Фармацевтический анализ аминокислот

Сканирование пятен осуществляли на денситометре при длине волны 500 нм [1]. Метод ТСХ также используют для анализа связанных α-АК, входящих в состав белков и пептидов. В этом случае проводят предварительный гидролиз образца с использованием кислоты хлороводородной. Так, разработана методика количественного определения лизина и оксилизина в сыворотке крови методом ТСХ с использованием системы № 12 (таблица 4). Следует отметить, что используемая система растворителей строго специфична для лизина и оксилизина и не позволяет разделить другие АК. Для количественного определения АК после их разделения в тонком слое сорбента применяют метод элюирования в сочетании со спектрофотометрическим или фотоколориметрическим определением [1]. Так, в соответствии с ГОСТом [3] метод ТСХ в фиксированном слое ионообменника заключается в расщеплении пептидных связей белка соляной кислотой или щелочью при нагревании и избирательной сорбции АК в тонком слое ионообменника. При реакции с нингидриновым реактивом образуется окрашенный комплекс, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию АК в растворе [3]. Известен способ разделения 15 основных АК из 20 основных АК биологических жидкостей с помощью двумерной ТСХ на силикагеле фирмы Whatman (США) с последовательным использованием двух систем растворителей: нбутанол — уксусная кислота — вода (4:1:5) и фенол — вода (15:1).

Этот способ разделения АК является наиболее эффективным из известных аналогов, но длительным по времени (>7 ч).Еще один способ описан в [3]. Разделение АК проводится одновременно на двух пластинах, помещенных в две камеры, в одной из которых для разделения АК с коэффициентом подвижности менее 0,3 используют систему растворителей при соотношении компонентов по объему пропанол — водный раствор аммиака (2442,5%) — вода (3,34,1):(0,91,5):(7,59,0), а в другой для разделения АК с коэффициентом подвижности 0,31,0 используют систему растворителей при соотношении компонентов по объему хлороформ — этанол — уксусная кислота — вода (52,554,0):(26,027,5):(8,99,6):(3,54,2).Разработана методика качественного и количественного определения 14 несвязанных аминокислот в моче человека в условиях восходящей двумерной ТСХ на пластинках «Армсорб» (таблица 8). Установлено, что наилучшее разделение и наибольшие различия в подвижности различных по строению и свойствам АК получены при использовании следующих смесей растворителей: в первом направлении смесь гептан — дихлорэтан — уксусная кислота (20:30:30); во втором (перпендикулярном) направлении смесь бутанол — уксусная кислота — вода (80:20:20) [3]. Таблица 5Коэффициенты подвижности Rf АК, полученные в условиях восходящей двумерной ТСХ на пластинках «Армсорб» [3]АКRfАКRfМетионин0,14Аргинин0,12Гистидин0,18Триптофан0,50Глутамин0,17Глутамин0,33Аланин0,30Глицин0,37Орнитин0,71Лейцин0,63Изолейцин0,55Валин0,48Таурин0,28Аспарагин0,22Разработанный способ определения ацилированных жирными кислотами АК, заключающийся в двукратномхроматографировании в системе гексан — диэтиловый эфир [(1,52):1], а затем в системе гексан — диэтиловый эфир — ацетон (1:1:0,6), с последующим обнаружением зон в УФ-свете [3]. Метод ТСХ характеризуется высокой точностью определения, не требует использования дорогостоящего оборудования. Однако применение данного метода ограничено длительностью проведения анализа (в течение нескольких суток). Кроме того, продукт реакции АК с нингидрином нестабилен во времени.

Поэтому при количественном определении АК методом ТСХ, основанным на фотоколориметрии продукта реакции, следует учитывать временной фактор. В настоящее время метод ТСХ используют для предварительного анализа, более полные сведения о компонентном составе АК в исследуемых объектах получают при использовании ГЖХ, ВЭЖХ, АКА. Бумажная хроматография (БХ). Одним из наиболее доступных методов качественного и количественного анализа АК является хроматография на бумаге. В методе применяют те же системы проявителей, что и для ТСХ. Значения Rfразличных АК при использовании бумаги F4 в системе БУВ 4:1:2 представлены в таблице 6/Таблица 6Значения Rfразличных АК при использовании бумаги F4 в системе БУВ 4:1:2 [3]АКRfАКRfТреонин0,18Аргинин0,04Валин0,43Аспарагиновая кислота0,16Метионин0,39Глутаминовая кислота0,17Изолейцин0,72Серин0,15Лейцин0,64Пролин0,24Фенилаланин0,32Глицин0,21Гистидин0,10Аланин0,20Лизин0,05Тирозин0,57 В литературе описаны примеры использования оксолина в качестве цветного реагента для анализа АК методом БХ. По сравнению с нингидрином он в десять раз менее токсичен.

Появление краснофиолетового окрашивания пятен АК на хроматограммах после проявления раствором оксолина с последующим нагреванием обусловлено образованием нингидринаinsitu [1]. В работе [1] приведена методика количественного определения веществ после хроматографического разделения денситометрическим способом непосредственно на хроматограмме либо после элюирования, с последующим измерением оптической плотности продуктов реакции на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром. Данный метод является доступным, не требует использования специального оборудования. Однако его главными недостатками являются длительность анализа и большая погрешность определения. В настоящее время БХ применяется чаще всего как двумерная хроматография.

Для хроматографирования в первом направлении главным образом применяют систему нбутанол — ледяная уксусная кислота — вода (4:1:5); во втором направлении работают с несколькими системами: этанол — вода (95:5), бензиловый спирт — вода (70:30), пиридин — амиловый спирт — вода (35:35:30).Перечислим основные области применения хроматографии в анализах и исследованиях лекарственных препаратов (фармацевтике), а также при определении лекарственных препаратов в биологических жидкостях (фармакологии):—фармакопейный контроль качества лекарственныхпрепаратов;—мониторинг примесей в лекарственных препаратах; —исследование стабильности лекарственных препаратов;—анализ экстрактов лекарственных трав;—анализ лекарственных препаратов из растений традиционной китайской медицины;—использование метода ЖХ-МС в разработке новых лекарственных препаратов;—применение сверхкритической флюидной хроматографии для разделения энантиомеров лекарственных препаратов;—использование ВЭЖХ для разделения энантиомеров лекарств;—применение ВЭЖХ в фармацевтической промышленности;—определение природных фенольных соединений в растениях (флавоноидов, гидроксикислот, природных красителей и др.);—анализ лекарственных препаратов при допинг-контроле.Основной метод анализа лекарственных препаратов на фармацевтических фабриках — ВЭЖХ. Ионная хроматография широко применяется для определения ионов в лекарственных препаратах, анионов и катионов в особо чистой воде и воде для инъекций. Методом ионной хроматографии с импульсным амперометрическим детектором можно определять моно-, ди-, трии полисахариды, спирты и свободные аминокислоты (без предварительной дериватизации). Газовая хроматография применяется для анализа остаточных растворителей, которые могут присутствовать в фармацевтических продуктах. Рассмотрим основные направления развития хроматографии. Повышение селективности разделения за счет создания новых сорбентов. В ГХ — это синтез новых жидких фаз с двумя или тремя функциональными группами, разработка адсорбционных капиллярных колонок типа PoraPlot разной химической природы, применение геометрического фактора для повышения селективности. В ВЭЖХ — синтез сорбентов с обращенными фазами, содержащих в алкильной цепи полярные группы, а также сорбентов с порами молекулярных размеров для удерживания одного типа молекул или близких групп молекул; применение углеродных адсорбентов Нурег-carb на основе пористой графитизированной сажи для повышения селективности разделения изомеров. Повышение эффективности колонок за счет перехода к капиллярным колонкам. В настоящее время более 60% исследований проводят с использованием капиллярных колонок.

Существенно возросла доля микронасадочных, капиллярных и наноколонок в ВЭЖХ. В КЭХ разделение проводят только на капиллярных колонках. (В ГХ, ВЭЖХ и КЭХ используются колонки с эффективностью более миллиона теоретических тарелок.)Разработка новых методов для экспрессного разделения. В ГХ экспрессность разделения достигается за счет снижения емкости колонок, а также за счет больших скоростей изменения температур (до 1800 град-мин-1). В течение одной минуты можно разделить десятки компонентов. В ВЭЖХ экспрессность разделения достигается за счет использования колонок, заполненных тонкодисперсными непористыми частицами (размером 1.0−1.5 мкм), монолитных колонок, колонок с перфузионными сорбентами и турбулентными потоками. Миниатюризация аппаратуры — общая тенденция всех методов хроматографии, особенно значительные достижения имеются в ГХ, ВЭЖХ и ИХ. Разработаны портативные полевые хроматографы, hand-held (карманные) хроматографы, а также хроматографы на чипах. Совершенствование микропроцессорных программ обработки результатов анализа и управления параметрами хроматографов.

Компьютерной обработке результатов хроматографического анализа уделяется много внимания. Постоянно обновляются и совершенствуются системы регистрации, обработки и хранения хроматографической информации. Растет число работ по моделированию хроматографических процессов, в частности по применению нейронных сетей, линейного и нелинейного регрессионного анализа для их моделирования и оптимизации. Постоянно пополняются хроматографические базы данных.

Заключение

.

В работе проведен анализ и систематизация известных в настоящее время методов определения АК в различных объектах. Титриметрические методы (продолжающие оставаться самыми доступными и точными) рекомендованы нормативной документацией и широко используются для количественного определения АК в фармацевтических субстанциях или однокомпонентных ЛП АК. УФ-спектрофотометрия, ИК-спектроскопия, спектроскопия ЯМР (высокоинформативные методы, используемые в основном для анализа АК в субстанциях или монопрепаратах) не могут быть использованы в анализе многокомпонентных смесей АК без предварительного разделения. Кроме того, ЯМР-спектрометры попрежнему остаются труднодоступными для региональных контрольноаналитических лабораторий. Спектрофотометрия в видимой области и фотоэлектроколориметрия, основанные на определении продуктов взаимодействия АК с нингидрином при длинах волн 440−490 и 570 нм, нашедшие наибольшее распространение в анализе свободных АК в сложных комплексных препаратах, относятся к самым подробно описанным в литературе и простым в использовании. Однако они дают представление только о суммарном содержании АК в пересчете на какую-либо АК, без достоверной информации о присутствии индивидуальных АК в объекте. Кроме того, следует отметить, что продукты реакции α-АК с нингидрином характеризуются невысокой стабильностью оптической плотности во времени. Метод поляриметрии дает важную информацию при анализе субстанции АК, но не пригоден для анализа суммы изомеров оптически активных веществ без их предварительного разделения.

Данных по применению этого метода для количественного определения АК в научной литературе не обнаружено. Хроматографические методы используются для одновременного разделения, идентификации и количественного определения АК (методы БХ, ТСХ, ГХ, ВЭЖХ, ионообменной хроматографии). В настоящее время они занимают лидирующие позиции по частоте использования и количеству публикаций. Хроматографический анализ становится все более доступным для повседневного применения на практике. Это связано в первую очередь с тем, что метод ВЭЖХ позволяет не только разделить большинство эссенциальных АК, но и определить оптические изомеры, что является одной из главных задач фармацевтического анализа. Масс-спектрометрический анализ — один из самых точных и информативных методов исследования АК в составе сложных многокомпонентных растительных объектов, позволяющий решить все задачи за одну аналитическую процедуру.

Однако широкое применение данного метода остается все еще невозможным из-за высокой стоимости оборудования, вспомогательных реактивов, трудности в эксплуатации прибора, а следовательно, и значительной себестоимости одного анализа. Все это не позволяет рекомендовать его для включения в нормативную документацию, методики которой должны удовлетворять требованиям рутинного анализа. Ферментативные и изотопные методы характеризуются высокой чувствительностью, однако они также не нашли широкого распространения на практике в связи со сложностью проведения анализа и высокой стоимостью оборудования. Электрохимические методы широко применяются для разделения и количественного определения АК в сложных многокомпонентных объектах в нативном виде или в виде различных производных. Использование метода капиллярного электрофореза является наиболее целесообразным для определения АК в различных объектах, в том числе и фармацевтического назначения. При сравнении данного метода с ВЭЖХ можно выделить следующие преимущества первого: высокая эффективность разделения, недоступная для ВЭЖХ; отсутствие необходимости в хроматографических колонках; минимальный расход дорогостоящих высокочистых органических растворителей и реактивов; экспрессность анализа, а также отсутствие необходимости в предколоночной модификации. Применение метода капиллярного электрофореза пока не нашло в России широкого применения в аминокислотном анализе объектов фармацевтического назначения из-за невозможности разделения и определения всех незаменимых АК за одну процедуру, а также ввиду отсутствия аттестованных методик.

Список литературы

Фармацевтическая химия / под ред. А.Арзамасцева. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. — 640 с. Чупак-Белоусов.

В. Фармацевтическая химия. 3 курс. Книга 1. -.

М.: Бином, 2012. — 336 с. Фармацевтическая химия: учебник для вузов / под ред. Г. В. Раменской.

— М.: Бином, 2015. — 384 с.