Влияние низкомолекулярной фракции кордовой крови на фагоцитарную активность нейтрофилов in vitro

Министерство образования и науки Украины Харьковский национальный университет им. В. Н. Каразина Биологический факультет Кафедра физиологии человека и животных Дипломная работа специалиста Влияние низкомолекулярной фракции кордовой крови на фагоцитарную активность нейтрофилов in vitro

студентки V курса Остапенко Татьяны Владимировны Научный руководитель:

к.б.н. Федосова С. Н.,

Харьков — 2009

Реферат

Работа изложена на страницах, содержит таблицы, рисунков и литературных источников.

Ключевые слова: трансфузионная лейкоцитарная масса, лейкоциты, нейтрофилы, фагоцитарная активность, низкомолекулярная фракция кордовой крови, актовегин.

В данной работе представлены результаты сравнительного исследования влияния низкомолекулярной фракции кордовой крови и фармакологического препарата актовегина на фагоцитарную активность нейтрофилов трансфузионной лейкоцитарной массы, хранившейся при +4°С. Показано, что хранение трансфузионной лейкоцитарной массы приводило к снижению всех исследуемых показателей. Инкубация лейкоцитов в среде, содержащей 0,17% раствор актовегина, способствовала восстановлению фагоцитарной активности нейтрофилов. При инкубации лейкоцитарной массы в среде содержащей различные концентрации низкомолекулярной фракции кордовой крови наблюдалось повышение активности кислород-зависимых бактерицидных механизмов. Добавление 0,017% раствора низкомолекулярной фракции кордовой крови оказывало стимулирующее влияние на поглотительную и переваривающую способность нейтрофилов.

Список сокращений

ЛМ — лейкоцитарная масса КК — кордовая кровь НФКК — низкомолекулярная фракция кордовой крови ФА — фагоцитарная активность ФИ — фагоцитарный индекс ФЧ — фагоцитарное число

КЗФ — коэффициент завершенности фагоцитоза

НСТ — нитросиний тетразолий ГМФШ — гексозомонофосфатный шунт

Для лечения и профилактики ряда патологических состояний широко используется лейкоцитарная масса (ЛМ) донорской крови человека. Трансфузии лейкоцитов нашли свое применение в комплексной терапии бактериальных инфекционных осложнений гемодепрессии, профилактике и терапии сахарного диабета на ранних стадиях заболевания, сепсисе, лейкопении и функциональных дефектах нейтрофилов. Положительный эффект применения лейкоконцентрата отмечается так же при тяжелых инфекциях с повторными бактериальными или грибковыми поражениями. Основным назначением к применению ЛМ служат различные нарушения фагоцитоза. В настоящее время в связи с расширением показаний к применению концентратов лейкоцитов, возникла проблема создания их запасов.

Перенесение клеток целостного организма в условия жизни in vitro приводит к выходу из-под контроля нейрогуморальных факторов. Клетки и ткани, которые живут вне организма, характеризуются целым комплексом метаболических, морфологических и генетических черт, отличных от свойств клеток и тканей in vivo. Известно, что в условиях in vitro лейкоциты быстро теряют свою функциональную активность. Сохранение жизнеспособности клеток ЛМ при положительных температурах встречают значительные трудности в связи с быстрым затуханием энергетического обмена, что, в свою очередь, связано со сложной внутренней структурой клеток. Мембраны гранул лейкоцитов весьма чувствительны к любого рода воздействиям и при нарушении их целостности, содержащиеся в гранулах гидролитические ферменты выходят в цитоплазму клетки, вызывая ее гибель. В связи с этим, целесообразным является подбор сред и условий хранения ЛМ, создания сред реинкубации лейкоцитов перед трансфузией, с целью повышения их функциональной активности.

Основным компонентом ЛМ является наиболее многочисленный тип лейкоцитов — нейтрофилы, представляющие собой систему полиморфонуклеарных фагоцитов, с расположенными в цитоплазме первичными азурофильными и вторичными специфическими гранулами. Образовавшись в костном мозге, через сосудистое русло нейтрофилы выходят в ткани, где и осуществляют свою главную функцию — поиск, захват и разрушение микроорганизмов — фагоцитоз, осуществляющийся в несколько этапов. В задачу нейтрофилов входит экстренная работа дезинфекции очага воспаления и осуществление вторичной альтерации, с целю очищения очага от микробов. При стимуляции нейтрофилы продуцируют комплекс хемокинов и провоспалительных цитокинов, активирующих другие клетки иммунной системы.

Активация энергетического обмена и теплопродукции нейтрофилов после связывания объекта фагоцитоза представляет собой метаболический взрыв. Процесс фагоцитоза связан со «вспышкой гликолиза», что выражается в повышении продукции лактата и сопровождается возрастанием синтеза липидов в мембране фагосомы. Элементом полномаштабного метаболического взрыва в нейтрофилах является активация неметохондриальных оксидаз. В ходе завершающей стадии фагоцитоза осуществляется внутриклеточный киллинг: кислород-зависимый и бескислородный. Кислорд-зависимые механизмы киллинга важнее, чем бескислородные, т.к. активны в отношении бактерий с неповрежденной клеточной стенкой.

Учитывая, что истинная активация нейтрофилов сопровождается метаболическим взрывом, многократно увеличивающим потребление энергии и увеличивающим потребность клеток в кислороде, является целесообразным использование в качестве сред инкубации препаратов, действие которых направленно на восстановление вышеуказанных процессов.

В клинической практике уже продолжительное время успешно применяются препараты, которые являются гемодиализатами, получаемыми из крови молочных телят, такие как актовегин. Этот препарат вырабатывается на основе именно безбелковой низкомолекулярной фракции крови (меньше 5 кДа), получаемой путем последовательных процессов криогемолиза, ультрафильтрации, диализа и концентрации.

Было замечено, что клетки разных клеточных и тканевых культур, а также органов людей и животных под влиянием этих препаратов увеличивают потребление кислорода и глюкозы. Этот эффект, не зависимо от самого органа, приводит к повышению энергетического статуса клетки, которая в свою очередь влияет на ее функциональный метаболизм.

В настоящее время в клинической практике все большее внимание и применение находят препараты, полученные из природного сырья. Одним из таких источников полифункциональных препаратов является кордовая кровь (КК).

Известно, что КК — это мощный биогенный стимулятор, эффективность действия которого заключается в том, что она имеет в своем составе сбалансированный комплекс биологически активных веществ, антиоксидантов, гемопоэзстимулирующих факторов, которые принимают участие в индукции, репрессии, обратном ингибировании разных ферментов в клетках.

Учитывая, что в клинической практике уже давно успешно применяются препараты, которые по происхождению являются низкомолекулярными гемодериватами, получаемыми из других источников, является вполне целесообразным изучение биологической активности низкомолекулярных фракций (меньше 5 кДа) КК, подвергнутой криогемолизу и изучение возможности разработки и внедрения сред реинкубации на их основе.

Исходя из этого, целью данной работы явилось:

— сравнительное изучение влияния актовегина и НФКК на фагоцитарную активность нейтрофилов в опытах in vitro.

В связи с поставленной целью, предполагалось решить следующие экспериментальные задачи:

1. Провести сравнительное изучение ФИ, ФЧ, КЗФ и активности кислород-зависимых бактерицидных механизмов в нейтрофилах трансфузионной лейкоцитарной массы, хронившейся при +4°С.

2. Изучить влияние актовегина в концентрациях 0,017%, 0,033%, 0,17%, 033% на фагоцитарную активность нейтрофилах в опытах in vitro.

3. Изучить влияние НФКК в концентрациях 0,017%, 0,033%, 0,17%, 033% на фагоцитарную активность нейтрофилах в опытах in vitro.

4. Изучить влияние актовегина в концентрациях 0,017%, 0,033%, 0,17%, 033% на активность кислород-зависимых бактерицидных механизмов в опытах in vitro.

5. Изучить влияние НФКК в концентрациях 0,017%, 0,033%, 0,17%, 033% на активность кислород-зависимых бактерицидных механизмов в опытах in vitro.

1. Обзор литературы

1.1 Фагоцитарная функция нейтофилов

Фагоцитоз — основная функция нейтрофилов, состоящая из цепи событий, которая, в широком смысле, может быть подразделена на каскад миграции и каскад Киллинга.

Миграционный каскад включает:

· маргинацию,

· диапедез через сосудистую стенку,

· хемотаксис;

Каскад Киллинга включает:

· распознавание,

· прикрепление,

· рецепторный эндоцитоз (погружение),

· слияние гранул,

· дегрануляцию в фагосоме, «метаболический взрыв», бактерицидный эффект (переваривание),

· экзоцитоз.

Известно, что ключевую роль в процессе маргинации играет взаимная экспрессия активированным эндотелием и нейтрофилом молекул клеточной адгезии, распознающих друг друга. Маргинация — частный случай клеточной адгезии. Она требует нормальной функции цитоскелета нейтрфилов — микротрубочек и микрофиломентов.

Диапедез через сосудистую стенку включает перемещение нейтрофилов через соединение между эндотелеоцитами и разрушение желатиназой нейтрофилов базальной мембраны эндотелия.

Хемотаксис нейтрофилов состоит в том, что эмигрировавшая из кровотока клетка мигрирует к объекту фагоцитоза по концентрационному градиенту медиатора — хемоаттрактанта. Гидрокортизон и колхицин — in vivo — ингибирует его.

Каскад киллига развертывается в полной мере после прикрепления нейтрофила к объекту, содержащему хемоаттрактанты. Существенную роль в прикреплении играют бивалентные щелочноземельные катионы Mg⁺² и Ca⁺². В процессе опсонизации может проявляться направленная специфичность фагоцитоза нейтрофилов млекопитающих, связанная со специфичностью опсонических антител, метящих объект. Неспецифические опсонизирующие факторы (коиплимент, некоторые б-глобулины, фибриноген, С-реактивный белок и другие белки острой фазы) — усиливают специфический компонент опсонизации.

Метаболический взрыв происходит путем активации энергетического обмена и теплопродукции после связывания объекта фагоцитоза. Процесс фагоцитоза связан с «вспышкой гликолиза», что выражается в повышении продукции лактата и сопровождается возрастанием синтеза липидов в мембране фагосомы. Обязательный элеиент полномасштабного метаболического взрыва в нейтрофилах — активация немитохондриальных оксидаз, связанных с гексозомонофосфатным (ГМФШ) шунтом (дыхательная вспышка).

Энергия метаболического взрыва, овеществленная в восстановленной форме НАД и НАДФ, необходима для усиления продукции эндогенных окислителей — основных агентов киллинга при фагоцитозе. Закономерные энергозависимые изменения происходят в состоянии цитоскелета. Цитоскелет участвует в погружении объекта внутрь нейтрофила, перемещении гранул и, вместе с белками, в опорожнении содержимого этих производных лизосом и преоксисом в фагосому.

При завершающей стадии фагоцитоза — деградации его объекта — конечным результатом является воздействие на перевариваемую частицу всего комплекса агентов, содержащихся в обоих типах гранул.

Внутриклеточный Киллинг нейтрофилов бывает двух категорий:

— кислородзависимый (свободнорадикальный);

— бескислородный (гидролазный или «цитазный»).

Кислородзависимые механизмы килинга важнее, чем бескислородные, так как активны в отношении бактерий с неповрежденной клеточной стенкой. Кислородзависимый внутриклеточный Киллинг в нейтрофилах сопровождается следующими проявлениями:

— повышенной активностью ГМФШ;

— возрастанием потребления кислорода;

— возрастанием удельной теплопродукции нейтрофилов;

— выработкой супероксид-аниона;

— продукцией перекиси водорода из супероксида под действием супероксиддисмутазы.

Бескислородные механизмы антимикробного Киллинга включают бактерицидное и антилитическое действие различных компонентов их гранул.

1.2 Патологии фагоцитоза нейтрофилов

При различных патологиях основная функция нейтрофилов может нарушаться (табл. 1). Нарушения могут касаться, преимущественно, каскада киллинга, либо каскада миграции. При некоторых наследственных и многих приобретенных заболеваниях страдают киллинг и миграция. Нарушения функции фагоцитов очень распространены и ответственны за многие случаи снижения иммунологической резистентности длительно и частоболеющих пациентов, хотя каждая отдельная наследственная аномалия фагоцитов не является частым заболеванием. Большинство больных, имеющих различные функциональные дефекты нейтрофилов, обнаруживают чувствительность к какому-то виду микроорганизмов, но не ко всем. Наследственные дефекты полиморфонуклеарного фагоцитоза, как правило, аутосомно-рецессивные, за исключением хронического гранулематоза и дефекта глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы. Приобретенные дефекты возникают при многих метаболических расстройствах аутоаллергических болезнях, гемобластозах, а также могут провоцироваться ядами и лекарствами.

Таблица Нарушение фагоцитоза

1.2.1 Применение лейкоцитарной массы

Трансфузии лейкоцитарной массы относительно широко начали применяться с начала 60-х годов XX в., когда был предложен метод лейкоцитафореза. До этого в качестве средства терапии гранулоцитопенических состояний переливалась цельная кровь, в том числе иногда кровь больных хроническим миелолейкозом.

Лейкоцитарная масса как трансфузионная среда до сих пор не получила широкого распространения в лечебной практике. Это связано с лабильностью, низкой устойчивостью лейкоцитов, трудностями их выделения из крови, необходимостью наличия больших доз для получения терапевтического эффекта, сложностью иммунологическою подбора пар донор — реципиент. Установлено, что у выделенных гранулоцитов быстро нарушаются морфофункциональные свойства.

Накопленный клиницистами опыт позволил предположить, что использование лейкоцитарной массы в комплексной терапии бактериальных инфекционных осложнений гемодепрессии может существенно улучшить результаты. Данные экспериментальных клинических исследований последних лет убедительно продемонстрировали положительную роль трансфузий гранулоцитов для лечения и профилактики ряда патологических состояний. По мнению Хигби и Бэрнетта [15], в настоящее время уже не требуется доказывать терапевтическую ценность переливаний гранулоцитов. Необходимо уточнить границы использования этой дефицитной и дорогостоящей трансфузионной среды, уметь устанавливать степень необходимости и лечебную перспективность трансфузий в каждом конкретном случае.

1.2.2 Хранение лейкоцитарной массы

Проблема консервирования крови и ее компонентов занимает одно из ведущих мест в становлении и развитии трансфузиологии, в научных исследованиях и практической деятельности. В связи с расширением показаний к применению хирургических методов, а также успехами, достигнутыми в области гематологии, возросла потребность в постоянном наличии запасов полноценной крови и ее компонентов. В результате широкого использования лучевой терапии и цитостатиков для лечения злокачественных заболеваний и лейкозов возникла проблема купирования таких осложнений, как иммунои гемодепрессии. Оказалось, что для лечения указанных осложнений могут успешно применяться ядерные компоненты крови, костного мозга, лимфоциты. Эти же клеточные суспензии могут быть полезны и в комплексной терапии иммунои гемодепрессии другого происхождения, в том числе лучевой патологии.

В последнее время предлагаются новые способы продления жизнеспособности, и функциональной полноценности клеток крови в процессе их консервирования и разработаны новые методы, увеличивающие сроки хранения крови и ЛМ при положительных и отрицательных температурах.

Для консервирования крови используются два метода:

— консервирование при отрицательных температурах;

— консервирование при положительных температурах.

Хранение крови при положительных температурах обычно происходит в бытовых комнатных холодильниках, которые обеспечивают поддержание температурного режима в пределах от +2 до +4°С. При таких температурах наиболее часто хранят консервированную цельную кровь, эритроцитарную массу, нативную плазму.

В процессе хранения консервированная кровь претерпевает многочисленные изменения. В первую очередь изменения затрагивают клеточные элементы крови, которые в силу своих морфологических и функциональных особенностей имеют разные сроки хранения.

Так, лейкоциты могут сохранять свои свойства в течение нескольких часов. Это объясняется тем, что лейкоциты — ядерные клетки со сложными функциями, а при длительном хранении в первую очередь изменения затрагивают ядро клетки. Но изменения происходящие с клеткой не ограничиваются только морфологическим аспектом, одновременно с этим происходит изменение биохимических и физико-химических свойств клеток и, как следствие, их функциональной активности.

Единственным реальным методом долгосрочного хранения лейкоцитов является замораживание при температурах ниже 0^СС. Считают [15], что успешное криоконсервирование гранулоцитов (в том числе миелолейкозных) позволит решить проблемы, связанные с применением этих клеток в клинике. Известные методы криоконсервирования гранулоцитов пока не могут быть признаны оптимальными.

В цельной крови при обычных способах консервирования и хранения нарушается функциональная активность гранулоцитов, в частности, уже через 48 часов исчезает способность к фагоцитозу.

Таким образом, в связи с необходимостью использования лейкоцитарной массы в клинической практике, но при этом отсутствием в большинстве лабораторий специального оборудования, имеет смысл проводить исследования по продлению сроков ее хранения с использованием низких положительных температур. Поэтому актуальной является задача усиления энергетического статуса клетки после гипотермического хранения.

1.3 Механизм действия препарата актовегин

Культура клеток является чрезвычайно важным объектом для научных исследований, а также субстратом в биотехнологии. Перенесение клеток целостного организма в условия жизни in vitro приводит к их выходу из-под контроля нейрогуморальных факторов и обретению клетками ряда особенностей, зависимых как от самого факта отторжения, так и от конкретных условий существования in vitro. Клетки и ткани, которые живут вне организма, характеризуются целым комплексом метаболических, морфологических и генетических черт, отличных от свойств клеток и тканей in vivo.

Одним из главных направлений прикладных исследований является разработка эффективных технологий долгосрочного хранения биологических объектов и решение проблем создания ресуспендирующих и питательных сред, способных оказывать содействие быстрому восстановлению энергетических процессов в клетке после ее выхода из холодового анабиоза.

В настоящее время в клинической практике известно применение препарата актовегин. Являясь гемодиализатом, помимо неорганических электролитов и других микроэлементов, он содержит 30% органических веществ, таких, как пептиды, аминокислоты, нуклеозиды, промежуточные продукты углеводного и животного обмена, липиды и олигосахариды. Молекулярный вес органических соединений составляет менее 5000 дальтон. Согласно наблюдениям, применение Актовегина целесообразно в различных областях медицины для коррекции состояния органов и тканей при патологических состояниях.

Было замечено, что клетки различных клеточных и тканевых культур, а также органов людей и животных под воздействием актовегина увеличивают потребление кислорода и глюкозы. Этот эффект, независимый от самого органа, ведет к увеличению энергетического статуса клетки, что, в свою очередь, оказывает влияние на ее функциональный метаболизм.

Активная фракция, изолированная от гемодиализата, повышает транспорт 3−0 метилглюкозы в зависимости от дозы в 5 раз, не вызывая увеличения цитохолазина-В во фракции плазмы мембраны.

Активная фракция, очевидно, действует независимо от перемещения глюкозы. Стимуляция транспорта происходит через модуляцию внутренней активности носителя глюкозы (Odermaer-Kusser и др., 1989). Это объясняет самостоятельное инсулиноподобное воздействие актовегина на транспорт и использование глюкозы, что выражается в улучшении энергетического статуса клетки.

1.4 Структурно-функциональные особенности кордовой крови

В настоящее время все большее внимание исследователей и клиницистов привлекают внимание лекарственные препараты, полученные из природного материала, одним из которых является кордовая кровь.

Кордовой (плацентарной, пуповинной, фетальной) называется кровь, которая остается в сосудах плаценты и пуповины после рождения ребенка и отделения его от матери. Она является по существу частью крови плода [5,13]. КК, являясь внутренней средой растущего организма, обеспечивает доставку к различным тканям и органам биологически активных веществ, продуцируемых плацентой и фетальными тканями. Эти соединения, различные по своей природе и источнику происхождения, определяют рост и дифференцировку тканей плода, регулируют его метаболизм.

При обсуждении различий состава и свойств кордовой и донорской крови нельзя не коснуться системы переноса кислорода. Эритроциты кордовой крови имеют целый ряд структурно-функциональных особенностей отличающих их от эритроцитов взрослого человека [13, 16]. Кордовая кровь содержит, главным образом, фетальный гемоглобин, который, несколько отличаясь от нормального гемоглобина взрослых, имеет повышенное сродство к кислороду.

Согласно современным представлениям, регулятором кислородосвязывающих свойств гемоглобина является уровень содержания в эритроцитах 2,3-ДФГ. Установлено, что фетальный гемоглобин обладает меньшим сродством к 2,3-ДФГ, а, соответственно и большим сродством к кислороду. По данным литературы содержание фетального гемоглобина в крови новорожденных намного больше, чем в периферической крови взрослого человека (табл. 1).

Таблица 1

Содержание некоторых компонентов кордовой и донорской крови человека (в норме).

Так же на насыщение кислородом может влиять деформабильность эритроцитов. Отмечено, что эритроциты кордовой крови имеют большую степень деформабильности, чем эритроциты взрослого организма. Предполагается, что это увеличивает транспортные свойства эритроцитов кордовой крови [19, 25].

Иммунные свойства эритроцитов КК изучены недостаточно, однако имеющиеся в литературе данные говорят о значительной иммунной стойкости этих клеток. Было отмечено, что для их лизиса требуется намного больше гемолизина, чем для разрушения эритроцитов взрослого человека. Эти данные позволяют надеяться, что эритроциты кордовой крови смогут достаточно длительно функционировать в русле крови после трансфузии [17, 29].

Еще одной особенностью фенотипа лимфоцитов КК, характеризующей их как клетки со специфической иммунореактивностью, является отсутствие рецептора к интерлейкину-2, в то время как около 4% лимфоцитов крови детей от 3 до 12 лет уже имеют этот рецептор. Кроме того уже около 30% лимфоцитов КК отнесены к так называемым «нулевым» клеткам по причине отсутствия маркеров каких-либо иммунокомпетентных клеток на их поверхности.

Одним из уникальных отличий КК от донорской является то, что кордовая кровь богата незрелыми стволовыми клетками-предшественниками. Стволовые клетки кордовой крови обладают уникальными свойствами — они не воспринимаются организмом как чужеродные и не требуют индивидуального подбора, как при переливании донорской крови и пересадке органов.

По содержанию веществ в плазме, кордовая кровь отличается от крови взрослого организма практически по всем параметрам. На сегодняшний день обнаружены различия между содержанием в плазме крови взрослого организма и в плазме кордовой крови различных белков, гормонов, нейропептидов, низкомолекулярных соединений (см. таб.1). Кордовой крови присущ высокий уровень витаминов, микроэлементов.

Особенностями кордовой крови, в частности ее сыворотки является наличие более 60 специфических плацентарных белков, выполняющих роль ферментов, гормонов, гемопоэтинов, адаптогенов, рецепторов, факторов роста, иммунорегуляторных агентов; содержание целого ряда пептидов — структурных аналогов нейропептидов головного мозга, опиоидных пептидов (эндорфинов и энкефалинов).

Известно, что в КК по сравнению с донорской существует повышенный уровень веществ, играющих роль в антиоксидантной системе: каротиноидов, аскорбиновой кислоты, токоферролов и др. Такой повышенный уровень антиоксидантов в кордовой плазме может вносить вклад в увеличение резистентности плазмы КК к Cu2+ индуцированному перекисному окислению липидов. Для КК характерно более высокое содержание ряда микроэлементов, участвующих в различных процессах клеточного метаболизма: калия, кальция, магния, фосфора, железа. Содержание никеля, хлора, цинка в КК и в материнской крови почти одинаково. Среди низкомолекулярных веществ выявлялись глюкоза, лактат, креатин, цитрат, аминокислоты и кетоновые тела. Плацентарная плазма имела сходный состав, за исключением того, что выше был уровень бетаина, а также отсутствовали цитрат, ацетон, ацетоацетат и некоторые липопротеины.

1.5 Особенности состава кордовой крови и ее применение в клинической практике

На сегодняшний день в научной и клинической практике накоплена обширная информация о положительном влиянии кордовой крови, как на различные органы, системы и клеточные культуры, так и на организм в целом. На основе кордовой крови созданы и используются в клинической практике такие препараты, которые относят к группе биогенных стимуляторов. Основное отличие кордовой крови как биогенного стимулятора состоит в том, что она имеет в своём составе сбалансированный комплекс биологически активных веществ, которые принимают участие в индукции, репрессии, обратимой ингибиции различных ферментов в органах и тканях реципиента, благодаря чему возможно воздействие на метаболизм не только больного, но и относительно здорового организма без выраженной патологии [7, 8, 20].

В ряде экспериментальных исследований была проведена сравнительная оценка донорской и кордовой крови человека. В частности показано, что имеются значительные отличия реологических показателей [5], системы коагуляции [17], переноса кислорода, иммунологических характеристик. Существенные различия наблюдаются и в содержании белковых компонентов сыворотки кордовой крови при сравнении ее с донорской.

Исходя из указанных выше особенностей эритроцитов КК, авторы сочли возможным использовать фетальные эритроциты при тяжелых формах геморрагического шока, сопровождающегося вторичной тканевой гипоксией. Было установлено, что инфузия взвеси фетальных эритроцитов в условиях постгеморрагической гипотензии сопровождается более выраженной нормализацией показателей кислотно-щелочного состояния, напряжения кислорода в мышце, гемодинамики и дыхания по сравнению с инфузией взвеси эритроцитов взрослого человека.

В работе [8], показано, что после трансфузии КК у пациентов с синдромом дыхательного дистресса усиливалось связывание кислорода кровью в легких и происходила нормализация газообмена в тканях, что указывает на большее сродство фетальных эритроцитов к кислороду, чем эритроцитов крови взрослого организма.

КК отличается от крови взрослых также и по своим реологическим свойствам. Это становится особенно актуальным при частом назначении различных компонентов крови новорожденным при интенсивной терапии. Пониженный уровень агрегации эритроцитов КК обусловлен скорее не различиями в строении клеток по сравнению с эритроцитами крови взрослых, а различием компонентов плазмы. Как видно, здесь имеет значение присутствие в КК фетального варианта фибриногена и низкие уровни иммуноглобулинов, особенно IgM и IgA.

Фенотипические особенности мембранных структур Т-лимфоцитов могут указывать на сниженную способность этих клеток КК к иммунному ответу по классическому пути.

В настоящее время интерес ученых привлекает проблема использования КК как альтернативного источника гемопоэтических стволовых клеток-предшественников.

Таким образом, несмотря на повышенное содержание многих биои иммуностимуляторов в КК, эти вещества находятся в сбалансированных концентрациях и представляют собой биологически активный комплекс, необходимый для развивающегося организма, и нормализующий обмен веществ при попадании во взрослый организм.

Вследствие указанных выше особенностей клеточного состава, КК и полученные из нее препараты, находят в последнее время все большее применение в клинической практике [5, 28]. Причем в лечебных целях используется как цельная КК, так и отдельные ее компоненты.

кордовый кровь актовегин фагоцитарный нейтрофил

2. Объекты и методы исследований

Работа была выполнена на базе отдела Биохимии холодовой адаптации Института проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины.

Исследования проводились на трансфузтонной лейкоцитарной массе 30−40 летних мужщин, полученной Харьковским областным центром службы крови (ХОЦСК), заготовленной по стандартной методике ХОЦСК и хранившейся не более 12 часов при температуре +4°С после фракционирования крови.

Нативную лейкоцитарную массу получали путем отстаивания цельной донорской крови. Плазму отобрали, оставив 20 мл над осевшими клетками. Верхний слой клеток, содержащий лейкоциты с примесью эритроцитов, переводили во флакон, содержащий 6% раствор декстрана в 0,9% растворе NaCl в соотношении 2:1. Аккуратно перемешивали в течение 10 мин и оставляли на 30−40 мин для оседания эритроцитов. Надосадочную жидкость переводили во флакон и центрифугировали при 1 тыс. об/мин в течение 10 мин. отбирали надосадочную жидкость, остаток ресуспендировали в плазме крови. Содержание лейкоцитов доводили плазмой до 30−50 тыс. в 1 мкл.

Низкомолекулярную фракцию кордовой крови КРС (НФКК) получали с помощью метода ультрафильтрации с использованием ультрафильтрационного оборудования фирмы «Sartorius» (Германия). Для этого цельную КК дефибринировали, затем производили криодеструкцию путем помещения сырья в морозильную камеру с температурой -80⁰С. Для получения низкомолекулярных фракций, полученные образцы размораживали при комнатной температуре, центрифугировали при 10000g, с целью удаления крупных частиц. После этого криогемолизированную кровь подвергали предфильтрации, для чего использовали фильтр многоразового использования, который задерживает частицы с молекулярной массой более 100 кДа. Полученный фильтрат пропускали через ультрафильтрационный модуль, с показателем номинальной молекулярной массы, которая отделяется, 5 кДа.

Выбранный метод ультрафильтрации в тангенциальном потоке, в сравнении с другими видами низкомолекулярного разделения молекул объединяет в себе достаточно высокую эффективность фильтрации, возможность фильтрации больших объемов и многоразовое использование мембраны.

Полученные низкомолекулярные пептиды подвергали лиофилизации.

В качестве препарата сравнения использовали актовегин (коммерческий препарат фирмы NYCOMED, Австрия; 40 мг/мл сухого веса).

Количество ядросодержащих клеток подсчитывали в камере Горяева. Концентрацию клеток всегда доводили до 2×10⁷/мл в плазме крови. Влияние низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) кордовой крови КРС и актовегина, на клетки лейкоцитарной массы, оценивали по фагоцитарной активности и бактерицидной активности (НСТ-тест) нейтрофилов. Препараты в каждой серии экспериментов вносили в суспензию клеток в объеме 10% от среды до конечных концентраций 0,17 — 0,33 — 1,7 — 3,3 мг/мл (исходя из расчета разведения препарата с исходной концентрацией 40 мг/мл).

Известно, что фагоцитарная активность (ФА) является главной физиологической функцией нейтрофилов. Для оценки ФА объектом фагоцитоза служила суточная инактивированная культура Staphylococcus aureus штамм № 209 (2 млрд. кл./мл, в физиологическом растворе). Для постановки реакции в лейкоцитарную массу вносили ФКК или Актовегин соответствующей концентрации в объеме 10% от среды и Staphylococcus aureus, соблюдая соотношение лейкоцит-стафилококк 1:50 для адекватной оценки фагоцитарных показателей. В контрольные пробы вместо препарата добавляли изотонический раствор. Лейкоцитарную массу инкубировали при +37°С в воздушном термостате в течение 45 и 120 минут. После чего готовили мазки средней плотности, фиксировали их эозин-метиленовым синим раствором (по Май-Грюнвальду) в течение 1 минуты и окрашивали азур-эозин раствором (по Романовскому) в течение 1 минуты. Окрашенные мазки смотрели под иммерсией (х100, об. 10). Определяли процент фагоцитирующих нейтрофилов — фагоцитарный индекс (ФИ) и среднее количество микробных тел на один нейтрофил — фагоцитарное число (ФЧ) после 45 и 120 минут инкубации, а также коэффициент завершенности фагоцитоза (КЗФ) — отношение фагоцитарного числа после 45 мин инкубации к фагоцитарному числу после 120 мин инкубации. Данный показатель характеризует последнюю стадию фагоцитоза, деградацию объекта фагоцитоза (переваривающую активность нейтрофилов).

Для оценки бактерицидной активности нейтрофилов в составе лейкоцитарной массы донорской крови проводили индуцированный НСТ-тест. О метаболической активности судили по поглощению клеткой нитросинего тетразолия (НСТ) и восстановлению его в диформазан, выявляемый в виде гранул синего цвета в цитоплазме нейтрофила. Активацию клеток осуществляли суточной инактивированной культурой Staphylococcus aureus штамм № 209 (2 млрд. кл./мл, в физиологическом растворе). Для постановки теста в лейкоцитарную массу вносили ФКК или Актовегин соответствующей концентрации в объеме 10% от среды, Staphylococcus aureus, соблюдая соотношение лейкоцит-стафилококк 1:50, и 0,2% раствор НСТ. В контрольные пробы вместо препарата добавляли изотонический раствор. Лейкоцитарную массу инкубировали при +37°С в течение 45 минут. После чего все пробы центрифугировали 10 мин при 1500 об./мин, из осадков готовили мазки средней плотности, фиксировали 10%-ным раствором формалина в течение 30 мин. Процент диформазан-положительных нейтрофилов определяли при микроскопическом исследовании препаратов, окрашенных 0,1%-ным раствором сафранина (на основе 1% уксусной кислоты), под иммерсией (х100, об. 10) с зеленым светофильтром.

3. Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили, используя критерий Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

3.1 Оценка ФА нейтрофилов после 45 и 120 минут инкубации в среде содержащей растворы актовегина и НФКК

Известно, что лейкоциты играют важную роль в иммунной системе организма человека. Одними из главных клеток врожденного иммунитета являются нейтрофилы, осуществляющие первую линию защиты от инфекции. В основе их защитной функции лежит фагоцитарный процесс, который заключается в их способности распознавать, поглощать, убивать и переваривать микробные клетки. Фагоцитарная активность — одна из физиологических функций нейтрофилов, является важной составляющей частью общей резистентности организма. При перенесении клеток целостного организма в условия жизни in vitro приводит к их выходу из-под контроля нейрогуморальных факторов.

Как известно, лейкоциты чувствительны к воздействию низких температур, что выражается в структурных изменениях в цитоплазме и плазматических мембранах, митохондриях, лизосомах, снижении в 7−10 раз интенсивности биохимических процессов в клетках, что в свою очередь ведет к исчезновению способности данных клеток к фагоцитозу.

Согласно литературным данным лейкоциты донорской крови разных сроков и условий хранения характеризуются низким уровнем фагоцитарной активности (ФА), о чем свидетельствует незначительный процент фагоцитирующих клеток, а также число микроорганизмов захваченных одной клеткой после гипотермического хранения. Снижение фагоцитарной активности лейкоцитов свидетельствует о том, что клетка истощается, а значит и снижается ее энергетический статус. Т. к. фагоцитоз — это энергозависимый процесс, основной задачей при хранении лейкоцитов является поддержание и восстановление их энергетического потенциала. В связи с этим, в условиях in vitro при гипотермическом хранении лейкоцитов акцентируется внимание на компонентах реабилитирующих сред, которые способствуют восстановлению клеток. В данном направлении проведено большое количество исследований, направленных на использование для культивирования клеток разных сывороток крови и их фракций.

Действие низкомолекулярного деривата крови молочных телят — актовегина наиболее выражен при гипоксическом характере повреждения клеток и тканей. В условиях внутриклеточной недостаточности кислорода клетка поддерживает собственные энергетические потребности за счет активации процессов анаэробного гликолиза. В результате источниками энергии служат эндогенные запасы АДФ и аденозина. Истощение энергетических резервов ведет к деструкции клеточных мембран и цитолизу. Основой фармакологического действия актовегина является увеличению потребления и транспорта кислорода и глюкозы, что приводит к активации процессов аэробного окисления увеличивая энергетический статус клетки и оказывает влияние на ее функциональный метаболизм.

Известно, что кордовая кровь является уникальным источником биологически активных веществ, а ее спектр действия и состав имеет ряд преимуществ по сравнению с донорской кровью и кровью молочных телят. Хотя высокомолекулярные компоненты кордовой крови нашли широкое применение в клинической практике и других областях науки, биологическая активность низкомолекулярной фракции не изучена. Тем более, что в современной клеточной биотехнологии одной из главных задач есть разработка универсальных сред для культивирования и хранения клеток, не содержащих сыворотку крови, которая имеет ряд недостатков.

3.1.1 Определение ФИ нейтрофилов после 45 и 120 минут инкубации ЛМ в среде содержащей растворы актовегина и НФКК

Проведенная нами сравнительная оценка ФА нейтрофилов донорской крови после хранения при температуре +4°С, как общая характеристика функционального статуса лейкоцитов, показала, что актовегин и НФКК в различных концентрациях по разному влияют на степень активации лейкоцитов.

Рис. 1 Влияние 45 минутной инкубации лейкоцитарной массы в средах, содержащих различные концентрации актовегина и низкомолекулярной фракции кордовой крови на фагоцитарный индекс нейтрофилов На рис. 1 представлена динамика фагоцитарного индекса (ФИ) нейтрофилов, отражающего процент клеток вступивших в реакцию со стафилококком, т. е. количество фагоцитирующих клеток. В наших экспериментах было установлено, что при гипотермическом хранении ЛМ происходит снижение количества нейтрофилов вступивших в реакцию (рис. 1, 2). При инкубации ЛМ в течении 45 мин. в среде содержащей 0,17% раствор актовегина, наблюдалось незначительное повышение данного показателя до 50,12±3,62% по сравнению со значениями ФИ нейтрофилов трнсфузионной лейкоцитарной массы, которое составляло 42,71±1,03%. При добавлении в среду инкубации исследуемых концентраций ФНКК повышение ФИ не наблюдалось.

После 120 мин. инкубации ЛМ увеличение процента фагоцитирующих нейтрофилов было зарегистрировано в среде содержащей максимальные растворы исследуемых препаратов по сравнению с нейтрофилами хранившимися при +4°С, при этом данный показатель достоверно не отличался от значений нативных нейтрофилов (рис.2). При инкубации лейкоцитов в средах содержащих 0,017%, 0,033%, 0,17%, 0,33% растворы исследуемых препаратов значительного увеличения ФИ нейтрофилов не происходило.

Рис. 2 Влияние 120 минутной инкубации лейкоцитарной массы в средах, содержащих различные концентрации актовегина и низкомолекулярной фракции кордовой крови на фагоцитарный индекс нейтрофилов

3.1.2 Определение ФЧ нейтрофилов после 45 и 120 минут инкубации ЛМ в среде содержащей растворы актовегина и НФКК

При исследовании фагоцитарного числа (ФЧ), характеризующего количество поглощенных микробов (рис. 3, 4) была отмечена совсем иная динамика данного показателя. Как показано на рисунке 3, гипотермическое хранение лейкоцитов способствовало снижению ФЧ исследуемых клеток. Захват стафилококка нейтрофилами после 45 и 120 мин. инкубации ЛМ составил 7,15±0,84 ед. ед. и 6,89±0,55 ед., соответственно, по сравнению с ФЧ интактных нейтрофилов после их инкубации на протяжении такого же времени. Значительные отличия по сравнению с нейтрофилами трансфузионной лейкоцитарной массы были отмечены при инкубации в течении 45 мин. ЛМ в среде содержащей минимальную концентрацию НФКК (рис. 3). Количество поглощенных микробных тел при 45 мин. инкубации лейкоцитов с НФКК в концентрации 0,017% составляло 19,19±1,29 ед., в то время как в группе нейтрофилов трансфузионной ЛМ данный показатель не превышал 7,15±0,84 ед. добавление более высоких концентраций НФКК (0,033%, 0,17%, 0,33%) приводило к снижению захвата нейтрофилами микробных тел. При добавлении к трансфузионной массе лейкоцитов актовегина в такой же концентрации, значения ФЧ оставались на уровне необработанных нейтрофилов. К повышению поглотительной способности нейтрофилов, приводила инкубация лейкоцитов в среде, содержащей актовегин, но в более высоких концентрациях — 0,033% и 0,17% до 18,6±1,13 ед. и 13,07±0,7 ед. Максимальное увеличение поглотительной способности нейтрофилов, превосходящее значения нативных клеток, наблюдалось ри добавлении в среду инкубации минимальных концентраций НФКК (рис. 3).

Среднее количество микробных тел поглощенных одним нейтрофилом при инкубации ЛМ в течении 120 мин. с 0,017% раствором НФКК, не смотря на значения данного показателя при 45 мин. инкубации, было сниженным и не превышало значения нативных нейтрофилов (рис. 4). Инкубация исследуемых клеток с более высокими концентрациями НФКК не оказывала значимого влияния на данный показатель.

Рис. 3 Влияние 45 минутной инкубации лейкоцитарной массы в средах, содержащих различные концентрации актовегина и низкомолекулярной фракции кордовой крови на фагоцитарное число нейтрофилов Добавление актовегина к суспензии лейкоцитов в вышеуказанной дозе также не способствовало повышению данного показателя. Наиболее выраженное повышение ФЧ в при инкубации ЛМ в течении 120 мин. было зарегистрировано при добавлении в среду 0,033% раствора актовегина и составило 15,96±1,06 ед., в то время как у интактных нейтрофилов ФЧ достигало лишь 11,3±0,26 ед. При увеличении концентрации актовегина было отмечено ингибирование показателей ФЧ нейтрофилов.

Рис. 4 Влияние 120 минутной инкубации лейкоцитарной массы в средах, содержащих различные концентрации актовегина и низкомолекулярной фракции кордовой крови на фагоцитарное число нейтрофилов Несмотря на то, что исследование поглотительной способности нейтрофилов при инкубации в течении 120 мин. в среде содержащей 0,017% раствор НФКК привело к низким значениям, их переваривающая способность была на высоком уровне. Аналогичная закономерность наблюдается и при добавлении к среде инкубации трансфузионной ЛМ 0,17% раствора актовегина, т. е. в концентрации в 10 раз большей по сравнению с НФКК.

Исходя из вышесказанного, можно сделать вывод о том, что низкомолекулярная фракция кордовой крови КРС повышала фагоцитарную активность лейкоцитов в значително меньшей концентрации по сравнению с актовегином, что свидетельствует о ее более выраженной биологической активности.

3.1.3 Оценка КЗФ нейтрофилов после инкубации ЛМ в среде содержащей растворы актовегина и НФКК

О завершающей стадии фагоцитоза судят по деградации его объекта. Для этого в данной работе явилось целесообразным изучение основного показателя, по которому можно судить о полноценности фагоцитоза — это КЗФ. Данный показатель характеризует способность нейтрофилов переваривать захваченные микробы, т. е. степень деградации объекта фагоцитоза. Полученные результаты представлены на рисунках 5 и 6.

Рис. 5 Влияние различных концентраций актовегина, содержащихся в среде инкубации лейкоцитарной массы на коэффициент завершенности фагоцитоза нейтрофилов Из рисунков следует, что хранение трансфузионной лейкоцитарной массы при +4°С приводит к снижению КЗФ нейтрофилов в 1. 5 раза, что составляет 1,56±0,02 ед., по сравнению со значениями нативных нейтрофилов 1,06±0,02 ед. При добавлении в среду инкубации ЛМ 0,017%, 0,033% и 0,33% растворов актовегина КЗФ оставался в пределах единицы и составлял 1,07±0,05 ед., 1,11±0,05 ед., 1,02±0,03 ед., соответственно. Что согласно данным литературы [] соответствует критическому уровню, когда скорость поглощения микробных тел нейтрофилами превосходит скорость их переваривания. Но при добавлении в лейкоциты среду инкубации содержащую 0,17% раствор актовегина КЗФ значительно увеличивается и составляет 1,61±0,01 ед., что достигает значений, характерных для нативных нейтрофилов (рис.5)

Рис. 5 Влияние различных концентраций актовегина, содержащихся в среде инкубации лейкоцитарной массы на коэффициент завершенности фагоцитоза нейтрофилов При инкубации трансфузионной массы лейкоцитов со средами, содержащими исследуемые концентрации НФКК (рис. 6) наблюдалась иная динамика изменения переваривающей способности нейтрофилов. Максимальная способность к деградации объекта фагоцитоза происходила при инкубации ЛМ в среде, содержащей самую низкую концентрацию НФКК (0,017%). Добавление к суспензии лейкоцитов исследуемой фракции в данной концентрации приводило к увеличению КЗФ нейтрофилов в 1,8 раза по сравнению с КЗФ нейтрофилов хранившихся при +4°С и в 1.2 раза по сравнению нативными нейтрофилами. При добавлений в среду инкубации ЛМ других концентраций актовегина и НФКК не приводило к повышению данного показателя, о чем свидетельствует КЗФ находящийся на критическом уровне.

Исходя из полученных данных фагоцитарной активности нейтрофилов, можно сказать, что функциональный статус нейтрофилов трансфузионной ЛМ, хранившейся при +4°С, восстанавливается при использовании исследуемых препаратов. Наиболее выраженное восстановление ФА, а следовательно и функциональных особенностей нейтрофилов наблюдается при инкубации нейтрофилов в 0,017% растворе НФКК и 0,17% растворе актовегина.

3.2 Активность кислород-зависимых бактерицидных механизмов нейтрофилов после инкубации ЛМ в среде содержащей растворы актовегина и НФКК

В последние годы накоплен значительный материал, который позволяет рассматривать изменения функционально-метаболической активности лейкоцитов крови. В частности внутриклеточный киллинг нейтрофилами, который бывает двух типов: кислород-зависимый (свободнорадикальный) и бескислородный (гидролазный или цитазный). Кислород-зависимые механизмы киллинга важнее, чем бескислородные, так как активны в отношении бактерий с неповрежденной клеточной стенкой.

Одним из звеньев цепи фагоцитоза является генерация активных форм кислорода (АФК) нейтрофилами. Среди разных видов клеток наиболее мощными генераторами (АФК) являются фагоциты — гранулоциты и моноциты. Генерация ими АФК — супероксидного анионракдикала, синглентного кислорода, гидроксильного радикала и перекиси водорода — и поглощение кислорода (О₂) особенно резко возрастают при активации и фагоцитозе, что получило название «респираторный взрыв» фагоцитов, суть которого сводится к быстрому образованию и выбросу во внеклеточную среду больших количеств супероксидного анион-радикала (О₂^-) и перекиси водорода. Это событие является защитной реакцией иммунокомпетентных клеток в борьбе с чужеродными элементами. Особо важную роль в механизме генерации АФК фагоцитами играет активация НАДФ· Н₂-оксидазы и других оксидаз, которые способствуют переносу электрона на кислород, инициируя его восстановление. Одним из инструментов изучения АФК (определение степени генерации О₂^-) является реакция восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) — НСТ-тест. НСТ-тест отражает кислород-зависимый метаболизм, прежде всего функцию гексозомонофосфатного шунта (ГМФШ) и связанную с ним наработку свободных радикалов. НСТ-тест не только позволяет выявить фагоцитирующие нейтрофилы, но может характеризовать и состояние их ферментных систем, использоваться для дифференциального диагноза бактериальных и вирусных инфекций, а также для оценки резервной функции фагоцитоза.