Окислительный стресс характеризуется нарушением внутриклеточного баланса между образованием активных форм кислорода (АФК) и состоянием тканевой антиоксидантной защиты. Кислородные радикалы атакуют белки, ДНК, липидные компоненты клеточных мембран, тем самым нарушая функции и целостность клеток. Повышенный уровень свободных радикалов рассматривают как один из факторов развития многих нейродегенеративных заболеваний, а также процесса старения [Carney and Carney, 1994; Halliwell and Gutteridge, 1999].
Для исследования окислительного стресса применяются различные подходы, позволяющие выяснять молекулярные механизмы этого процесса как in vitro, так и in vivo. Один из таких подходов — использование линии животных, для метаболизма которых характерен повышенный стационарный уровень АФК, приводящий к ускоренному накоплению старческих признаков и уменьшению продолжительности жизни. Эта линия, выведенная путем близкородственного скрещивания из линии AKR/J [Takeda et al., 1994], носит название SAMP1 (Senescence Accelerated Mice Prone, Strain 1). Характерной особенностью животных этой линии является то, что они нормально развиваются до 4-месячного возраста, после чего наступает стадия ускоренного накопления старческих признаков. Контролем к данной линии является линия SAMR1 (Resistant).
Мыши указанной линии могут являться удобной моделью для инициации ряда нейродегенеративных заболеваний, в основе которых лежит свободнорадикальное повреждение тканей. Индукция окислительного стресса химическими агентами у животных с изначально нарушенным балансом АФК может представлять интерес для создания новых моделей нейродегенеративных заболеваний. Одним из таких заболеваний является паркинсонизм, в развитии которого окислительный стресс играет ведущую роль. Лекарственные препараты, которые применяются в клинике для лечения БП, недостаточно эффективны, и вызывают побочные эффекты при их длительном применении. Это обстоятельство требует создания новых экспериментальных моделей паркинсонизма, которые были бы близки к неврологическому процессу, протекающему у человека, и позволяли установить основные биохимические реакции, которые лежат в основе окислительного стресса.
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
III.1.1 Исследование параметров окислительного стресса в тканях мышей линий SAMP1 и SAMR1.
III.1.1.1 Уровень АФК в клетках мышей линии SAM. В опытах] использованы клетки костного мозга и нейроны, как наиболее чувствительные к действию АФК клетки, в которых можно значительно раньше наблюдать изменения метаболических процессов по сравнению с другими тканями. Хемилюминесцентным методом в клетках костного мозга и в изолированных нейронах мышей линии SAMP1 и SAMR1 был измерен стационарный и индуцированный ФМА уровень АФК, а также проведена оценка генерации АФК нейронами мозжечка при активации их глутаматных рецепторов аналогом глутамата NMDA.
Измеряя хемилюминесценцию клеток мышей двух исследуемых линий, мы обнаружили, что стационарный уровень свечения АФК в нейронах и в клетках костного мозга у SAMP1 в два раза выше, чем у контрольных животных SAMR1 (Рис. 8, 9А).
Добавление ФМА и NMDA к нейронам головного мозга мышей линии SAMR1 и SAMP1 вызывает генерацию АФК (Рис. 8).
Добавление ФМА в суспензию клеток костного мозга мышей также вызывает усиление хемилюминесценции как и в нейронах, при этом максимальная интенсивность ответа на ФМА клеток SAMP1 была существенно выше, чем клеток SAMR1 (Рис. 8, 9Б).
900 -г й 800 я.
700 а >f 600 а о 500.
X S 400.
2 300 ч ы? 200.
X 100 0.
SAMR1.
SAMP1.
Рис. 8. Уровень АФК в нейронах 12-дневных мышей линии SAMR1 и SAMP1: стационарный уровень АФК, уровень АФК через 8 мин после добавления ФМА (1 мкМ), генерация АФК в присутствии NMDA (500 мкМ) через 20 мин инкубации нейронов.
SAMR1 SAMP1 в 700 j.
§.
S а.
X U 500 а.
W.
V 400.
X.
X.
— 300.
S ч, а 200.
V.
0 4 0.
•SAMR1 -SAMP1.
1 2 4 6 7 8 10 Время, мин.
Рис. 9. Продукция АФК клетками костного мозга 8-месячных мышей линии SAMP1 и SAMR1: А — исходный уровень АФК, Б — генерация АФК в клетках костного мозга мышей в ответ на добавление ФМА.
Обращает на себя внимание то, что стационарный уровень и рост АФК в нейронах наблюдается на более ранней стадии онтогенеза, чем в клетках костного мозга, несмотря на то, что накопление старческих признаков у мышей линии SAMP1 наблюдается только с 4-х месячного возраста и в возрасте 12 дней животные исследуемых групп по морфологическим признакам неразличимы между собой. Это наблюдение позволяет предполагать, что изменения окислительного обмена в мозге являются первичными и в определенной степени предваряют (а, возможно, и обусловливают) нарушения окислительного обмена в других тканях.
Для клеток костного мозга мы определяли процент хромосомных! повреждений (хромосомных аберраций), которые являются результатом окислительных повреждений хромосом [Rodriguez et al., 1995]. Из Рис. 10 видно, что рост хромосомных аберраций у быстростареющих мышей наблюдается именно в том возрасте, когда отчетливо начинают проявляться морфологические признаки старения (6 месяцев), в дальнейшем уровень хромосомных аберраций продолжает значительно расти. К 8-месячному возрасту, их доля у SAMP1 оказалась почти вдвое больше, чем у контрольных животных линии SAMR1, где она оставалась на уровне, присущем молодым животным.
Таким образом, мы обнаружили существенное увеличение количества хромосомных аберраций в препаратах костного мозга мышей линии SAMP1 по сравнению с этим параметром, измеряемым у SAMR1. Этот факт оказался в полном соответствии с ростом продукции АФК в клетках костного мозга мышей линии SAMP1 по сравнению с контролем (см. Рис. 10).
1−2 мес.
6 мес.
8 мес.
Рис. 10. Хромосомные аберрации в клетках костного мозга мышей линий SAMP1 и SAMR1 на разных стадиях развития (* Р<0,05 -достоверность различий между SAMP1 и SAMR1).
Из литературы известно, что уровень делеций митохондриальной ДНК мозга у линии SAMP8, аналогичной изучаемой нами, был выше, чем у SAMR1 уже в возрасте 2 месяцев [Nishikawa et al., 1998]. В то же время, в печени животных линии SAMP1 более высокий уровень одиночных разрывов цепи ДНК (по сравнению с SAMR1) проявлялся только к 3-месячному возрасту [Hosokawa et al., 2000]. Полученные данные указывают на возможное накопление генетических дефектов, что такж^ является косвенным свидетельством более высокого уровня АФК в тканях быстростареющих животных.
Таким образом, мы показали, что повышенный уровень продукции АФК характерен для клеток как старых (8 месяцев), так и для молодых (1012 дневных) животных линии SAMP1, и этот факт соответствует представлениям о том, что в основе ускоренного процесса старения мышей линии SAMP1 лежит дисбаланс между образованием и нейтрализацией АФК в их тканях.
III. 1.1.2 Факторы окислительного стресса. Повышенная продукция свободных радикалов в тканях может быть связана либо с высокой активностью АФК-продуцирующих систем, например активностью моноаминооксидаз (наибольший интерес представляет моноаминооксидаза В, МАО В), либо со снижением эффективности антиоксидантной защиты, утилизирующей АФК (для которой активность супероксиддисмутазы является наиболее важным показателем, указывающим на состояние антиоксидантной защиты мозга). По этой причине в митохондриальной фракции мозга мышей линии SAMP1 было проведено измерение активности МАО В и СОД.
Активность МАО В у мышей линии SAMP1 в возрасте 8 месяцев оказалась почти в два раза выше, а активность СОД существенно ниже, чем у мышей контрольной линии SAMR1 (Рис. 11, А и Б).
SAMR1 SAMP1 SAMR1 SAMP1.
А Б.
Рис. 11. Активность МАО В (А) и СОД (Б) в митохондриальной фракции мозга 8-месячных мышей исследуемых линий.
МАО В является существенным источником митохондриальных, АФК, и ее активация также подтверждает наше заключение о состоянии окислительного стресса в тканях мозга SAMP1. Известно, что ингибирование СОД в мозге животных линии SAMP1 также связано с нарушением работы дыхательной цепи митохондрий [Nakahara et al., 1998; Nishikawa et al., 1998] и может служить подтверждением тому, что электронтранспортная цепь является вторым существенным источником АФК в клетках мышей с ускоренным процессом старения.
СОД высокочувствительна к окислительному повреждению, и рост АФК приводит к фрагментации ее молекул и потере активности в опытах in vitro [Choi et al., 1999]. Сам этот факт, в свою очередь, также приводит к увеличению уровня АФК, последующей утечке протонов через митохондриальную мембрану, усиленному формированию митохондриальных пор и смерти клеток по пути апоптоза. Изучение процессов старения обнаружило связь между этим явлением и снижением активности СОД в различных отделах мозга [Tsay et al., 2000; Benzi et al., 1989; Carrillo et al., 1992; Cardozo-Pelaez et al., 1999; Chang С. K. et al., 1997]. Таким образом, обнаруженное нами снижение активности митохондриальной СОД у быстростареющих мышей подтверждает общность механизмов старения как в обычных условиях, так и в условиях, характерных для изучаемой нами модели.
Из общих соображений можно полагать, что изменения активности МАО В и СОД может быть не только индуцировано свободнорадикальной атакой, но и запрограммировано генетически [Raha and Robinson, 2000] j Возрастное снижение активности СОД объясняют изменениями экспрессии данного гена, которое может происходить под действием АФК на молекулу ДНК.
Так или иначе, мы обнаружили, что два существенных фактора окислительного стресса изменяются так, что приводят к стабильному возрастанию уровня АФК в мозге. Можно предсказать, что это обстоятельство приведет и к нарушениям обмена биогенных аминов, и к накоплениям дефектов в свойствах клеточных белков и липидов в мозге| I мышей линии SAMP1.
Важным показателем развития окислительного стресса и причиной повреждения клеток является процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ). Для оценки устойчивости клеточных структур мозга к окислению мы измерили кинетику Ре2±индуцируемой хемилюминесценции гомогенатов мозга мышей двух исследуемых линий. Было обнаружено (Таблица 4), что для SAMP1 характерна более высокая амплитуда начальной вспышки хемилюминесценции h, соответствующая повышенному стационарному уровню липидных гидроперекисей по сравнению с аналогичным показателем для SAMR1. Продолжительность латентного периода х у SAMP1 существенно ниже по сравнению с этим| параметром у контрольных животных, что свидетельствует о меньшей устойчивости мембран мозга к окислению, и, возможно, об определенном дефиците антиоксидантной защиты в мозге.
VL ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
В настоящей работе проводилось исследование состояния антиоксидантной системы, которая является важным показателем устойчивости клеток к окислительному стрессу в мозге животных линии SAMP1, характеризующихся ускоренным процессом старения по сравнению с контрольной линией SAMR1. В опытах использованы клетки костного мозга и нейроны, как наиболее чувствительные к действию АФК, в которых можно значительно раньше наблюдать изменения метаболических процессов по сравнению с другими тканями. Хемилюминесцентным методом у мышей линии SAMP1 и SAMR1 был измерен стационарный и индуцированный ФМА или NMDA уровень АФК и показано, что как изолированные нейроны, выделенные из мозжечка 12-дневных мышей, так и клетки костного мозга мышей линии SAMP1 8−1 месячного возраста характеризуются более высоким уровнем АФК, чем клетки контрольных животных. Нужно отметить, что рост АФК в нейронах наблюдается на более ранней стадии онтогенеза, чем в клетках костного мозга, несмотря на то, что накопление старческих признаков у мышей линии SAMP1 наблюдается только с 4-месячного возраста, и в возрасте 12 дней животные исследуемых групп по морфологическим признакам неразличимы между собой. Другими словами, увеличение стационарного и индуцируемого уровня АФК в тканях предшествует появлению видимых дефектов организма.
При сравнительном анализе животных исследуемых линий показано, что генерации АФК и накопление возрастных нарушений у мышей линии) SAMP1 сочетается с тем обстоятельством, что активность МАО В у мышей линии SAMP1 в возрасте 8 месяцев оказывается почти в два раза выше, а активность СОД существенно ниже, чем у мышей контрольной линии SAMR1. Проанализировав активность глутатион-зависимых ферментов и уровень гидрофильных антиоксидантов карнозина и глутатиона в мозге исследуемых животных, мы показали, что активность этих ферментов и уровень глутатиона были неразличимы в обеих группах животных, однако концентрация карнозина существенно снижена в мозге мышей линии SAMP1 по сравнению с этим показателем у мышей линии SAMR1. Следовательно, для мозга важными факторами стабильности против АФК являются не глутатионзависимые ферменты и содержание глутатиона, а активность СОД и уровень карнозина.
Мембраны мозга мышей линии SAMP1 характеризуются более высоким содержанием липидных гидроперекисей и меньшей устойчивостью к окислению, чем мембраны контрольных животных.
Уровень карбонильных групп белков, измеренных в митохондриальной фракции и в гомогенате мозга мышей SAMP1 и SAMR1 в возрасте 8 месяцев, был одинаков в обеих группах, указывая на то, что на этой стадии окислительного стресса белки еще не подвергаются окислительной модификации.
Таким образом, обнаруженные нами биохимические различия мышей SAMP1 и SAMR1 указывают на то, что появление признаков старения на более ранних этапах жизни и более короткая продолжительность жизни животных линии SAMP1 являются результатом более интенсивного по сравнению с контрольными животными образования АФК в их тканях. Сделано заключение, что МАО В и СОД являются ключевыми ферментами, принимающими участие в формировании окислительного стресса. По этой причине мы высказали предположение, что у животных данной линии можно более легко, чем у нормальных животных, индуцировать нейродегенеративные заболевания, J развитие которых вовлекаются свободнорадикальные процессы.
В качестве примера усиления окислительного стресса у исследованных животных мы использовали нейротоксин МРТР, вызывающий симптомы паркинсонизма у приматов и грызунов [Burns et al., 1983]. Систематическое введение нейротоксина приводило к изменению физиологических и биохимических параметров животных. Так, после введения МРТР у животных линии SAMP1 выявлял с^ кратковременный тремор, значительно снижалась масса тела, и увеличивалась мышечная ригидность по сравнению с SAMR1. Двигательная активность снижалась в обеих группах, но более выраженным это снижение было у SAMP1.
Исходя из более явного изменения физиологических параметров можно предположить, что животные линии SAMP1 больше подвержены действию МРТР, и эти изменения указывают на возникновение индуцируемых МРТР повреждений в области черной субстанции мозга, что характерно для паркинсонизма [Sedelis М et al., 2000].
Концентрация дофамина, измеренная методом ВЭЖХ, была настолько низка у SAMP1, что введение МРТР существенно не влияло на| нее, в то время как в группе SAMR1 мы наблюдали существенное снижение уровня дофамина (практически на порядок) — до той же величины, что и у SAMP1. Концентрация норадреналина в тканях зависит от содержания дофамина, в связи с этим закономерно выглядит как исходно сниженная концентрация норадреналина у SAMP1, так и ее снижение у животных обеих экспериментальных групп после введения МРТР. Активность МАО В, изначально повышенная у мышей линии SAMP1, еще более возрастала, что, очевидно, сказывалось как на уровне дофамина в стриатуме, так и степени превращения МРТР в МРР±радикал.
В мозге животных, получавших МРТР, наблюдалось увеличение уровня липидных гидроперекисей, ускорение окисления липидов ^ снижение их резистентности к окислению, что, по-видимому, связано с истощением антиоксидантной системы, которая должна предотвращать накопление окисленных продуктов. Эти изменения были демонстративно представлены в группе животных SAMP1, в то время как у SAMR1 количество липидных гидроперекисей в мозге не изменялось, а резистентность к окислению снижалась незначительно.
Вызванное МРТР снижение активности антиоксидантной системы удалось показать и при измерении активности СОД. После введения МРТР активность СОД снижалась в обеих группах животных, что свидетельствует об истощении антиоксидантной системы, причем в случае SAMP1 эта система была истощена изначально.
Дополнительным доказательством недостаточности антиоксидантной системы в мозге SAMP1 могут служить данные по количеству карбонильных групп в белке.
Введение
МРТР достоверно повышало концентрацию карбонильных групп и в гомогенате, и в митохондриях мозга SAMP1, но не SAMR1. Необходимо отметить, что концентрация карбонильных групп в митохондриальной фракции мозга была выше, чем в целом гомогенате, что, вероятно, связано с направленностью действия МРТР в первую очередь на митохондрии. j.
В результате проделанной работы нам удалось показать, что действие МРТР более явно проявляется у животных линии SAMP1, таким образом, эти животные могут являться перспективной моделью нейродегенеративных заболеваний, в течение которых существенный вклад вносит окислительный стресс.
Для выяснения биохимических механизмов действия МРТР мы провели сравнение его влияния на некоторые параметры мозга исследуемых животных в условиях in vitro. Внесение нейротоксина в пробу за 30 мин до определения активности вызывает значительный рост МАО В, снижение активности СОД и активацию процессов перекисного окисления липидов в обеих группах животных. В опытах in vitrq нейротоксин МРТР не оказывал влияния на окисление белков с образованием карбонилов. Мы заключили, что окисление липидов модифицируется МРТР непосредственно, а окисление белковпродуктами его метаболизма. При этом накопление и метаболизм МРТР происходит у SAMR1 и SAMP1 по-разному, что делает токсическое влияние МРТР на SAMP1 более выраженным.
Таким образом, можно считать, что применение индуктора свободных радикалов МРТР на быстростареющих мышах приводит к увеличению дисбаланса в обмене АФК как in vitro, так и in vivo и, как следствие, к еще большему усилению окислительного стресса у этих животных.
В результате проделанной работы удалось показать, что действие МРТР более явно проявляется у животных линии SAMP1, и животные этой линии могут являться перспективной моделью нейродегенеративных заболеваний, в течение которых существенный вклад вносит окислительный стресс.
Нами также исследовано защитное влияние природного антиоксиданта карнозина на модели экспериментального паркинсонизма, вызванного введением МРТР мышам линии SAMP1 в сравнении J действием ингибитора МАО В селегилина. Сопоставление свойств животных, получавших одновременно с МРТР карнозин или селегилин, выявляло некоторые важные различия в действии этих соединений.
Введение
карнозина животным существенно препятствовало как угнетению вертикальной двигательной активности, так и развитию ригидности, наблюдаемым при действии МРТР. Селегилин не только не препятствовал (как карнозин) подавлению вертикальной активности под влиянием МРТР, но даже стимулировал ее. Не препятствовал селегилин и развитию ригидности.
При МРТР-индуцируемом паркинсонизме активность МАО В повышается в митохондриальной фракции мозга животных, а карнозин и ^ селегилин препятствует этому повышению, при этом эффект карнозина оказался гораздо более выраженным, чем эффект селегилина.
На активность СОД, измеряемую в митохондриях мозга,! исследуемые соединения влияли по разному. При совместном введении г".
МРТР и карнозина активность СОД сохраняется на уровне контроля, а при введении МРТР и селегилина превышала его. По ряду других параметров действие карнозина и селегилина оказалось неразличимым.
Сравнивая действие карнозина и селегилина нужно отметить, что селегилин является селективным ингибитором МАО В в результате действия которого происходит снижение уровня АФК, что сказывается положительно на активности СОД и других радикал чувствительных белках. Карнозин, в отличие от селегилина является соединением с широким спектром биологического действия (см. Раздел литературы 1.2.2.). Карнозин может вмешиваться в процессы синтеза белка, осуществляя специфическую регуляторную функцию, направленную на I поддержание нужных клетке генов в активном состоянии, например, гена МАО В, и обеспечивающую общее повышение жизнеспособности клеток.
Таким образом, введение как карнозина, так и селегилина в той или иной степени позволяет компенсировать дефицит антиоксидантной защиты мозга. Следовательно, карнозин и селегилин способны подавлять окислительный стресс в тканях мозга, снимая один из важных патогенетических факторов в развитии экспериментального паркинсонизма.
Проведенные исследования позволяют заключить, что действительно причиной ускоренного процесса старения мышей линии SAMP1 является повышенный уровень АФК в тканях животных и сниженная антиоксидантная защита мозга.
Введение
нейротоксина МРТР животным линии SAMP1 приводит к накоплению у исследуемых животных биохимических и физиологических отклонений, характерных для паркинсонизма. Животные линии SAMP1, оказываются гораздо более чувствительны к МРТР по сравнению с SAMR1. Карнозин и селегилин снижают токсическое действие нейротоксина МРТР у мышей линии SAMP1. селегилин препятствует этому повышению, при этот^ эффект карнозина оказался гораздо более выраженным, чем эффект селегилина.
На активность СОД, измеряемую в митохондриях мозга, исследуемые соединения влияли по разному. При совместном введении МРТР и карнозина активность СОД сохраняется на уровне контроля, а при введении МРТР и селегилина превышала его. По ряду других параметров действие карнозина и селегилина оказалось неразличимым.
Сравнивая действие карнозина и селегилина нужно отметить, что селегилин является селективным ингибитором МАО В в результате действия которого происходит снижение уровня АФ: К, что сказывается положительно на активности СОД и других радикал чувствительных белках. Карнозин, в отличие от селегилина является соединением с широким спектром биологического действия (см. Раздел литературы 1.2.2.). Карнозин может вмешиваться в процессы синтеза белка, осуществляя специфическую регуляторную функцию, направленную на поддержание нужных клетке генов в активном состоянии, например, гена МАО В, и обеспечивающую общее повышение жизнеспособности клеток.
Таким образом, введение как карнозина, так и селегилина в той или иной степени позволяет компенсировать дефицит антиоксидантной защиты мозга. Следовательно, карнозин и селегилин сггрсобны подавлять окислительный стресс в тканях мозга, снимая один из важных патогенетических факторов в развитии экспериментального паркинсонизма. !
Проведенные исследования позволяют заключить, что действительно причиной ускоренного процесса старения мышей линии SAMP1 является повышенный уровень АФК в тканях животных и сниженная антиоксидантная защита мозга.
Введение
нейротоксина МРТР животным линии SAMP1 приводит к накоплению у исследуемых животных биохимических и физиологических отклонений, характерных для паркинсонизма. Животные линии SAMP1, оказываются гораздо более чувствительны к МРТР по сравнению с SAMR1. Карнозин и селегилин снижают токсическое действие нейротоксина МРТР у мышей линии SAMP1.
