Антитела. 
Генетика иммуноглобулинов

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ УКРАИНЫ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ Реферат на тему «Антитела. Генетика иммуноглобулинов»

Выполнила: Колодезная Татьяна Харьков 2012

Антитела

Антитела (иммуноглобулины, ИГ, Ig) — это растворимые гликопротеины, присутствующие в сыворотке крови, тканевой жидкости или на клеточной мембране, которые распознают и связывают антигены. Иммуноглобулины синтезируются В-лимфоцитами (плазматическими клетками) в ответ на чужеродные вещества определенной структуры — антигены. Антитела используются иммунной системой для идентификации и нейтрализации чужеродных объектов — например, бактерий и вирусов. Антитела выполняют две функции: антигенсвязывающую функцию и эффекторную (например, запуск классической схемы активации комплемента и связывание с клетками), являются важнейшим фактором специфического гуморального иммунитета, состоят из двух лёгких цепей и двух тяжелых цепей. У млекопитающих выделяют пять классов иммуноглобулинов — IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, различающиеся между собой по строению и аминокислотному составу тяжелых цепей. Иммуноглобулины экспрессируются в виде мембраносвязанных рецепторов на поверхности В-клеток и в виде растворимых молекул, присутствующих в сыворотке и тканевой жидкости.

Антитела являются относительно крупными (~150 кДа — IgG) гликопротеинами, имеющими сложное строение. Состоят из двух идентичных тяжелых цепей (H-цепи, в свою очередь состоящие из VH, CH1, шарнира, CH2 и CH3 доменов) и из двух идентичных лёгких цепей (L-цепей, состоящих из VL и CL доменов). К тяжелым цепям ковалентно присоединены олигосахариды. При помощи протеазы папаина антитела можно расщепить на два Fab (англ. fragment antigen binding — антигенсвязывающий фрагмент) и один Fc (англ. fragment crystallizable — фрагмент, способный к кристаллизации). В зависимости от класса и исполняемых функций антитела могут существовать как в мономерной форме (IgG, IgD, IgE, сывороточный IgA) так и в олигомерной форме (димер-секреторный IgA, пентамер — IgM). Всего различают пять типов тяжелых цепей (б-, г-, д-, е-и мцепи) и два типа легких цепей (к-цепь и л-цепь).

На рисунке представлен общий план строения иммуноглобулинов: 1) Fab; 2) Fc; 3) тяжелая цепь; 4) легкая цепь; 5) антиген-связывающийся участок; 6) шарнирный участок Аутоантитела (аутоагрессивные антитела, аутологичные антитела) — антитела, способные взаимодействовать аутоантигенами, то есть с антигенами собственного организма. Могут образовываться спонтанно или вследствие перенесенных инфекций (например, вызванных Mycoplasma pneumoniae). Аутоантитела образуются при аутоиммунных заболеваниях, к которым относятся ревматоидный артрит, рассеянный склероз, системная красная волчанка и т. д. (более 40 заболеваний). В некоторых случаях аутоантитела начинают вырабатываться задолго до клинических проявлений заболевания.

Моноклональные антитела — антитела, вырабатываемые иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону, то есть произошедшими из одной плазматической клетки-предшественницы. Моноклональные антитела могут быть выработаны на почти любое вещество (в основном белки и полисахариды), которое антитело будет специфически связывать. Они могут быть далее использованы для детекции (обнаружения) этого вещества или его очистки. Моноклональные антитела широко используются в биохимии, молекулярной биологии и медицине. В случае их использования в качестве лекарства его название оканчивается наmab (от английского «monoclonal antibody»). Перспективным лекарственным средством, разработанном на основе моноклональных антител является Ипилимумаб или иначе Ервой, использующийся для лечения меланомы.

Поликлональные антитела к лимфоцитам, получают из сыворотки кроликов и других животных после иммунизации лимфоцитами или клетками тимуса человека. Механизм действия поликлональных антител заключается в разрушении лимфоцитов и снижении их числа в крови.

Генетика иммуноглобулинов

Индивидуальный организм здорового человека в течение жизни создает несколько миллионов вариантов антител по способности связывать разные антигены (потенциально 10¹⁶ антигенов). Наследуемое от родителей количество генетического материала (ДНК), предназначенного для программирования биосинтеза антител, не так уж велико — всего 120 структурных генов. Это наследуемое множество генов называют зародышевыми генами иммуноглобулинов, или зародышевой конфигурацией (germline configuration).

Разнообразие генетических кодов для миллионов вариантов вариабельных участков молекул иммуноглобулинов формируется в течение всей жизни в процессе дифференцировки В-лимфоцитов: в каждом отдельном В-лимфоците осуществляется своя уникальная рекомбинация ДНК из зародышевых генов, и трансляция РНК, и последующий синтез белка уже идут с персонального для каждого В-лимфоцита генетического кода V-области.

Феномен рекомбинации ДНК в в соматических клетках, по крайней мере насколько известно современной науке, строго уникален исключительно для лимфоцитов. Соматическая рекомбинация ДНК «ниспослана» только генам антигенраспознающих молекул лимфоцитов — иммуноглобулинов в В-лимфоцитах и рецептора Т-клеток для антигена в Т-лимфоцитах. Свойство случайности при рекомбинации соответствующей ДНК объясняет тот широко известный факт, что иммунная система «в лице» лимфоцитов распознает разные вещества, а не только инфекционные микроорганизмы.

Примерно 20 лет назад аналитическим электрофорезом фрагментированной ДНК обнаружили, что генетический материал для кодирования белков — иммуноглобулинов структурирован на сегменты, расположенные друг относительно друга на уловимом расстоянии. Во всех клетках тела, включая стволовую кроветворную, кроме начавших дифференцировку В-лимфоцитов, гены иммуноглобулинов навсегда остаются в «разорванном» состоянии, которое называют зародышевой конфигурацией. И только в В-лимфоцитах на самом раннем этапе их специальной дифференцировки начинается сложный генетический процесс объединения сегментов ДНК, предназначенных для кодирования разных частей молекулы иммуноглобулина — Vи C-фрагментов, причем по отдельности для каждой из 3 типов полипептидных цепей — двух типов легких (к и л) и тяжелой. Это и есть феномен рекомбинации ДНК в соматической клетке.

Структура генов иммуноглобулинов подробно изучена. Отдельные сегменты молекулярно клонирован, определено их число. Кодирующая ДНК для вариабельной части каждой из цепей иммуноглобулина собирается из сегментов, извлекаемых из трех отдельных кластеров: собственно V (вариабельный), а также D (diversity — разнообразие) у тяжелых цепей и J (joining — связующий).

Рекомбинацию ДНК иммуноглобулинов катализируют специальные ферменты — рекомбиназы (уникальные ферменты лимфоцитов). До начала процесса перестройки ДНК в клетке уже существуют генрегуляторные протеины — свои у Т-лимфоцитов и свои у В-лимфоцитов. Гены, кодирующие эти белки, называют мастер-генами. Субстратом для рекомбиназ служат определенные последовательности нуклеотидов в ДНК генов-мишеней. Эти последовательности фланкируют (т.е. расположены с какого-либо края) каждый отдельный сегмент генов-мишеней и их называют сигнальными для рекомбинации (rss — recombination signal sequence). Rss расположены с 3'-конца V-сегментов, с 5'-конца J-сегментов и с обеих сторон D-сегментов.

Самый первый акт расщепления цепи ДНК осуществляют два других специальных фермента лимфоцитов — гетеродимерные эндонуклеазы, кодируемые генами, называемыми RAG-1 и RAG-2 (recombination-activating genes). Репарацию разрывов ДНК катализируют, по крайней мере, 3 ядерных фермента: один называют аутоантигеном Ku, второй — ДНК-зависимой протеинкиназой, третий еще недостаточно охарактеризован.

В результате реакции рекомбинации в непрерывную последовательность ДНК соединяются по одному сегменту из V-, D-, J-областей — этот процесс называют VDJ-рекомбинацией. Вся остальная ДНК V-, D-, J-областей вырезается и выбрасывается из генома в виде кольцевых ДНК. Поэтому приобретение В-лимфоцитом в начале своей дифференцировки специфичности по потенциальному антигену происходит раз и навсегда и строго необратимо на уровне ДНК.

В каждом единичном В-лимфоците случается своя уникальная комбинация VDJ для тяжелой цепи и VJ — для каждой их легких цепей. В цельной молекуле иммуноглобулинов разные легкие и тяжелые цепи объединяются в тетрамер случайным образом.

Но это не все, что обеспечивает разнообразие антигенсвязывающих областей антител. Есть еще два молекулярных процесса: запланированная неточность связи сегментов V-D-J и запланированный гипермутагенез именно в V-генах иммуноглобулинов. Последнее свойство — гипермутагенез — отличает гены иммуноглобулинов даже от генов TCR: у TCR и комбинаторика сегментов, и неточность связи V-D-J, но не выявлен гипермутагенез. Под недостаточностью связи V-D-J понимают тот факт, что при формировании этих связей происходит добавление лишних некодируемых наследуемым генетическим кодом нуклеотидов. Их два вида: Р-нуклеотиды и N-нуклеотиды. Нуклеотиды Р (от palindromic sequences) возникают на концах сегментов при вырезании одноцепочечных петель ДНК и достройки «хвостов» ферментами репарации ДНК. Нуклеотиды N (от nontemplate-encoded)сле вырезания петли специальным ферментом лимфоцитов — терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TdT). Этот фермент достраивает от 1 до 20 дополнительных нуклеотидов, а ферменты репарации подстраивают комплементарные пары и лигируют (ковалентно продольно состыковывают) двухцепочечную «пристройку» ДНК с двухцепочечными Р-нуклеотидами. TdT экспрессируется недолго и на ранних стадиях дифференцировки В-лимфоцитов. Поэтому N-нуклеотиды характерны для тяжелых цепей, поскольку гены тяжелых цепей перестраиваются в первую очередь. Гены легких цепей перестраиваются во вторую очередь и в них N-нуклеотидов уже не находят.

«Платой» за эти попытки увеличить разнообразие антигенсвязывающих областей антител, является то, что в 2/3 случаев добавление некодируемых нуклеотидов сдвигает рамку считывания матричной (м)РНК так, что транскрипция белка становится невозможной. Это называют непродуктивной рекомбинацией генов иммуноглобулинов.

Гипермутагенез, процесс возникновения точечных мутаций, запланирован и имеет место не во время лимфопоэза В-лимфоцитов в костном мозге, а во время иммуногенеза и локализован в лимфоидных фолликулах периферических лимфоидных органов и тканей. Именно гипермутагенез генов V-области иммуноглобулинов и отбор В-лимфоцитов по силе связи Ig-рецептора с антигеном являютяс механизмом возрастания аффинности антител по мере прогрессивного развития, так называемого вторичного иммунного ответа. Интенсивность гипермутаций в VIg в В-лимфоцитах оценивают как замену одного нуклеотида из 1000 на один митоз: каждый второй В-лимфоцит клона в зародышевом центре приобретает точечную мутацию в VIg. Для всей остальной ДНК явление точечной мутации реализуется с частотой на 9 порядков ниже, т. е. одна замена нуклеотида на 10¹² пар нуклеотидов на митоз.

Процессы перестройки генов иммуноглобулинов в В-лимфоците отрегулированы так, что из двух родительских хромосом, в конечном счете, в одном В-лимфоците будет использован только единственный вариант как легкой, так и тяжелой цепи. Это явление называется аллельным исключением.

Первично перестроенные гены иммуноглобулинов одинаковы у всех незрелых В-лимфоцитов. Такие В-лимфоциты у птиц мигрируют в сумку Фабрициуса, где они интенсивно пролиферируют. В процессе митозов в уже перестроенных генах V-области создается разнообразие по механизму, называемому конверсией генов: фрагменты ДНК из перестроенной V-области одной из гомологичных хромосом обмениваются на фрагменты из непосредственной и ранее не использованной V-области второй из гомологичных хромосом.

Структурные гены константных частей полипептидных цепей иммуноглобулинов расположены в тех же хромосомах, что и V-, D-, J-гены, «ниже по течению». Для легких ки л-цепей существует по одному С-гену — С_к и СА. Стыковка нуклеотидного кода для Vи С-частей легких цепей происходит на уровне не ДНК, а РНК — по механизму сплайсинга первичного транскрипта РНК. Для каждого изотопа иммуноглобулинов есть свой отдельный С-ген.

Завершившие лимфопоэз, В-лимфоциты любого клона по антигенной специфичности экспрессируют иммуноглобулины только классов М и D. В результате альтернативного сплайсинга первичного транскрипта РНК образуются мРНК отдельно для тяжелых цепей IgМ и IgD, которые и транслируются в белок. Этим процессом заканчивается полноценный лимфопоэз В-лимфоцитов.

Переключение же на синтез иммуноглобулинов других изотипов (G, E, A) происходит уже в процессе развития иммунного ответа, т. е. после распознавания антигена и под воздействием определенных цитокинов Т-лимфоцитов и молекул клеточной мембраны Т-лимфоцитов. Существенно, что такое переключение идет опять по механизму рекомбинации ДНК: в ДНК к ранее и единожды перестроенной комбинации VDJ присоединяется какой-либо один из С-генов тяжелой цепи.

ДНК неиспользованных С-генов слева от использованного С-гена на этом этапе развития В-лимфоцита элиминируется в виде кольцевых структур. С этого момента судьба В-лимфоцита определена как по единственной антигенной специфичности, так и изотипу тяжелой цепи. Если из окружений продолжают поступать регулирующие переключение изотипов сигналы, то возможен еще акт переключения на изотип, С-ген которого «правее» в ДНК от уже экспрессированных С-генов. Если с инструкциями «покончено», В-лимфоцит вступает в терминальный этап своего развития: он становится плазматической клеткой — продуцентом больших количеств моноклонального секретируемого иммуноглобулина.

При переключении изотипа тяжелой цепи ДНК разрывается по так называемым областям переключения, расположенных в интронах перед каждым С-геном (за исключением С<5).

Молекулы иммуноглобулина одной и той же специфичности по антигену присутствуют в организме в двух физических состояниях — в растворе и на мембране клеток и в 3 формах:

ь в растворимой форме в крови и других биологических жидкостях;

ь на мембране В-лимфоцита в составе рецептора В-лимфоцитов для антигена;

ь в связи с клетками, но не в трансмембранном варианте, а связанными за Fc-конец Fc-рецептором клетки.

Трансмембранная и секретируемая формы иммуноглобулинов различаются по своему С-концу тяжелых цепей: в трансмембранной форме у тяжелых цепей молекулы есть лишние 25 остатков гидрофобных аминокислот, которые «заякоревают» молекулу в фосфолипидном бислое мембраны. Трансмембранная и секретируемые «версии» тяжелых цепей кодируются разными экзонами соответствующих С-генов. Экзонами называют структурные гены каждого из отдельных доменов полипептидной цепи. Последний экзон каждого С-гена содержит последовательности нуклеотидов для кодирования трансмембранного участка молекулы. Первичных транскрипт РНК дифференцирующего В-лимфоцита содержит все экзоны С-гена. Трансляция белка с полноразмерной мРНК обеспечивает биосинтез тяжелых цепей для трансмембранной формы. Но последний экзон может быть легко удален из первичного транскрипта РНК, и тогда будет транслироваться секретируемая форма иммуноглобулина. В зрелых плазмоцитах трансмембранная форма уже совсем не синтезируется, а только продуцируется секретируемая форма.

антитело чужеродный ген иммуноглобулин

Заключение

Иммуноглобулины — это растворимые гликопротеины, присутствующие в сыворотке крови, тканевой жидкости или на клеточной мембране, которые распознают и связывают антигены; синтезируются В-лимфоцитами в ответ на антигены.

Моноклональными антителами называют антитела, вырабатываемые иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону, то есть произошедшими из одной плазматической клетки-предшественницы. Поликлональные антитела к лимфоцитам, получают из сыворотки кроликов и других животных после иммунизации лимфоцитами или клетками тимуса человека. Выделяют также аутоантитела — антитела, способные взаимодействовать аутоантигенами, то есть с антигенами собственного организма.

Известные 5 классов иммуноглобулинов — IgM, IgG, IgA, IgE и IgD — построены по общему плану и включают две легкие и две тяжелые полипептидные цепи. Каждая цепь состоит из одного вариабельного и 3−4 (в зависимости от принадлежности к классу) константных доменов. Специфичность антител зависит от взаимодействия вариабельных доменов легких и тяжелых цепей. Генетический контроль структуры иммуноглобулинов осуществляется большим набором V-генов и незначительным числом дополнительных Dили J-мини-генов при формировании единого информационного участка в процессе реорганизации генома В-клеток лежит в основе вариабельности антител, меняющейся от белка к белку антигенсвязывающей специфичности. Количество V-генов, Dи J-мини-генов для тяжелых и легких цепей таково, что в условиях случайной рекомбинации возможно потенциальное образование 2,4×10⁸ отличающихся по специфичности антител. Этот уровень вариабельности достаточен для нейтрализации самого разнообразного набора антигенов.

1. В. Г. Галактионов. Иммунология: Учебник. — М. Изд-во МГУ. 1998 — 480 с.

2. Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н. Р., Гордон Д., Арвие Ж., Уильямс А. Ф. Антитела. Методы: Кн.1: Пер. с англ./Под ред. Д. Кэтти. — М.: Мир, 1991 — 287 с.

3. Хаитов Р. М., Игнатьева Г. А., Сидорович И. Г. Иммунология: Учебник — М.: Медицина, 2000 — 432 с.

4. Электронные статьи