Определение морфогенетического потенциала in vitro различных родов Salvia L

В результате этих исследований определено оптимальное количественное соотношение в надземной массе сырья листьев и стеблей (2,5:1), содержание эфирного масла максимальное.

Авторы утверждают, что в результате определено: чем больше площадь листовой пластинки и число листьев на растении, тем выше массовая доля эфирного масла. Массовая доля эфирного масла шалфея определяется количеством эфиромасличных железок и их размером.

Также, есть работы, где установлена ​​связь между массовой долей эфирного масла, числом железок и их размером. Выявлена ​​зависимость между числом железок на 1 мм² нижней поверхности листа, величине и массовой долей эфирного масла в растении. Показано, что чем большее количество железок на 1 мм² и больше их диаметр, тем выше содержание эфирного масла [7, С. 144].

Подобную зависимость исследователи выявили и с цветках шалфея. Чем больше число железок на чашечке (на 1 мм длины межреберье) и диаметр железки, тем выше массовая доля масла в растении.

В результате изучения источниковой базы нами выявлено, что содержание эфирного масла зависит от возраста растений, а также выявлено взаимозависимость между перечисленными вышеупомянутыми признаками.

В процессе изучения динамики накопления эфирного масла исследователи обнаружили, что максимальное его количество достигало в фазе массового цветения — до 1,8% на сухое сырье. Далее в фазе конца цветения наблюдается некоторое снижение до 1,5%, а в фазе созревания семян началось заметное снижение содержания эфирного масла до 1,3% на сухое вещество. Снижение масла объясняется усиленным ростом цветоносного побега и увеличением его массы в сырье, а цветонос является балластом, поскольку содержит лишь следы эфирного масла. В фазе плодоношения продолжалось снижение содержания эфирного масла до 1,14% на сухое вещество.

Как выяснилось, такая закономерность характерна для растений Salvia разного возраста и не зависит от количества лет жизни.

Изучение компонентного состава эфирного масла семенной популяции шалфея дало основания для вывода, что внутривидовой состав ее надземной массы достаточно разнообразен и состоит из следующих основных компонентов: α - и β - туйон, 1,8 — цинеол, камфора, борнеол, α - и β - пинены, кариофилен и сесквитерпены. Выявлено 28 монотерпенов соединений, идентифицировано 26 терпеноидов [3, С. 255].

Анализ работ по изучению состава эфирного масла шалфея показал, что в семенном потомстве шалфея наблюдалась значительная изменчивость по составу эфирного масла. Основная часть растений (75%) синтезировала туйон, камфару, цинеол, борнеол, пинен, камфен, мирцен и в незначительных количествах другие компоненты. Эта группа растений синтезировала, в основном, α - и β - туйон (50%), цинеол (до 8%), камфору (до 15%), борнеол (до 5%) [2, С. 203].

Сравнительное изучение биосинтеза терпеноидов у растений Salvia показало, что по мере старения (8- и и 10 — и летние растения) происходит снижение биосинтеза 1,8 — цинеола, α - туйона, α - пинена, борнеола [9, С. 274].

Доминирующими компонентами эфирного масла являются туйона (42%), цинеол (21,6%), борнеол (11,4%), камфора (10,6%). Таким образом, биосинтез камфоры, β - туйона и особенно сесквитерпенив по мере увеличения возраста растения (8-й год жизни) имеют тенденцию к увеличению. Оптимальными по качественному составу эфирного масла является 4-летние растения.

Анализ работ по изучению компонентного состава эфирного масла шалфея в вегетативных и генеративных органах показал, что все органы шалфея содержат эфирное масло. Наибольшая ее количество содержится в листьях, несколько меньше в соцветиях, еще меньше в стеблях и минимальная в корнях растений. Доминантным компонентом является α - и β - туйона, массовая доля которых составила 36,0%, далее идет 1,8 — цинеол (до 21,6%) [11, С.244].

Состав эфирного масла из стеблей шалфея немного отличался от состава масла надземной массы. Основной компонент — α - туйон, массовая доля которого составляет около 32%, β - туйон — 18%. Камфора и 1,8 — цинеол — 7,51% и 5,25% соответственно. Сумма сесквитерпеновые составляет 25%. Следует отметить, что в стеблях находится низкое содержание углеводородов — α - пинен, камфен, β - οинен и мирцен, спирт борнеол составил 3,31%.

Таким образом, в ходе научно-теоретичного анализа источников по исследованию эфирного масла шалфея установлено, что растение содержит масло во всех органах растения (корень, стебель, листья и соцветия). Анализ химического состава показал, что эфирное масло шалфея содержит в своем составе углеводороды, спирты, кетоны, сложные эфиры борнилацетат. Изучение результатов газожидкостных хроматографий доказывает, что в состав эфирного масла входит 28 терпеновых соединений. Кроме этого, в составе эфирного масла также определяются цинеол, туйон, пинен, камфен, борнеол, камфора.

Так, сравнительный анализ результатов исследований эфирного масла позволил обнаружить разницу в количественных показателях соединений в различных органах растений.

3. Работы с шалфеем ин витро, которые проводились ранее Разработка клеточных технологий является важной частью современной селекции, поскольку способствует повышению эффективности и ускорению селекционного процесса. Биотехнологические методы позволяют создавать уникальные генотипы, которые часто невозможно получить, используя традиционные методы, быстро размножать ценные образцы, а также получать оздоровленный посадочный материал, создавать коллекции in vitro.

Анализ исследований шалфея in vitro показал, что за последние годы получено теоретических и практических результатов, разработаны более пятидесяти новых методик, авторами получены патенты на изобретения [1, С. 42].

Основными направлениями исследований in vitro являются:

— изучение биологии культивируемых клеток и тканей in vitro, в том числе особенностей индукции каллусогенеза, органогенеза и соматического эмбриогенеза, а также закономерностей изменчивости популяций соматических клеток в изолированной культуре;

— получение новых генотипов на основе сомаклональной вариабельности и мутагенеза in vitro связано с разработкой методов индукции морфогенеза и регенерации растений в каллусных культурах. Получено более 1000 регенерантов из каллусов разных пассажей лаванды, шалфея, кориандра, фенхеля, аниса, тысячелистника, герани, полыни, среди которых выявлена изменчивость по морфологии, числу хромосом и хозяйственно ценным признакам. Выделены и включены в селекцию перспективные формы, превышающие исходные сорта на 20−60% по урожайности и содержанию эфирного масла;

— клеточная селекция in vitro на устойчивость к абиотическим стрессовым факторам среды позволяет проводить отбор устойчивых генотипов с использованием каллусов и изолированных зародышей. Для шалфея разработаны селективные системы, позволяющие отбирать формы, устойчивые к низким температурам, солевому и осмотическому стрессу; получены устойчивые клеточные линии и регенеранты;

— клональное размножение в культуре изолированных меристем — важнейшее прикладное направление работы. Разработаны способы микроразмножения in vitro для шалфея (с коэффициентом размножения 1:9 — 1:68 за цикл), которые позволяют ускоренно размножать ценные генотипы, быстро внедрять в производство новые сорта и получать качественный посадочный материал. Проводятся исследования по разработке методов создания коллекций ценных генотипов in vitro на основе длительного хранения меристем и микрочеренков при низкой положительной температуре;

— культура гибридных зародышей позволяет преодолеть несовместимость при отдаленной гибридизации и получить потомство от ранее не удававшихся скрещиваний. Получено более 700 гибридов шалфея по 50 комбинациям скрещивания. Среди межвидовых (Salvia sclarea х S. scabiosifolia, S. grandiflora, S. aethiopis) и межсортовых гибридов шалфея выделены образцы, превышающие исходные сорта в 1,3−1,7 раз по сбору эфирного масла и содержанию склареола;

— исследование клеточных культур in vitro как источников продуктов вторичного метаболизма (эфирного масла, пигментов, фенольных соединений) у шалфея — позволяет использовать их в качестве модельных систем для изучения закономерностей биосинтеза этих веществ, а также для разработки альтернативных биотехнологий их получения in vitro [4, С. 85; 6, С. 36; 12, С. 95].

Анализ литературных источников показал, клональные размножения шалфея ранее не проводились.

Для введения в стерильную пробирочную культуру in vitro исследователи ботанического сада имени Б.М. Козо-Полянского Воронежского госуниверситета использовали осенние побеги растений. В качестве первичного экспланта был выбран стеблевой сегмент, содержащий пазушные почки, из которых после введения происходило развитие побегов.

Стерилизацию побегов проводили по такой схеме: побег вводимого растения аккуратно мыли под проточной водой мягкой губкой с ПАВ содержащим моющим средством. Затем обрезали листья на половину длины черешка и нарезали побег на сегменты, удобные для дальнейшей отмывки [1, С. 44].

Полученные участки стебля с междоузлиями помещали в стеклянную емкость, заливали водопроводной водой, добавляли каплю ПАВ содержащего моющего средства, накрывали марлей и качали на качалке 10 минут. После этого материал ставили под проточную воду, не снимая марли, на 20 минут. По истечении этого времени в емкость с побегами заливали дистиллированную воду и снова качали 10 минут. Следующие этапы проводили в стерильных условиях: материал подвергали обеззараживанию в стерилизующих растворах, после чего троекратно по 5 минут отмывали в стерильной дистиллированной воде на качалке.

Для обеззараживания первичных эксплантов поверхностную стерилизацию проводили тремя способами. В первом случае материал помещали на 25 минут в раствор гипохлорита натрия и стерильной дистиллированной воды в соотношении 1:3 соответственно.

Второй способ отличается тем, что в растворе гипохлорита натрия той же концентрации, что и в предыдущем варианте, экспланты находились 20 минут, после чего их погружали в 70%-й спирт на 10 секунд. В третьем случае использовали 4% раствор гипохлорита натрия, содержащий 0,04%-й мертиолята и стерилизовали 20 минут.

После поверхностной стерилизации все экспланты помещали в пенициллиновые пузырьки на полную по макросолям среду Мурасиге и Скуга [22, С. 473] с добавлением 1 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП).

Для мультипликации образовавшиеся из пазушных почек регенеранты в ламинаре отделяли от первичного экспланта и помещали на половинную по макросолевому составу среду WPM с добавлением 0,2 мг/л 6-БАП и 0,1 мг/л гиббереловой кислоты (ГА3).

В некоторых случаях от эндогенной инфекции, проявившейся после отделения регенерантов от первичных эксплантов, удавалось избавиться обработкой их раствором бензилпенициллина натриевой соли (1 000 000 ед./500 мл воды: содержимое одного пузырька антибиотика в 500 мл стерильной дистиллированной воды) в течение 15 минут.

В культуру in vitro шалфей вводили осенними побегами, срезанными с растений, культивируемых в условиях открытого грунта в ботаническом саду Воронежского государственного университета.

Исходный материал для введения в стерильную культуру in vitro отличался высоким уровнем внешней и внутренней естественной инфекции. Возможно, это связано с тем, что растения были срезаны в осенний период. Поэтому были опробованы три способа стерилизации. Наблюдения показали, что стерилизующий раствор с 4%-м гипохлоритом натрия и мертиолятом малоэффективен, так как все вводимые побеги в довольно короткий срок (5−6 суток) пропали от развития внутренней бактериальной инфекции. Экспланты, введенные с использованием метода стерилизации гипохлорит натрия со спиртом, выглядели лучше всего, но в базальной части также была инфекция. Метод стерилизации с использованием только гипохлорита натрия в большой концентрации дольше всего не давал проявляться колониям бактерий, что позволило получить регенеранты из пазух листьев и отделить их от первичных эксплантов [1, С. 42].

Таким образом, типом первичного экспланта был выбран стеблевой сегмент, содержащий почку и около сантиметра стебля вверх и вниз от почки. Вводимые экспланты помещали в вертикальном положении на полную по солевому составу среду WPM с добавлением 1 мг/л 6-БАП. На этой среде из пазушных почек быстро начинали развиваться побеги — регенеранты, поэтому она оптимальна для развития уже имеющихся меристем.

Авторы отмечают, что длительное культивирование растений становится обводненным и растения могут потерять способность к размножению и корнеобразованию, а впоследствии погибнуть.

В результате от пятнадцати первичных эксплантов было получено всего три регенеранта, вследствие чего оказалось актуально увеличение их количества с помощью микрочеренкования.

Отделенные побеги помещали в пенициллиновые пузырьки со средой WPM половинной по макросолевому составу (½ WPM) с добавлением 0,2 мг/л 6-БАП и 0,1 мг/л ГА3, поскольку она подходит для мультипликации и вытягивания образующихся адвентивных побегов. Для избавления их от эндогенной инфекции, проявившейся после отделения регенерантов, качали на качалке в растворе бензилпенициллина и пересаживали на свежую среду того же состава.

Депонирование in vitro проводили с периодическими пересадками на свежую среду, чтобы избежать высыхания и изменения состава среды вследствие жизнедеятельности растений [21, С.421].

Нами проанализированы работы по корнеобразованию in vitro. Авторы Вепринцев В. Н., Карпеченко Н. А. в исследованиях показали, что регулярная пересадка эксплантов в свежую среду, способствует образованию корней в базальной части либо из небольшого каллуса, либо непосредственно на месте среза. Укоренение in vitro происходит не ранее, чем через месяц поддержания стерильной культуры [15, С. 143].

Таким образом, получение укорененных in vitro растений шалфея позволяет проводить дальнейшие исследования в природных условиях. Сначала они должны пройти период адаптации к почвенным условиям в закрытом грунте, после чего смогут расти в открытом грунте.

К преимуществам данного способа размножения авторы относят возможность размножения растений шалфея круглый год, поддержание и сохранение в виде растущей культуры в трудные периоды, простоту передачи и обмена растениями между лабораториями и конечными получателями продукции, возможность быстрого и масштабного тиражирования культур, получение чистого безвирусного исходного растительного материала для дальнейших интродукционных работ.

Как видим, исследования в области шалфея позволили разработать метод микроклонального размножения шалфея. В ходе исследований учеными был подобран оптимальный режим стерилизации, солевой и гормональный состав питательных сред для депонирования, мультипликации и корнеобразования эксплантов шалфея. Полученные укоренившиеся в культуре in vitro растения, пригодные для адаптации к природным условиям.