S. (1997) Regulatory subunits of energy-dependent proteases. Cell, 91(4), 435−438.
  41. E.C., Glover J.R., Singer M.A., Lindquist S. (1996) HSPlOO/Clp proteins: a common mechanism explains diverse functions. Trends Biochem. Sci., 21(8), 289−296.
  42. Mogk A., Dougan D, Weibezahn J., Schlieker C., Turgay K., Bukau B. (2004) Broad yet high substrate specificity: the challenge of AAA+ proteins. J. Struct. Biol., 146(1−2), 90−98.
  43. Lee S., Sowa M.E., Choi J.M., Tsai F.T. (2004) The ClpB/Hspl04 molecular chaperone a protein disaggregating machine. J. Struct. Biol., 146(1−2), 99−105.
  44. A., Bukau B. (2004) Molecular chaperones: structure of a protein disaggregase. Curr. Biol, 14(2),"R78−80.
  45. F., Maurizi M.R., Belnap D.M., Koesis E., Booy F.P., Kessel M., Steven A.C. (1998) At sixes and sevens: characterization of the symmetry mismatch of the CIpAP chaperone-assisted protease. J. Struct. Biol., 123(3), 248−259.
  46. Т., Mogk A., Langen H., Goloubinoff P., Bukau B. (2001) Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Mol. Microbiol., 40(2), 397−413.
  47. J., Gruber M., Lupas A.N. (2004) Coiled coils meet the chaperone world. Trends Biochem. Sci., 29(9), 455−458.
  48. Lee S, Sowa M.E., Watanabe Y.H., Sigler P.B., Chiu W., Yoshida M., Tsai F.T. (2003) The structure of ClpB: a molecular chaperone that rescues proteins from an aggregated state. Cell, 115(2), 229−240.
  49. K.C., Waller P.R., Sauer R.T. (1996) Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science, 271(5251), 990−993.
  50. Gottesman S., Roche E., Zhou Y" Sauer R.T. (1998) The ClpXP and CIpAP proteases degrade proteins with carboxy-terminal peptide tails added by the SsrA-tagging system. Genes Dev., 12(9), 1338−1347.
  51. Flynn J. M, Levchenko I., Seidel M., Wickner S.H., Sauer R.T., Baker T.A. (2001) Overlapping recognition determinants within the ssrA degradation tag allow modulation of proteolysis. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 98(19), 10 584−10 589.
  52. A. (1992) The N-end rule. Cell, 69(5), 725−735.
  53. Flynn J.M., Neher S.B., Kim Y.I., Sauer R.T., Baker T.A. (2003) Proteomic discovery of cellular substrates of the ClpXP protease reveals five classes of ClpX-recognition signals. Mol. Cell, 11(3), 671−683.
  54. Lo J.H., Baker T.A., Sauer R.T. (2001) Characterization oftheN-terminal repeat domain of Escherichia coli ClpA-A class I Clp/HSPlOO ATPase. Protein Sci., 10(3), 551−559.
  55. Singh S. K, Rozycki J., Ortega J., Ishikawa T, Lo J, Steven A. C, Maurizi M.R. (2001) Functional domains of the ClpA and ClpX molecular chaperones identified by limited proteolysis and deletion analysis. J. Biol. Chem., 276(31), 29 420−29 249.
  56. Тек V., Zolkiewski M. (2002) Stability and interactions of the ami no-terminal domain of ClpB from Escherichia coli. Protein Sci., 11(5), 1192−1198.
  57. M.E., Zolkiewski M. (2002) Site-directed mutagenesis of conserved charged amino acid residues in ClpB from Escherichia coli. Biochemistiy, 41(37), 1 1277−1 1283.
  58. В., Wawrzynow A., Puzewicz J., Georgopoulos C., Zylicz M. (2001) Structure-function analysis of the zinc-binding region of the Clpx molecular chaperone. J. Biol. Chem., 276(22), 18 843 18 848.
  59. U.A., Thibault G., Tuite A., Houry W.A. (2003) The N-terminal zinc binding domain of ClpX is a dimerization domain that modulates the chaperone function. J. Biol. Chem., 278(49), 48 981−48 990.
  60. H.K., Hartmann C., Ramachandran R., Bochtler M., Behrendt R., Moroder L., Huber R. (2000) Mutational studies on HslU and its docking mode with HslV. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(26), 14 103−14 108.
  61. К won A.R., Kessler B.M., Overkleeft H.S., McKay D.B. (2003) Structure and reactivity of an asymmetric complex between HslV and I-domain deleted HslU, a prokaryotic homolog of the eukaryotic proteasome. J. Mol. Biol., 330(2), 185−195.
  62. S.G., Shrader Т.Е. (1998) Functional role of the N-terminal region of the Lon protease from Mycobacterium smegmatis. Biochemistiy, 37(32), 11 255−11 263.
  63. W., Skinner M.M., Dierksen K.P., Scott J.M., Trempy J.E. (1999) A conserved domain in Escherichia coli Lon protease is involved in substrate discriminator activity. J. Bacterioi, 181(7), 2236−2243.
  64. D.A., Mogk A., Zeth K., Turgay K., Bukau B. (2002) AAA+ proteins and substrate recognition, it all depends on their partner in crime. FEBSLett., 529(1), 6−10.
  65. I., Seidel M., Sauer R.T., Baker T.A. (2000) A specificity-enhancing factor for the ClpXP degradation machine. Science, 289(5488), 2354−2356.83
  66. Wah D.A., Levchenko I., Baker T.A., Sauer R.T. (2002) Characterization of a specificity factor for an AAA+ ATPase: assembly of SspB dimers with ssrA-tagged proteins and the ClpX hexamer. Chem Biol, 9(11), 1237−1245.
  67. Wah D.A., Levchenko I., Rieckhof G.E., Bolon D.N., Baker T.A., Sauer R.T. (2003) Flexible linkers leash the substrate binding domain of SspB to a peptide module that stabilizes delivery complexes with the AAA+ ClpXP protease. Mol Cell, 12(2), 355−363.
  68. Dougan D.A., Weber-Ban E., Bukau B. (2003) Targeted delivery of an ssrA-tagged substrate by the adaptor protein SspB to its cognate AAA+ protein ClpX. Mol Cell, 12(2), 373−380.
  69. Song H.K., Eck M.J. (2003) Structural basis of degradation signal recognition by SspB, a specificity-enhancing factor for the ClpXP proteolytic machine. Mol. Cell, 12(1), 75−86.
  70. Muffler A., Fischer D., Altuvia S., Storz G., Hengge-Aronis R. (1996) The response regulator RssB controls stability of the sigma (S) subunit of RNA polymerase in Escherichia coli. EMBOJ., 15(6), 1333−1339.
  71. Y., Gottesman S., Hoskins J.R., Maurizi M.R., Wickner S. (2001) The RssB response regulator directly targets sigma(S) for degradation by ClpXP. Genes Dev., 15(5), 627−637.
  72. Tang M., Shen X., Frank E.G., O’Donnell M., Woodgate R., Goodman M.F. (1999) UmuD'(2)C is an error-prone DNA polymerase, Escherichia coli pol V. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(16), 89 198 924.
  73. M. Rasulova F., Maurizi M.R., Woodgate R. (2000) Subunit-specific degradation of the UmuD/D' heterodimer by the ClpXP protease: the role of trans recognition in UmuD' stability. EMBOJ. 19(19). 5251−5258.
  74. A., Nomura K., Ohtomo R., Kato J., Ikeda Т., Takiguchi N., Ohtake H., Kornberg A. (2001) Role of inorganic polyphosphate in promoting ribosomal protein degradation by the Lon protease in E. coli. Science, 293(5530), 705−708.
  75. D.A., Reid B.G., Horwich A.L., Bukau B. (2002) ClpS, a substrate modulator of the ClpAP machine. Mol. Cell, 9(3), 673−683.
  76. Zeth K" Ravelli R.B., Paal K., Cusack S., Bukau В., Dougan D.A. (2002) Structural analysis of the adaptor protein ClpS in complex with the N-terminal domain of ClpA. Nat. Struct. Biol, 9(12), 906.911.
  77. Т. Mogk A., Dougan D.A., Bukau В., Turgay K. (2003) MecA, an adaptor protein necessary for ClpC chaperone activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(5), 2306−2311.
  78. Persuh M., Turgay K., Mandic-Mulec I., Dubnau D. (1999) The N- and C-terminal domains of MecA recognize different partners in the competence molecular switch. Mol. Microbiol., 33(4), 886 894.
  79. Persuh M., Mandic-Mulec J" Dubnau D. (2002) A MecA paralog, YpbH, binds ClpC, affecting both competence and sporulation. J. Bacteriol., 184(8), 2310−2313.
  80. Kondo H., Rabouille C, Newman R., Levine T.P., Pappin D, Freemont P., Warren G. (1997) p47 is a cofactor forp97-mediated membrane fusion. Nature, 388(6637), 75−78.
  81. Hetzer M, Meyer H.H., Walther T.C., Bilbao-Cortes D., Warren G., Mattaj l.W. (2001) Distinct AAA-ATPase p97 complexes function in discrete steps of nuclear assembly. Nat. Cell. Biol., 3(12), 1086−1091.
  82. Koegl M., Hoppe T, Schlenker S., Ulrich H.D., Mayer T.U., Jentsch S. (1999) A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell, 96(5), 635−644.
  83. Rouiller 1., Butel V.M., Latterich M., Milligan R.A., Wilson-Kubalek E.M. (2000) A major conformational change in p97 AAA ATPase upon ATP binding. Mol Cell, 6(6), 1485−1490.
  84. H.H., Shorter J.G., Seemann J., Pappin D., Warren G. (2000) A complex of mammalian ufdl and npl4 links the AAA-ATPase, p97, to ubiquitin and nuclear transport pathways. EMBO J., 19(10), 2181−2192.
  85. Van Melderen L., Gottesman S. (1999) Substrate sequestration by a proteolytically inactive Lon mutant. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(11), 6064−6071.
  86. H.H., Королева Е. П., Ротанова T.B. (2000) Биоорган, химия, 26(2), 83−96.
  87. S. (2003) Proteolysis in bacterial regulatory circuits. Annu. Rev. Cell Dev. Biol, 19, 565−87.
  88. S., Maurizi M.R. (1992) Regulation by proteolysis: energy-dependent proteases and their targets. Microbiol. Rev., 56(4), 592−621.108
  89. M.R. (1992) Proteases and protein degradation in Escherichia coli. Experientia, 48(2), 178−201.
  90. S. (1996) Proteases and their targets in Escherichia coli. Amu. Rev. Genet., 30, 465 506.
  91. A.L. (1992) The mechanism and functions of ATP-dependent proteases in bacterial and animal cells. Eur. J. Biochem., 203(1−2), 9−23.
  92. A.L., Moerschell R.P., Chung C.H., Maurizi M.R. (1994) ATP-dependent protease La (lon) from Escherichia coli. Methods Enzymol, 244, 350−375.
  93. C.H., Goldberg A.L. (1982) DNA stimulates ATP-dependent proteolysis and protein-dependent ATPase activity of protease La from Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79(3), 795−799.
  94. M.F., Henderson G.W., Markovitz A. (1981) ATP hydrolysis-dependent protease activity of the lon (capR) protein of Escherichia coli K-12. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78(8), 47 284 732.
  95. Fu G.K., Smith M.J., Markovitz D.M. (1997) Bacterial protease Lon is a site-specific DNA-binding protein. J. Biol. Chem., 272(1), 534−538.
  96. OguraT., Wilkinson A.J. (2001) AAA+ superfamily ATPases: common structure-diverse function. Genes Cells, 6(7), 575−597.
  97. Т., Yamanaka K., Murata K., Suzaki Т., Bouloc P., Kato A., Niki H., Hiraga S., Ogura T. (1993) Topology and subcellular localization of FtsH protein in Escherichia coli. J. Bacteriol., 175(5), 1352−1357.
  98. Akiyama Y., Yoshihisa Т., Ito K. (1995) FtsH, a membrane-bound ATPase, forms a complex in the cytoplasmic membrane of Escherichia coli. J. Biol. Chem., 270(40), 23 485−23 490.
  99. Akiyama Y, Kihara A, Tokuda H, Ito K. (1996) FtsH (HflB) is an ATP-dependent protease selectively acting on SecY and some other membrane proteins. J. Biol. Chem., 271(49), 3 119 631 201.
  100. Herman C, Lecat S, D’Ari R, Bouloc P. (1995) Regulation of the heat-shock response depends on divalent metal ions in an hflB mutant of Escherichia coli. Mol. Microbiol, 18(2), 247−255.1. P3
  101. Makyio H, Niwa H, Motohashi K, Taguchi H, Yoshida M. (2002) Stabilization of FtsH-unfolded protein complex by binding of ATP and blocking of protease. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2%(), 8−12.
  102. Bruckner R. C, Gunyuzlu P. L, Stein R.L. (2003) Coupled kinetics of ATP and peptide hydrolysis by Escherichia coli FtsH protease. Biochemistiy, 42(36), 10 843−10 852.
  103. Yamada-lnagawa T, Okuno T, Karata K, Yamanaka K, Ogura T. (2003) Conserved pore residues in the AAA protease FtsH are important for proteolysis and its coupling to ATP hydrolysis. J. Biol Chem., 278(50), 50 182−50 187.
  104. Saikawa N, Akiyama Y, Ito K. (2004) FtsH exists as an exceptionally large complex containing HflKC in the plasma membrane of Escherichia coli. J. Struct. Biol, 146(1−2), 123−129.
  105. Okuno T, Yamada-lnagawa T, Karata K, Yamanaka K, Ogura T. (2004) Spectrometric analysis of degradation of a physiological substrate sigma32 by Escherichia coli AAA protease FtsH. J. Struct. Biol, 146(1−2), 148−154.
  106. Nixon P. J, Barker M, Boehm M, de Vries R, Komenda J. (2005) FtsH-mediated repair of the photosystem II complex in response to light stress. J. Exp. Bot., 56(411), 357−363.
  107. Hwang B. J, Woo K. M, Goldberg A.L., Chung C.H. (1988) Protease Ti, a new ATP-dependent protease in Escherichia coli, contains protein-activated ATPase and proteolytic functions in distinct subunits. J. Biol Chem., 263(18), 8727−8734.
  108. Maurizi M.R., Clark W.P., Kim S. H, Gottesman S. (1990) Clp P represents a unique family of serine proteases. J. Biol. Chem., 265(21), 12 546−12 552.
  109. M.W., Maurizi M.R. (1994) Activity and specificity of Escherichia coli CIpAP protease in cleaving model peptide substrates. J. Biol. Chem., 269(27), 18 201−18 208.
  110. Maurizi M.R., Thompson M.W., Singh S.K., Kim S.H. (1994) Endopeptidase Clp: ATP-dependent Clp protease from Escherichia coli. Methods Enzymol., 244, 314−331.
  111. J.R., Рак M., Maurizi M.R., Wickner S. (1998) The role of the ClpA chaperone in proteolysis by CIpAP. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(21), 12 135−12 140.
  112. Beuron F., Maurizi M.R., Belnap D.M., Kocsis E., Booy F. P, Kessel M., Steven A.C. (1998) Ai sixes and sevens: characterization of the symmetry mismatch of the CIpAP chaperone-assisted protease. J. Struct. Biol, 123(3), 248−259.
  113. J., Harding J.A., Flanagan J.M. (1998) Crystal structure determination of Escherichia coli ClpP starting from an EM-derived mask. J. Struct. Biol, 124(2−3), 151−163.
  114. Weber Ban E.U.,-Reid B.G., Miranker A.D., Horwich A.L. (1999) Global unfolding of a substrate protein by the HsplOO chaperone ClpA. Nature, 401(6748), 90−93.
  115. J.R., Singh S.K., Maurizi M.R., Wickner S. (2000) Protein binding and unfolding by the chaperone ClpA and degradation by the protease CIpAP. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(16), 88 928 897.
  116. Hoskins J.R., Kim S.Y., Wickner S. (2000) Substrate recognition by the ClpA chaperone component of CIpAP protease. J. Biol. Chem., 275(45), 35 361−35 367.
  117. Reid B.G., Fenton W.A., Horwich A.L., Weber-Ban E.U. (2001) ClpA mediates directional translocation of substrate proteins into the ClpP protease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(7), 37 683 772.
  118. Т., Beuron F., Kessel M., Wickner S., Maurizi M.R., Steven A.C. (2001) Translocation pathway of protein substrates in CIpAP protease. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 98(8), 4328−4333.
  119. J.R., Yanagihara K., Mizuuchi K., Wickner S. (2002) CIpAP and ClpXP degrade proteins with tags located in the interior of the primary sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(17), 11 037−11 042.
  120. Xia D., Esser L., Singh S.K., Guo F., Maurizi M.R. (2004) Crystallographic investigation of peptide binding sites in the N-domain of the ClpA chaperone. J. Struct. Biol, 146(1−2), 166−179.
  121. G., Rozycki J., Singh S.K., Ginsburg A., Maurizi M.R. (2005) The molecular chaperone, ClpA, has a single high affinity peptide binding site per hexamer. J. Biol. Chem., 280(13), 12 221−12 230.
  122. Gottesman S, Roche E., Zhou Y., Sauer R.T. (1998) The ClpXP and ClpAP proteases degrade proteins with carboxy-terminal peptide tails added by the SsrA-tagging system. Genes Dev., 12(9), 1338−1347.
  123. R., Kessel M., Beuron F., Steven A.C., Maurizi M.R. (1998) Enzymatic and structural similarities between the Escherichia coli ATP-dependent proteases, ClpXP and ClpAP. J. Biol. Chem., 273(20), 12 476−12 481.
  124. Kim Y.I., Burton R.E., Burton B.M., Sauer R.T., Baker T.A. (2000) Dynamics of substrate denaturation and translocation by the ClpXP degradation machine. Mol. Cell, 5(4), 639−648.
  125. Singh S.K., Grimaud R, Hoskins J.R., Wickner S., Maurizi M.R. (2000) Unfolding and internalization of proteins by the ATP-dependent proteases ClpXP and ClpAP. Proc. Natl Acad. Sc<. USA, 97(16), 8898−8903.
  126. Kim Y.I., Levchenko I., Fraczkowska K., Woodruff R.V., Sauer R.T., Baker T.A. (2001) Molecular determinants of complex formation between Clp/Hspl 00 ATPases and the ClpP peptidase. Nat. Struct. Biol, 8(3), 230−233.
  127. Flynn J.M., Neher S.B., Kim Y.I., Sauer R.T., Baker T.A. (2003) Proteomic discovery of cellular substrates of the ClpXP protease reveals five classes of ClpX-recognition signals. Mol. Cell., 11(3), 671−683.
  128. U.A., Thibault G., Tuite A., Houry W.A. (2003) The N-terminal zinc binding domain of ClpX is a dimerization domain that modulates the chaperone function. J. Biol. Chem., 278(49), 48 981−48 990.
  129. Kim D.Y., Kim K.K. (2003) Crystal structure of ClpX molecular chaperone from Helicobacter pylori. J. Biol. Chem., 278(50), 50 664−50 670.
  130. S., Hoskins J.R., Wickner S. (2005) Binding and degradation of heterodimeric substrates by ClpAP and ClpXP. J. Biol. Chem., 280(7), 5449−5455.
  131. J.A., Baker T.A., Sauer R.T. (2005) Partitioning between unfolding and release of native domains during ClpXP degradation determines substrate selectivity and partial processing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102(5), 1390−1395.
  132. Yoo S.J., Shim Y.K., Seong I.S., Seol J.H., Kang M.S., Chung C.H. (1997) Mutagenesis of two N-terminal Thr and five Ser residues in HslV, the proteolytic component of the ATP-dependent HslVU protease. FEBSLett., 412(1), 57−60.
  133. M., Pfeifer G., Santarius U., Muller S.A., Huang H.C., Engel A., Baumeister W., Goldberg A.L. (1997) The ATP-dependent HslVU protease from Escherichia coli is a four-ring structure resembling the proteasome. Nat. Struct. Biol., 4(2), 133−139.
  134. Yoo S.J., Seol J.H., Seong I.S., Kang M.S., Chung C.H. (1997) ATP binding, but not its hydrolysis, is required for assembly and proteolytic activity of the HslVU protease in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun., 238(2), 581−585.
  135. Sousa M.C., Kessler B.M., Overkleeft H.S., McKay D.B. (2002) Crystal structure of HslUV complexed with a vinyl sulfone inhibitor: corroboration of a proposed mechanism of allosteric activation of HslV by HslU. J. Mol. Biol., 318(3), 779−785.
  136. Seong I.S., Kang M.S., Choi M.K., Lee J.W., Koh O.J., Wang J., Eom S.H., Chung C.H. (2002) The C-terminal tails of HslU ATPase act as a molecular switch for activation of HslV peptidase. J. Biol. Chem., 277(29), 25 976−25 982.
  137. Ramachandran R., Hartmann C., Song H.K., Huber R, Bochtler M. (2002) Functional interactions of HslV (ClpQ) with the ATPase HslU (ClpY). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(11), 7396−7401.
  138. Kuo M.S., Chen K. P, Wu W.F. (2004) Regulation of RcsA by the ClpYQ (HslUV) protease in Escherichia coli. Microbiology', 150(Pt 2), 437−446.
  139. Kwon A.R., Trame C.B., McKay D.B. (2004) Kinetics of protein substrate degradation by HslUV. J. Struct. Biol., 146(1−2), 141−147.
  140. R.E., Baker T.A., Sauer R.T. (2005) Nucleotide-dependent substrate recognition by the AAA+ HslUV protease. Nat. Struct. Mol. Biol., 12(3), 245−251.
  141. Azim M.K., Goehring W., Song H.K., Ramachandran R, Bochtler M., Goettig P. (2005) Characterization of the HslU chaperone affinity for HslV protease. Protein Sci., 14(5)6 1357−1362.
  142. Kang M.S., Lim B.K., Seong I.S., Seol J.H., Tanahashi N., Tanaka K. Chung C.H. (2001) The ATP-dependent CodWX (HslVU) protease in Bacillus subtilis is an N-terminal serine protease. EMBOJ., 20(4), 734−742.
  143. Kang M.S., Kim S.R., Kwack P., Lim B.K., Ahn S.W., Rho Y.M., Seong I.S., Park S.C., Eom S.H., Cheong G.W., Chung C.H. (2003) Molecular architecture of the ATP-dependent CodWX protease having an N-terminal serine active site. EMBOJ., 22(12), 2893−2902.
  144. R. (1970) In vivo degradation of nonsense fragments in E. coli. Nature, 228(277), 1151−1154.
  145. M., Nishihara К., Yanagi H., Yura Т. (1997) Synergistic roles of HslVU and other ATP-dependent proteases in controlling in vivo turnover of ст32 and abnormal proteins in Escherichia coli. J. Bacteriol., 179(23), 7219−7225.
  146. Liu J., Cosby W.M., ZuberP. (1999) Role of Lon and ClpX in the post-translational regulation of a a subunit of RNA polymerase required for cellular differentiation in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol., 33(2), 415−428.1 or
  147. S., Gottesman S. (1983) Protein degradation in Escherichia coli: the lon gene controls the stability of sulA protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80(2), 358−362.
  148. Canceill D., Dervyn E., Huisman 0. (1990) Proteolysis and modulation of the activity of the cell division inhibitor SulA in Escherichia coli lon mutants. J. Bacteriol, 172(12), 7297−7300.
  149. Sonezaki S" Ishii Y., Okita K., Sugino Т., Kondo A., Kato Y. (1995) Overproduction and purification of SulA fusion protein in Escherichia coli and its degradation by Lon protease in vitro. Appl. Microbiol Biotechnol, 43(2), 304−309.
  150. Frank E.G., Ennis D.G., Gonzalez M., Levine A. S, Woodgate R. (1996) Regulation of SOS mutagenesis by proteolysis. Proc. Nail. Acad. Sci. USA, 93(19), 10 291−10 296.
  151. M., Frank E.G., Levine A.S., Woodgate R. (1998) Lon-mediated proteolysis of the Escherichia coli UmuD mutagenesis protein: in vitro degradation and identification of residues required for proteolysis. Genes Dev., 12(24), 3889−3899.
  152. Torres-Cabassa A.S., Gottesman S. (1987) Capsule synthesis in Escherichia coli K-12 is regulated by proteolysis. J. Bacteriol, 169(3), 981−989.
  153. K.P., Marks J., Chen D.D., Trempy J.E. (1994) Evidence for structural conservation of Lon and Res A. J. Bacteriol, 176(16), 5126−5130.
  154. Summers M.L., Botero L.M., Busse S.C., McDermott T.R. (2000) The ++Sinorhizobium meliloti Lon protease is involved in regulating exopolysaccharide synthesis and is required for nodulation of alfalfa. J. Bacteriol., 182(9), 2551−2558.
  155. S. Gottesman M., Shaw J.E., Pearson M.L. (1981) Protein degradation in E. coli: the Lon mutation and bacteriophage A, N and ell protein stability. Cell, 24(1), 225−233.
  156. M.R. (1987) Degradation in vitro of bacteriophage A, N protein by Lon protease from Escherichia coli. J. Biol Chem., 262(6), 2696−2703.
  157. Leffers G.G., Jr, Gottesman S. (1998) Lambda Xis degradation in vivo by Lon and FtsH. J. Bacteriol, 180(6), 1573−1577.
  158. K.M., Kramer M., Grindley N.D. (1990) Role of instability in the cis action of the insertion sequence IS903 transposase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87(11), 4048−4052.
  159. Van Melderen L., Thi M.H., Lecchi P., Gottesman S., Couturier M., Maurizi M.R. (1996) ATP-dependent degradation of CcdA by Lon protease. Effects of secondary structure and heterologous subunit interactions. J. Biol. Chem., 271(44), 27 730−27 738.198
  160. H., Gerdes K. (1999) Toxin-antitoxin systems homologous with relBE of Escherichia co//plasmid P307 are ubiquitous in prokaryotes. J. Mol. Biol., 285(4), 1401−1415.
  161. A.S., Rawlings D.E. (1998) Efficiency of the pTF-FC2 pas poison-antidote stability system in Escherichia coli is affected by the host strain, and antidote degradation requires the Lon protease. J. Bacteriol., 180(20), 5458−5462.
  162. J., Uhlin B.E. (1999) Differential protease-mediated turnover of H-NS and StpA revealed by a mutation altering protein stability and stationary-phase survival of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(19), 10 776−10 781.
  163. L., Elliott M., Elliott T. (1999) Conditional stability of the HemA protein (glutamyl-tRNA reductase) regulates heme biosynthesis in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol, 181(4), 1211−1219.
  164. L., Wilson S., Elliott Т. (1999) A mutant HemA protein with positive charge close to the N terminus is stabilized against heme-regulated proteolysis in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol, 181(19), 6033−6041.
  165. Coux О, Tanaka K, Goldberg A.L. (1996) Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem., 65, 801−847.
  166. W., Wolf D.H. (1996) Proteasomes: destruction as a programme. Trends Biochem. Sci., 21(3), 96−102.
  167. M. (1996) Ubiquitin-dependent protein degradation. Annu. Rev. Genet., 30, 405 439.
  168. A.L., Siepmann T.J. (1997) Pathways of ubiquitin conjugation. FASEBJ., 11(14), 12 571 268.
  169. C.M. (1997) Targeting of substrates to the 26S proteasome. FASEBJ., 11(13), 10 551 066.
  170. L., Fagan J.M., Goldberg A.L. (1987) Demonstration of two distinct high molecular weight proteases in rabbit reticulocytes, one of which degrades ubiquitin conjugates. J. Biol. Chem. 262(6), 2451−2457.
  171. R., Pratt G., Rechsteiner M. (1987) Purification of two high molecular weight proteases from rabbit reticulocyte lysate. J. Biol. Chem., 262(17), 8303−8313.
  172. E., Ganoth D., Armon Т., Hershko A. (1989) ATP-dependent incorporation of 20S protease into the 26S complex that degrades proteins conjugated to ubiquitin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86(20), 7751−7755.
  173. A., Baumeister W., Dahlmann В., Kopp F. (1991) Localization of subunits in proteasomes from Thermoplasma acidophilum by immunoelectron microscopy. FEBS Lett., 290(1−2), 186−190.
  174. Lowe J., Stock D., Jap В., Zwickl P., Baumeister W., Huber R. (1995) Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science, 268(5210), 533−539
  175. Ciaverol S., Burlet-Schiltz O., Girbal-Neuhauser E., Gairin J.E., Monsarrat B. (2002) Mapping and structural dissection of human 20 S proteasome using proteomic approaches. Mol. Cell. Proteomics, 1(8), 567−578.
  176. M., Ditzel L., Lowe J., Stock D., Bochtler M., Bartunik H.D., Huber R. (1997) Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature, 386(6624), 463−471.
  177. M., Mizushima Т., Morimoto Y., Tomisugi Y., Tanaka K., Yasuoka N., Tsukihara T. (2002) The structure of the mammalian 20S proteasome at 2.75 A resolution. Structure (Camb), 10(5), 609−618.
  178. M. (1990) The multicatalytic proteinase complex, a major extralysosomal proteolytic system. Biochemistry, 29(45), 10 289−10 297.
  179. Heinemeyer W., Fischer M., Krimmer Т., Stachon U, Wolf D.H. (1997) The active sites of the eukaryotic 20 S proteasome and their involvement in subunit precursor processing. J. Biol. Chem., 272(40), 25 200−25 209.
  180. C.S., Hochstrasser M. (1997) Identification of the yeast 20S proteasome catalytic centers and subunit interactions required for active-site formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(14), 71 567 161.
  181. E., Lupas A., Stock D., Lowe J., Huber R., Baumeister W. (1995) Proteasome from Thermoplasma acidophilum: a threonine protease. Science, 268(5210), 579−582.
  182. Kisselev A. F, Akopian T. N, Castillo V, Goldberg A.L. (1999) Proteasome active sites allosterically regulate each other, suggesting a cyclical bite-chew mechanism for protein breakdown. Mol Cell, 4(3), 395−402.
  183. Groll M, Huber R. (2003) Substrate access and processing by the 20S proteasome core particle. Int. J. Biochem. Cell Biol, 35(5), 606−616.
  184. Dubiel W, Ferrell K, Pratt G, Rechsteiner M. (1992) Subunit 4 of the 26 S protease is a member of a novel eukaryotic ATPase family. J. Biol Chem., 267(32), 22 699−22 702.
  185. Wollenberg K, Swaffield J.C. (2001) Evolution ofproteasomal ATPases. Mol Biol Evol., 18(6). 962−974.
  186. Hershko A, Ciechanover A. (1998) The ubiquitin system. Ann. Rev. Biochem., 67, 425−479.
  187. Lee D. H, Goldberg A.L. (1998) Proteasome inhibitors: valuable new tools for cell biologists. Trends Cell. Biol., 8(10), 397−403.
  188. Ciechanover A, Heller H, Katz-Etzion R, Hershko A. (1981) Activation of the heat-stable polypeptide of the ATP-dependent proteolytic system. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 78(2), 761−765.
  189. Hershko A, Ciechanover A, Rose l.A. (1981) Identification of the active amino acid residue of the polypeptide of ATP-dependent protein breakdown. J. Biol. Chem., 256(4), 1525−1528.
  190. Chau V, Tobias J. W, Bachmair A, Marriott D, Ecker D. J, Gonda D. K, Varshavsky A. (1989) biquitin chain is confined to specific lysine in a targeted short-lived protein. Science, 243(4898), 1576−1583.
  191. A. (1996) Lessons from the discovery of the ubiquitin system. Trends Biochem. Sci., 21(11), 445−449.
  192. Hershko A, Ciechanover A. (1992) The ubiquitin system for protein degradation. Ann. Rev. Biochem., 61, 761−807.
  193. D., Zwickl P., Baumeister W. (1999) The 26S proteasome: a molecular machine designed for controlled proteolysis. Ann. Rev. Biochem., 68, 1015−1068.
  194. A., Finley D., Varshavsky A. (1986) In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue. Science, 234(4773), 179−186.
  195. A. (2005) Regulated protein degradation. Trends Biochem. Sci., 30(6), 283−286.
  196. A. (2000−2001) Recent studies of the ubiquitin system and the «N-end rule pathway. Han>ey Lect., 96. 93−116.
  197. S., Wells R., Rechsteiner M. (1986) Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science, 234(4774), 364−368.
  198. M., Rogers S.W. (1996) PEST sequences and regulation by proteolysis. Trends Biochem. Sci., 21(7), 267−271.24j GlotzerM., Murray A.W., Kirschner M.W. (1991) Cvclin is degraded by the ubiquitin pathway. Nature, 349(6305), 132−138.
  199. Tu G.F., Reid G.E., Zhang J.G., Moritz R.L., Simpson R.J. (1995) C-terminal extension of truncated recombinant proteins in Escherichia coli with a lOSa RNA decapeptide. J. Biol. Chem., 270(16), 9322−9326.
  200. Keiler K. C, SilberK.R., Downard K.M., Papayannopoulos LA, Biemann K, Sauer R.T. (1995) C-terminal specific protein degradation: activity and substrate specificity of the Tsp protease. Protein Sci, 4(8), 1507−1515.
  201. Maupin-Furlow J. A, Gil M. A, Karadzic I.M., Kirkland P.A., Reuter C.J. (2004) Proteasomes: perspectives from the Archaea. Front. Biosci., 9, 1743−1758.
  202. Maupin-Furlow J. A, Wilson H. L, Kaczowka S. J, Ou M.S. (2000) Proteasomes in the archaea: from structure to function. Front. Biosci., 5, D837−865.
  203. M., Brandstetter H., Bartunik H., Bourenkow G., Huber R. (2003) Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J. Mol. Biol, 327(1), 75−83.
  204. Zwickl P., Ng D., Woo K.M., Klenk H.P., Goldberg A.L. (1999) An archaebacterial ATPase, homologous to ATPases in the eukaryotic 26 S proteasome, activates protein breakdown by 20 S proteasomes. J. Biol Chem., 274(37), 26 008−26 014.
  205. Kenniston J A., Sauer R.T. (2004) Signaling degradation. Nat. Struct. Mol Biol, 11(9), 800−802.
  206. Ъ1 Prakash S., Tian L., Ratliff K.S., Lehotzky R.E., Matouschek A. (2004) An unstructured initiation site is required for efficient proteasome-mediated degradation. Nat. Struct. Mol Biol, 11(9), 830 837.
  207. J.A., Baker T.A., Fernandez J.M., Sauer R.T. (2003) Linkage between ATP consumption and mechanical unfolding during the protein processing reactions of an AAA+ degradation machine. Cell, 114(4), 511−520.
  208. R.E., Baker T.A., Sauer R.T. (2003) Energy-dependent degradation: Linkage between ClpX-catalyzed nucleotide hydrolysis and protein-substrate processing. Protein Sci., 12(5), 893−902.
  209. Barret A.J., Rawlings N.D., O’Brien E.A. (2001) The MEROPS database as a protease information system. J. Struct. Biol, 134(2−3), 95−102.
  210. Handbook of Proteolytic Enzymes. (1998) Barrett, A.J., Rawlings, N.D., and Woessner, J.F. (Eds), Acad. Press, London.
  211. А.Ю., Чистякова Jl.Г., Остроумова Н. И., Гуревич А. И., Антонов В. К. (1988) Клонирование, экспрессия и структура функционально активного укороченного гена lon Escherichia coli. Биоорган, химия, 14(3), 408−411 .
  212. А.Ю., Антонов В. К., Остроумова Н. И., Ротанова Т. В., Чистякова Л. Г. (1990) Клонирование, структура и экспрессия полноразмерного гена lon Escherichia coV кодирующего АТР-зависимую La-протеинэзу. Биоорган, химия, 16(7), 869−880.
  213. Chin D.T., GoffS.A., Webster Т., Smith Т., Goldberg A.L. (1988) Sequence of the lon gene in Escherichia coli. A heat-shock gene which encodes the ATP-dependent protease La. J. Biol. Chem. 263(24), 11 718−11 728.
  214. C.A. Выделение и характеристика АТР-зависимой La-протеиназы из Escherichia coli. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. ИБХ им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, М.1994 г.
  215. Т.В., Котова С. А., Америк А. Ю., Лыков И. П., Гинодман Л. М., Антонов В. К. (1994) АТР-зависимая протеиназа La из Escherichia coli. Биоорган, химия, 20(2), 114−125.
  216. L., Goldberg A.L. (1982) Protease La from Escherichia coli hydrolyzes ATP and proteins in a linked fashion. Proc. Nail. Acad. Sci. USA, 79(16), 4883−4887.
  217. B.A., Foley E.C., Henderson G.W., Markovitz A. (1981) Identification and purification of the Lon+ (capR+) gene product, a DNA-binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78(4), 2043−2047.
  218. L., Goldberg A.L. (1985) Protease La, the lon gene product, cleaves specific fluorogenic peptides in an ATP-dependent reaction. J. Biol. Chem., 260(22), 12 022−12 028.
  219. В.К. Химия протеолиза. 2-е изд. М.: Наука. 1991. 504 с. t
  220. A.Yu., Antonov V.K., Gorbalenya A.E., Kotova S.A., Rotanova T.V., Shimbarevich E.V. (1991) Site-directed mutagenesis of La protease. A catalytically active serine residue. FEBS Lett., 287(1−2), 211−214.
  221. Walker J.E., Saraste M., Runswick M.J., Gay „N.J. (1982) Distantly related sequences in the alpha- and beta-subunits of ATP synthase, myosin, kinases and other ATP-requiring enzymes and a common nucleotide binding fold. EMBOJ., 1(8), 945−951.278
  222. T.B. (1999) Структурно-функциональные особенности АТР-зависимой Lon-протеиназы из Escherichia coli. Биоорган, химия, 25(12), 883−891.
  223. Patterson J., Vineyard D., Thomas-Wohlever J., Behshad R., Burke M., Lee 1. (2004) Correlation of an adenine-specific conformational change with the ATP-dependent peptidase activity of Escherichia coli Lon. Biochemistiy, 43(23), 7432−7442.
  224. M.F., Henderson G.W., Doane L.L., Markovitz A. (1984) DNA-stimulated ATPase activity on the lon (CapR) protein. J. Bacteriol, 158(1), 195−201.
  225. Fu G.K., Smith M.J., Markovitz D.M. (1997) Bacterial protease Lon is a site-specific DNA-binding protein. J. Biol. Chem., 272(1), 534−538.
  226. Liu Т., Lu В., Lee I“ Ondrovicova G» Kutejova E., Suzuki C.K. (2004) DNA and RNA binding by the mitochondrial Lon protease is regulated by nucleotide and protein substrate. J. Biol. Chem. 279(14), 13 902−13 910.
  227. M.E. (1989) Location of enzymatic and DMA-binding domains on E. coli protease La. FEBS Lett., 244(1), 31−33.
  228. Lee A.Y., Hsu C.H., Wu S.H. (2004) Functional domains of Brevibacillus thermoruber Lon protease for oligomerization and DNA binding: role ofN-terminal and sensor and substrate discrimination domains. J. Biol. Chem., 279(33), 34 903−34 912.
  229. StarkovaN.N., Koroleva E.P., Rumsh L.D., Ginodman L.M., Rotanova T.V. (1998) Mutations in the proteolytic domain of Escherichia coli protease Lon impair the ATPase activity of the enzyme. FEBSLett., 422(2), 218−220.
  230. T.B., Мельников Э. Э., ЦирульниковК.Б. (2003) Каталитическая диада Ser-Lys в активном центре АТР-зависимой Lon-протеиназы Escherichia coli. Биоорган, химия, 29(1), 9799.
  231. Т.В. (2002) Пептидгидролазы с каталитической диадой Ser-Lys. Сходство и различия активных центров АТР-зависимых Lon-протеиназ, репрессоров LexA, сигнальных пептидаз и протеиназ С-концевого процессинга. Вопр. мед. химии, 48(6), 541−552.
  232. M., Dalbey R.E. (1997) Catalytic hydroxyl/amine dyads within serine proteases. Trends Biochem. Sci., 22(1), 28−31.
  233. C., Mundt E. Gorbalenya A.E. (2000) A non-canonical Lon proteinase lacking the ATPase domain employs the Ser-Lys catalytic dyad to exercise broad control over the life cycle of a double-stranded RNA virus. EMBOJ., 19, 114−123.
  234. Lejal N., Da Costa В., Huet J.C., Delmas B. (2000) Role of Ser-652 and Lys-692 in the protease activity of infectious bursal disease virus VP4 and identification of its substrate cleavage sites. J. Gen. Virol, 81,983−992.
  235. Wagner 1., van Dyck L., Savel’ev A.S., Neupert W., Langer T. (1997) Autocatalytic processing of the ATP-dependent PIM1 protease: crucial function of a pro-region for sorting to mitochondria. EMBOJ., 16(24), 7317−7325.
  236. D.E., Shockley K.R., Chang L.S., Levy R.D. Michel IK., Conners S.B., Kelly R.M. (2002) Proteolysis in hyperthermophilic microorganisms. Archaea, 1, 63−74.-)QO
  237. Т., Eguchi Т., Atomi H., Imanaka T. (2002) A membrane-bound archaeal Lon protease displays ATP-independent proteolytic activity towards unfolded proteins and ATP-dependent activity for folded proteins. J. Bacteriol, 184, 3689−3698.
  238. H., Tamura N., Tamura Т., Zwickl P. (2004) Mutational analysis of conserved AAA+ residues in the archaeal Lon protease from Thermoplasma acidophilum. FEBS Lett., 574, 161−166.
  239. Besche H, Zwickl P. (2004) The Thermoplasma acidophilum Lon protease has a Ser-Lys dyad active site. Eur. J. Biochem, 271(22), 4361−4365.
  240. Rawlings N. D, Barrett A.J. (1994) Families of serine peptidases. Methods Enzymol, 244, 19−61.
  241. Silber K. R, Keiler K. C, Sauer R.T. (1992) Tsp: a tail-specific protease that selectively degrades proteins with nonpolar С termini. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(1), 295−299.
  242. Keiler K. C, Sauer R.T. (1996) Sequence determinants of C-terminal substrate recognition by the Tsp protease. J. Biol. Chem., 271(5), 2589−2593.
  243. Bencini D. A, Wild J. R, O’Donovan G.A. (1983) Linear one-step assay for the determination of orthophosphate. Anal. Biochem. 132(2), 254−258.
  244. Fischer H, Glockshuber R. (1993) ATP hydrolysis is not stoichiometrically linked with proteolysis in the ATP-dependent protease La from Escherichia coli. J. Biol Chem., 268(30), 22 502−22 507.
  245. Goldberg A. L, Waxman L. (1985) The role of ATP hydrolysis in the breakdown of proteins and peptides by protease La from Escherichia coli. J. Biol. Chem., 260(22), 12 029−12 034.
  246. Lemasters J. J, Hackenbrock C.R. (1977) Kinetics of product inhibition during firefly luciferase luminescence. Biochemistry, 16(3), 445−447.
  247. Menon A. S, Goldberg A.L. (1987) Binding of nucleotides to the ATP-dependent protease La from Escherichia coli. J. Biol. Chem., 262(31), 14 921−14 928.
  248. Menon A. S, Goldberg A.L. (1987) Protein substrates activate the ATP-dependent protease La by promoting nucleotide binding and release of bound ADP. J. Biol. Chem., 262(31), 14 929−14 934.
  249. Smith C. K, Baker T. A, Sauer R.T. (1999) Lon and Clp family proteases and chaperones share homologous substrate-recognition domains. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96(12), 6678−6682.
  250. K.H., Goldberg A.L. (1981)? coli contains eight soluble proteolytic activities, one being ATP dependent. Nature, 292(5824), 652−654.
  251. A., Ishii Y., Kato Y., Koriuchi K. (1997) Functional dissection of a cell-division inhibitor, SulA, of Escherichia coli and its negative regulation by Lon. Mol. Gen. Genet., 254(4), 351−357.
  252. К.Б., Мельников Э. Э., Ротанова Т. В. (2003) Протеолиз, сопряженный с гидролизом АТР. Регуляция активности протеолитических центров Ьоп-протеиназы Escherichia coli. Биоорган, химия, 29 (5), 486−494.
  253. Luo Y., Pfuetzner R.A., Mosimann S., Paetzel M., Frey E.A., Cherney M., Kim В., Little J.W., Strynadka N.C. (2001) Crystal structure of LexA: a conformational switch for regulation of self-cleavage. Cell, 106(5), 585−594.
  254. M., Dalbey R.E., Strynadka N.C. (2002) Crystal structure of a bacterial signal peptidase apoenzyme: implications for signal peptide binding and the Ser-Lys dyad mechanism. J. Biol. Chem., 277(11), 9512−9519.
  255. Peat T.S., Frank E.G., McDonald J.P., Levine A.S., Woodgate R" Hendrickson W.A. (1996) Structure of the UmuD' protein and its regulation in response to DNA damage. Nature, 380(6576), 727−730.
  256. Bell C. E, Frescura P, Hochschild A, Lewis M. (2000) Crystal structure of the lambda repressor C-terminal domain provides a model for cooperative operator binding. Cell, 101(7), 801−811.
  257. Dodson G, Wlodawer A. (1998) Catalytic triads and their relatives. Trends Biochem. Sci., 23(9), 347−352.
  258. J. (1977) Serine proteases: structure and mechanism of catalysis. Annu. Rev. Biochem., 46, 331−358.
  259. Frigerio F, Coda A, Pugliese L, Lionetti C, Menegatti E, Amiconi G, Schnebli H. P, Ascenzi P, Bolognesi M. (1992) Crystal and molecular structure of the bovine a-chymotrypsin egiin с complex at 2.0 A resolution. J. Mol. Biol, 225(1), 107−123.
  260. Wlodawer A, Li M, Dauter Z, Gustchina A, Uchida K, Oyama H, Dunn B. M, Oda K. (2001) Carboxyl proteinase from Pseudomonas defines a novel family of subtilisin-like enzymes. Nat. Struct. Biol, 8(5), 442−446.
  261. Wlodawer A, Li M, Gustchina A, Oyama H, Dunn B. M, Oda K. (2003) Structural and enzymatic properties of the sedolisin family of serine-carboxyl peptidases. Acta Biochim. Pol., 50(I), 81−102.
  262. James M.N.G. (1994) in Proteolysis and Protein Turnover (Bond J.C. and Barrett A. J, eds). Portland Press, Brookfield, VT, pp. 1−8.
  263. Paetzel M, Dalbey R. E, Strynadka N.C. (1998) Crystal structure of a bacterial signal peptidase in complex with a beta-lactam inhibitor. Nature, 396(6707), 186−190.
  264. Li M., Rasulova F., Melnikov E.E., Rotanova T.V., Gustchina A., Maurizi M.R., Wlodawer A. (2005) Crystal structure of the N-terminal domain of E. coli Lon protease. Protein Sci., 14(11), 2895−2900.
  265. J., Fritish E.F., Manniatis T. (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. NY.
  266. M.O. (1972) Atlas of protein sequence and structure. Natl. Biom. Res. Foundation. Washington D. C.
  267. Зз4 Практическая химия белка. Ред. А. Дарбре. Москва. «Мир». 1989. 621 стр.
  268. М.М. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72, 248−254.
  269. J36 Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227(5259), 680−685.
  270. Aciba Acinetobacter sp. Mycpn — Mycoplasma pneumoniae
  271. Agrtu Agrobacterium tumefaciens Myxxa — Myxococcus xanthus
  272. Aquae Aquifex aeolicus Nemen — Neisseria meningitidis
  273. Azobr Azospirillum brasilense Oceih — Oceanobacillus iheyensis
  274. Bacbr Brevibacillus choshinensis Pasmu — Pasteurella multocida
  275. Bacsu Bacillus subtilis Psaer — Pseudomonas aeruginosa
  276. Bahal Bacillus halodurans Psflu — Pseudomonas fluorescens
  277. Borbu Borrelia burgdorferi Pssyr — Pseudomonas syringae
  278. Brthe Brevibacillus thermoruber Ralso — Ralstonia solanacearum
  279. Bruab Brucella abortus Rhime — Rhizobium meliloti
  280. Brume Brucella melitensis Ricco — Rickettsia conorii
  281. Brusu Brucella suis Ricpr — Rickettsia prowazekii
  282. Bucai Buchnera sp. APS Salen — Salmonella enterica
  283. Bucap Buchnera aphidicola Salty — Salmonella typhimurium
  284. Camje Campylobacter jejuni Sheon — Shewanella oneidensis
  285. Caucr Caulobacter crescentus Shifl — Shigella flexneri
  286. Chlmu Chlamydia muridant Thmar — Thermotoga maritima
  287. Chlpn Chlamydia pneumoniae Thete — Thermoanaerobacter tengcongensis
  288. Chltr Chlamydia trachomatis Ththe — Thermits thermophilic
  289. Cloac- Clostridium aceiobut):licum Trepa Treponema pallidum
  290. CI ope Clostridium perfringens UrepI — Ureaplasma pannim
  291. Derad Deinococcus radiodurans Vibpa — Vibrio parahaemolyticus
  292. Ecoli- Escherichia coli Vibch Vibrio cholerae
  293. Erwam Erwinia amylovora IVigbr — Wigglesworthia brevipalpis
  294. Haein Haemophilus influenzae Xanax -Xanthomonas axonopodis
  295. Helpj Helicobacter pylori J99 Xanca — Xanthomonas campestris
  296. Helpy Helicobacter pylori Xyfas -Xylella fastidiosa
  297. Mezlo Mesorhizobhim loii Yerpe — Yersinia pestis
  298. Mycge Mycoplasma geniialium Zymob — Zymomonas mobilis
  299. Mycsm Mycobacterium smegmatis1. Архебактерни
  300. Metac Methanosarcina acetivorans Metma — Methanosarcina mazei
  301. Metba Methanosarcina barkeri1. Эукарноты
  302. Arath Arabidopsis thaliana Musmu — Mus musculus
  303. Caeel Caenorhabditis elegans Parbr — Paracoccidioides brasiliensis
  304. Dichl Dichanthelium lanuginosum Ratno — Rattus norvegicus
  305. Drome Drosophila melanogaster Schpo — Schizosaccharomyces pombe
  306. Human Homo sapiens Spiol — Spinacia oleracea
  307. Maize Zea mays Yeast — Saccharomyces cerevisiae1. Подсемейство LonB1. Архебактерни
  308. Arcfu Archaeoglobus fulgidus Metth — Methanobacterium thermoautotrophicum
  309. Ferae Ferroplasma acidarmanus Pyrab — Pyrococcus abyssi
  310. Halnl- Halobacterium sp. (strain NRC-1) Pyrfu Pyrococcus furiosus
  311. Metac Methanosarcina acetivorans Pyrho — Pyrococcus horikoshii
  312. Metba Methanosarcina barkeri Pyrko — Pyrococcus kodakaraensis
  313. Metja Methanocaldococcus jannaschii Theac — Thermoplasma acidophilum
  314. Metma Methanosarcina mazei Thevo — Thermoplasma volcanium1. Бактерии
  315. Ecoli Escherichia coli Thete — Thermoanaerobacter tengcongensis
  316. Haein Haemophilus influenzae Vibch — Vibrio cholerae |
  317. Psaer Pseudomonas aerugenosa Yerpe — Yersinia pestis
  318. Thmar Thermotoga maritima |
  319. Индексы последовательностей Ьоп-протеиназ в базе данных MEROPS
  320. Источник № в MEROPS Ms Источник № в MEROPS j №№ Источник № в MEROPS1. Подсемейство LonA 1. S16.001
  321. Ecoli MER00485 19 Bruab MER04081 37 Psaer MER13631
  322. Erwam MER01854 20 Brume MER 16 826 38 Wigbr MER22332→ j Salen MER15901 21 Rhime MER06310 39 Ricpr MER04853
  323. Salty MER19173 22 Mezlo MER13944 40 Myxxa MER00489
  324. Shifl MER22207 23 Agrtu MER14845 41 Bacbr MER00486
  325. Yerpe MER15528 24 Azobr MER01922 41a Brthe MER28409
  326. Pasmu MER14272 25 Nemen MER11561 42 Bacsu MER00487
  327. Vibch MER13793 26 Xanax MER19521 43 Aquae MER04291
  328. Sheon MER22360 27 Xanca MER 19 484 44 Zymob MER06062
  329. Vibpa MER02633 28 Derad MER 11 632 45 Cloac MER 14 944
  330. Haein MER01855 29 Xyfas MER11927 46 Clope MER16919
  331. Bucap MER 19 922 30 Caucr MER02686 47 Thmar MER05473
  332. Bucai MER14152 31 Ththe MER06064 76a Metma MER19389
  333. Ralso MER 17 422 32 Camje MER04637 76b Metac MER17669
  334. Psflu MER06061 л ^ jj Helpy MER03852 I 76c Metba MER25812
  335. Pssyr MER03937 34 Helpj MER04637 | 48 Ricco MER15975
  336. Aciba MER04647 35 Bahal MER13686 49 Thete MER19291
  337. Brusu MER22170 36 Oceih MER219601. S16.002
  338. Drome MER11218 55 Yeast MER00496 ! 60 Arath4 MER11057
  339. Musmul MER 17 095 56 Chlpn MER11660 61 Arath5 MER11056
  340. Ratno MER17098 57 Chlmu MER11889 62 Maize2 MER04077
  341. Human 1 MER00495 58 Chltr MER04519 63 Schpo MER02048
  342. Caeel MER04130 59 Arath2 MER034421. SI 6.003
  343. Arathl MER04594 66 Spiol MER03443
  344. Maize 1 MER03530 67 Dichl MER 165 821. SI 6.004
  345. Urepl MER11088 69 Mycge MER00488 70 Mycpn MER040761. SI 6.006
  346. Human2 MER14970 72 Musmu2 MER160851. S16.00X
  347. Trepa MER04543 75 Borbul MER02224 78 Parbr MER26305
  348. Borbu2 | MER04236 77 Mycsm MER041471. Подсемейство LonB 1. S16.005
  349. Pyrab MER06309 6 Thevo MER 13 946 11 Metba MER25817
  350. Pyrho MER04506 7 Theac MER13848 12 Metth MER26292→ j Pyrfu MER17402 8 Ferae MER26292 13 Metja MER03359
  351. Pyrko MER20049 9 Metma MER19361 14 Halnl MER13822
  352. Arcfu MER03868 10 Metac MER176711. S16.00X
  353. Thete MER20277 17 Ecoli MER03018 19 Thmar MER05474
  354. Haein MER01856 18 Psaer MER13768 20 Vibch MER137991. S16. № Источ- АТ- Сник АК АК
  355. Ecoli 1 MNPERSERIE IPVLPLRDVV VYPHMVIPLF VGREKSIRCL 40
  356. Ег warn 1 MNPERSERIE IPVLPLRDVV VYPHMVIPLF VGREKSIRCL 40
  357. Salen 1 MNPERSERIE IPVLPLRDVV VYPHMVIPLF VGREKSIRCL 40
  358. Salty 1 MNPERSERIE IPVLPLRDVV VYPHMVIPLF VGREKSIRCL 40
  359. Shlfl 1 MSSDY LAEIKLRESS MNPERSERIE IPVLPLRDVV VYPHMVIPLF VGREKSIRCL 55
  360. Yerpe 1 MNPERSERIE IPVLPLRDVV VYPHMVIPLF VGREKSIRCL 40
  361. Pasmu 1 MSAKKTQQQS IPVLPLRDVV VFPYMVMPLF VGRPKSIRSL 40
  362. Vibch 1 MNLERSERIE IPVLPLRDVV VYPHMVIPLF VGREKSIQCL 40
  363. Sheon 1 MTLEP. EAHIE LPVLPLRDVV VYPHMVIPLF VGREKSIRCL 40
  364. Vi bp a 1 MNLERSERIE IPVLPLRDVV VYPHMVIPLF VGREKSISCL 40
  365. Haein 1 MAKNTQRT MPVLPLRDVV VFPYMVMPLF VGRAKSINAL 38
  366. Bucap 1 MNSERSERIK IPVLPLRDVV VYPHMVIPLF VGRKKSIHCI 40
  367. Bucai 1 MNSERSERIT IPVLPLRDVV IYPHMVIPLF VGRQKSIKCI 40
  368. Ralso 1 MSG TQLLPAEQIR LPLLPLRDVV VFPHMVIPLF VGRPKSIKAL 43
  369. Psflu 1 MKTTIE LPLLPLRDVV VYPHMVIPLF VGREKSIEAL 36
  370. Pssyr 1 MKTTIE LPLLPLRDVV VYPHMVIPLF VGREKSIEAL 36
  371. Aciba 1 MSENIMKV ETLEPQVQSV LPLLALRDVV VYPHMQIALF VGREKSINAV 48
  372. Brusu 1 M TGIEQKTPVG GSETGGADGL YAVLPLRDIV VFPHMIVPLF VGREKSIRAL 51
  373. Bruab 1 M TGIEQKTPVG GSETGGADGL YAVLPLRDIV VFPHMIVPLF VGREKSIRAL 51
  374. Brume 1 MG RKARERTSVM TGIEQKTPVG GSETGGADGL YAVLPLRDIV VFPHMIVPLF VGREKSIRAL 62
  375. Rhime 1 MTN KTSPATESAT YPVLPLRDIV VFPHMIVPLF VGREKSIRAL 43
  376. Mezlo 1 MKGWTMA KISKAPSDGV FAVLPLRDIV VFPHMIVPLF VGREKSIRAL 47
  377. Agrtii 1 MT NITSAASGGT YPVLPLRDIV VFPHMIVPLF VGREKSIRAL 42
  378. Azobr 1 MKEAQ SMFEIPRGAL YPVPPLRDIV VFPHMIVPLF VGREKSVRAL 45
  379. Wemen 1 MTQ KEKHFEEYAA. LATLPLRDVV VYPHMVLPLF VGRPKSIAAL 43
  380. Xanax 1 MAQSQPEVLD LPVLPLRDVV VFPHMVIPLF VGRDKSMRAL 40
  381. Xanca 1 MAQSQPEILD LPVLPLRDVV VFPHMVIPLF VGRDKSMRAL 40
  382. Derad 1 MIWE LPVVALRNIV ILPGVTMNVD VGRPKSKRAV 34
  383. Xyfas 1 MPEWP HNGAIGFSVA VNSMHYTGVL MTQSSQKTLD LQVLPLRDVV VFPYMVIPLF VGREKSMRAL 66
  384. Caucr 1 MSELRT LPVLPLRDIV VFPHMVVPLF VGRDKSVRAL 36
  385. Th the 1 MKDFLRLE LPVLPLRNTV VLPHTTTGVD VGRLKSKRAV 3 8
  386. Camje 1 MQ IEEIQNYPAN LPVLVEDELF LYPFMITPIF INDSSNMKAL 42
  387. Helpy 1 MTEDFPKI LPLLVEEDTF LYPFMIAPIF LQNNASIKAV 38
  388. Helpj 1 MTEDFPKI LPLLVEEDTF LYPFMIAPIF LQNNASIKAV 38
  389. Bahal 1 MAESVRRN IPLLPLRGLL VFPTMVLHLD VGRKKSVEAL 38
  390. Ocexh 1 MTTEFKQ IPLLPLRGLL VFPSMVLHLD VGRDKSIASI 37
  391. Psaer 1 M SDQDVNPEHI SDAQPAGTGL VLPGQTLPTT LYVIPIHNRP FFPAQVLPVI VNEEPWAETL 61
  392. Wi gbr 1 MNPEHSQQID IPVLPLRDVV VYPHMVVPLF VGREKSIRCL 40
  393. Ricpr 1 MNKKS LPLMALRDMV VFPGVIAPIF VGRKKSLQALSRTT
  394. Myxxa 1 MFFGRDD KKEAQKRGLT VPLLPLRDII VFPHMVVPLF VGREKSIAALKDAMA
  395. Bacbr 1 MGERSGKRE LPLLPLRGLL VYPTMVLHLD VGREKSIRAL 39
  396. Br the 1 MGERSGKRE IPLLPLRGLL VYPSMVLHLD VGREKSVRAL 39
  397. Bacsu 1 MAEELKRS IPLLPLRGLL VYPTMVLHLD VGRDKSVQAL 38
  398. Aquae 1 MNELFQ TPQVEAGIKE YPLMPLRDIV IFPTMVQPLF VGRRFSIRAI 4645 Zymob
  399. Cloac 1 MNQENKV LPLIPLRGLI VFPYMVVHFD VGRDKSIEAL 37
  400. Clope 1 MKEDKLI LPLIPLRGLT VFPNMVIYFD VGREKSIEAV 37
  401. Thmar 1 MS KKSKDTEKSF KILEKYASQQ EKELEIPDSL PCIPLRNGMG VFPNTVVPFY VGRTGSLIAL 62
  402. Me tma 1 MY SEQTYGNRES LVMPLFDIVV YPRSRAKFLA DKVTGEILLN 42
  403. Met ас MY TEQAENNRES LIMPLFEVVV YPKGRAKFLA DKVTGEILLA 42
  404. Metba 1 MRRLTMY PEQPDENRES IVMPLFEVVV YPKSRAKFLA DKVTGEILLN 47
  405. Ricco 1 MM iiKKSLPLMAL RDMVVFPGVI APIFVGRPKS LQALSHTTIS 42
  406. Caeel 96 RYPLFPGFIK KVDIVKDDNL KALIRRQLSL KQPYAGVFVK RDDENKEETI TSLSEVYPTG SFVQIIEVRD QGSVLELVLS AHRRIRALEP IDEITPKNET 195
  407. Yeast 207 VMKAIKEMLD RQQPYIGAFM LKNSEEDTDV ITDKNDVYDV GVLAQITSAF PSKDEKTGTE TMTALLYPHR RIKIDELFPP NEEKEKSKEQ AKDTDTETTV 306
  408. Chlpn 1 MDSTTN SDSPILDPNP EDVEKLLDES EEESEDQSTE P.LI.PSELFIL PI. NKRPFFPG MAAPILIESG PYYEVLKVLA KSSQKYIGLV LTKKENADIL 96
  409. Chlmu 1 MNSTNN TDSQNLDPNA SEVEKLLDES AEAEEKTD-D HTPPSELFIL PLNKRPFFPG MAAPLLIEAG PHYEVLTLLA KSSQKHIGLV LTKKEDANTL 95
  410. Ch i tr 1 MNSTNN TDSQNLDPNA SEVEKLLDES AEAEEKVD-D HTPPSELFIL PLNKRPFFPG MAAPLLIEAG PHYEVLTLLA KSSQKHIGLV LTKKEDANTL 95
  411. Ara th2 46 TSLGHRAFFC SEPTNGEAAA EAETKAVESD SEVSDSKSSS AIVPTNPRPE DCLTVLALPV PHRPLFPGFY MPIYVKDPKV LAALQESRRR QAPYAGAFLL 145
  412. ArathA 25 PVKNLLFKQL TLLTGWNRSS YELGRRSFSS DLDSDTKSST TTVSAKPHLD DCLTVIALPL PHKPLIPGFY MPIYVKDPKV LAALQESRRQ QAPYAGAFLL 124
  413. Arath5 58 LLLFRAPTQL TGWNRSSRDL LGRRVSFSDR SDGVDLLSSS PILSTNPNLD DSLTVIALPL PHKPLIPGFY MPIHVKDPKV LAALQESTRQ QSPYVGAFLL 157
  414. Maize2 37 RFCSNSSASD TEAAVAEAEA KAEDASAAEG EADSKASSAI VPTSTNIDDC LSVIALPLPH RPLFPGFYMP INVKDQKLLQ ALIENRKRSA PYAGAFLVKD 136
  415. Schpo 162 LLALPIARRP LFPGFYKAIV TKNPSVSEAI KELIKKRQPY IGAFLLKDEN TDTDVITNID QVYPVGVFAQ ITSIFPAKSG SEPALTAVLY PHRRIRITEL 261 003 68 Arathl 1 M AETVELPSRL AILPFRNKVL LPGAIIRIRC TSHSSVTLVE QELWQKEEKG LIGILPVRDD AEGSSIGTMI NPGAGSDSGE RSLKFLVGTT 91
  416. Malzel 1 MS DSPVELPSRL AVLPFRNKVL LPGAIVRIRC TNPSSVKLVE QELWQKEEKG LIGVLPVRD- SEATAVGSLL SPGVGSDSGEG GSKVGGSAVE 92
  417. Spiol 1 M AEAVELPSRL GILAFRNKVL LPGAIIRIRC TSPSSVKLVE QELWQREEKG LIGIVPVRDA SESASVAPVL YPGGGTDSGE RNVKSQPGLS 91
  418. Dichl 1 MA DSPVELPGRL AILPFRNKVL LPGAIVRIRC TNPSSVKLVE QELWQKEEKG LIGVLPVRD- SEAAAVGSLL SPGVGSDSGE GGSKAGGSGE 91 004 72 Urepl 1 MKKPILISRA IVVLPYETTT IEVGRPKSIQ AIDLAKQSSS KEIIIISQKD 50
  419. Mycge 1 MPV TKKSQILVVR GQVIFPFVPF SLDVGRPRSR KIIKALKTLK TKRLVLVTQK 53
  420. Mycpn 1 MPA VKKPQILVVR NQVIFPYNGF ELDVGRERSK KLIKALKNLK TKRLVLVTQK 53 006 75 Human2
  421. Musmu2 1 MSSVSPIQI PSRLPLLLTH ESVXLPGSTM RTSVDTARNL QLVRSRLLKG TSLQSTILGV 59
  422. ООХ 77 Trepa 24 AVENPSASAV SDGEERATFA PEVAPQTDTE SAQGAAQESE PEVQRAGEAE KGVPEKAKAV VPLDELLPQK VHLIPLTGRP IYPGIFTPLL IS DEDDVRS V 123
  423. Borbu2 1 MQLKNLGQK SYMKSILNMI KNRKEDLPIV ILKENVLFPN ITLWVTFDNE YVINSIAQSM 59
  424. Borbul 1 M DESKKARSGD KKKEKAVAGI LPHSNKPARV PLIAVPSHPV FPGMFIPIVL ISDSDMKAID YAMKGNGIIA 71
  425. Mycsm 1 MAEAKT VPVLFLNDSI VLPGMVVPIE 26
  426. MAAST GYVRLWAAAR MAAST GYVRLWAAAR
  427. VRLWGAARCW VLRRPMLAAA MYRAG AVLLRGATRT
  428. TKTLSTVART TRAIQYYRSI KDEDVKIVPD EKDTDNDVEP
  429. CWVLRRPLLA VTGGRVPSAS CWVLRRPLLA VTGGRVPSAS
  430. GGRVRTAAGA WLLRGQRTCD RLLAAASAHQ SFATFSQRNQ
  431. AKTAAVSQRR FASTLTVRDV TRDDEIVNKD QEGEASKNSP.
  432. NKPLDNKNDP KKTHNEDESH TNESLPSTDK KKKKDNDDFK
Заполнить форму текущей работой

Сессия? Спокойно!