Влияние алкогольной интоксикации на активность основных карбоксипептидаз в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла

ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ В. Г. БЕЛИНСКОГО

На правах рукописи

Сметанин Владимир Анатольевич

ВЛИЯНИЕ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ НА АКТИВНОСТЬ ОСНОВНЫХ КАРБОКСИПЕПТИДАЗ В ТКАНЯХ САМОК КРЫС НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ЭСТРАЛЬНОГО ЦИКЛА

03.00.04 — Биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук профессор Генгин М.Т.

ПЕНЗА 2004

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ…5

ВВЕДЕНИЕ

…6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…10

1.1. Биологическая роль нейропептидов и их обмен…10

1.2. Функционирование пептидэргических систем на разных стадиях эстрального цикла……12

1.2.1. Уровень нейропептидов на разных стадиях эстрального цикла…12

1.2.2. Ферменты обмена нейропептидов на разных стадиях эстрального цикла…17

1.3. Этанол и его влияние на пептидэргические системы……21

1.3.1. Влияние этанола на уровень нейропептидов в организме…21

1.3.2. Влияние этанола на активность ферментов обмена нейропептидов……29

1.4. Карбоксипептидаза Н……32

1.5. ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза……35

1.6. Карбоксипептидаза М….……37

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ…………39

2.1. Материалы исследования……39

Методы исследования……40

2.2.1. Метод определения активности карбоксипептидазы Н и карбоксипептидазы М……40

2.2.2. Метод определения активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы……41

2.2.3. Статистическая обработка результатов исследования……42

2.3. Схема эксперимента……43

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ…44

3.1. ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВНОСТИ ОСНОВНЫХ КАРБОКСИПЕПТИДАЗ В ТКАНЯХ САМОК КРЫС НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ЭСТРАЛЬНОГО ЦИКЛА……44

3.1.1. Изучение активности карбоксипептидазы Н в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла…44

а) Распределение активности карбоксипептидазы Н в тканях интактных самок крыс……44

б) Активность карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самок …45

в) Исследование активности карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самок крыс…48

3.1.2. Изучение активности ФМСФ-КП в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла…59

а) Распределение активности ФМСФ-КП в тканях интактных самок крыс…59

б) Активность ФМСФ-КП при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самок …60

в) Исследование активности ФМСФ-КП при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самок крыс…62

3.1.3. Активность карбоксипептидазы М в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла…74

а) Определение активности карбоксипептидазы М у интактных самок крыс…74

б) Активность карбоксипептидазы М при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самок …75

в) Исследование активности карбоксипептидазы М при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самок крыс…76

3.2. ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВНОСТИ ОСНОВНЫХ КАРБОКСИПЕПТИДАЗ В ТКАНЯХ САМЦОВ КРЫС …81

3.2.1. Изучение активности карбоксипептидазы Н в тканях самцов крыс…81

а) Распределение активности карбоксипептидазы Н в тканях интактных самцов крыс……81

б) Активность карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самцов…82

в) Исследование активности карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самцов крыс…84

3.2.2. Изучение активности ФМСФ-КП в тканях самцов крыс……91

а) Распределение активности ФМСФ-КП в тканях интактных самцов крыс……91

б) Активность ФМСФ-КП при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самцов…92

в) Исследование активности ФМСФ-КП при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самцов крыс…94

3.2.3. Активность карбоксипептидазы М в тканях самцов крыс……100

а) Определение активности карбоксипептидазы М у интактных самцов крыс……100

б) Активность карбоксипептидазы М при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самцов…100

в) Исследование активности карбоксипептидазы М при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самцов крыс…101

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ……105

ВЫВОДЫ…133

ЛИТЕРАТУРА

…135

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АКТГ — адренокортикотропный гормон

АПМЯК — аминопропилмеркаптоянтарная кислота АПФ — ангиотензинпревращающий фермент ГГГС — гипоталамо-гипофизарно-гонадная система ГГНГС — гипоталамо-гипофизарно-надпочечниково-гонадная система ГГНС — гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система ГРФ — гонадотропин-рилизинг-фактор ГПЯК — гуанидинопропилянтарная кислота ГЭМЯК — гуанидиноэтилмеркаптоянтарная кислота ДСИП — дельта-сон-индуцирующий пептид КПА — карбоксипептидаза, А КПВ — карбоксипептидаза В КПН — карбоксипептидаза Н КПM — карбоксипептидаза M

КПN — карбоксипептидаза N

ЛГ — лютеинизирующий гормон ЛКПА — лизосомальная карбоксипептидаза, А ЛКПВ — лизосомальная карбоксипептидаза В ПОМК — проопиомеланокортин ПХМБ — п-хлормеркурийбензоат

ПХМФС — п-хлормеркурийфенилсульфонат ФМСФ — фенилметилсульфонилфторид ФМСФ-КП — фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая

карбоксипептидаза ФСГ — фолликулостимулирующий гормон ЭПР — эндоплазматический ретикулум ЭДТА — этилендиаминтетраацетат натрия

Проблема алкоголизма, особенно женского, является крайне актуальной для человечества, как с социальной, так и с медицинской точки зрения. Клинические наблюдения указывают на то, что под действием этанола в организме женщины возникают существенные изменения в эндокринной системе, что сопровождается нарушениями половой функции [2, 81].

При алкоголизме существенно меняется уровень целого ряда нейропептидов, многие из которых играют существенную роль в этиологии и патогенезе данного заболевания [19, 61, 74, 88]. Изменение уровня биологически активных пептидов при алкогольной интоксикации во многом определяется ферментами их обмена, к которым, в частности, относятся карбоксипептидаза Н, фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая кар-боксипептидаза и карбоксипептидаза М — основные карбоксипептидазы, катализирующие отщепление остатков аргинина и лизина с С-конца пептидов [28, 41, 144, 212].

Интерес к этим ферментам вызван тем, что они участвуют в процессинге, модуляции и инактивации биологически активных пептидов [28, 41, 144]. В связи с тем, что нейропептиды выполняют функции нейромедиаторов, нейромодуляторов и гормонов, они участвуют в регуляции практически всех функций организма, в том числе и в регуляции функционирования полового цикла [11, 72], а также вовлекаются в развитие многих патологических состояний, среди которых для современной биологии и медицины особую значимость представляет алкоголизм [19, 74, 88]. Прогресс в изучении природы этого заболевания неотделим от понимания нейробиологических процессов, лежащих в его основе. В этой связи представляется очень важным исследование активности основных карбоксипептидаз при острой алкогольной интоксикации. Чем глубже будут наши представления об энзимопатологии, о роли протеолитических ферментов в гомеостазе, тем более целенаправленным будет поиск лекарственных средств для лечения алкоголизма среди регуляторов активности ферментов.

Одним из важных аспектов проблемы алкоголизма является исследование нарушений, происходящих в организме женских особей при алкогольной интоксикации. Однако при этом необходим учет особенностей женского организма, связанных с наличием полового цикла, который сопровождается комплексом физиологических, биохимических и других изменений, происходящих во всем организме. В ходе эстрального цикла наблюдаются значительные изменения в функционировании пептидэргических систем [11], что, несомненно, связано с изменением активности ферментов участвующих в обмене биологически активных пептидов [28, 41] и в свою очередь, вероятно, определяет особенности ответной реакции женского организма на острую алкогольную интоксикацию на разных стадиях эстрального цикла [101, 164].

Кроме того, известно, что некоторые аспекты проявления острой алкогольной интоксикации определяются в значительной степени полом. Предполагают, что это связано с различиями в гормональном статусе самцов и самок. Различный уровень нейропептидов, определяемый активностью ферментов их обмена, у особей разного пола приводит к появлению отличий в количестве потребляемого этанола, в скорости развития зависимости, а также появлению различий в течение алкогольной интоксикации у особей противоположного пола [5, 19, 64, 65].

Изучение активности карбоксипептидазо-В-подобных ферментов при острой алкогольной интоксикации может способствовать уточнению биологической роли этих ферментов, а также выяснению механизмов функционирования пептидэргических систем при данном патологическом состоянии.

Целью нашей работы было изучение активности основных карбоксипептидаз (карбоксипептидазы Н, фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы и карбоксипептидазы М) в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла при острой алкогольной интоксикации.

При выполнении работы были поставлены следующие задачи:

Изучить активность исследуемых карбоксипептидаз на разных стадиях эстрального цикла в тканях интактных самок крыс.

Исследовать активность карбоксипептидазы Н, фенилметил-сульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы и карбокси-пептидазы М у самок крыс на разных стадиях эстрального цикла при введении этанола через различные промежутки времени.

Сравнить активность исследуемых ферментов у самцов и самок при острой алкогольной интоксикации.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые изучено влияние острой алкогольной интоксикации на активность карбоксипептидазы Н, фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы и карбоксипептидазы Н в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла. Для определения половых отличий в течении и развитии алкогольной интоксикации исследована активность этих ферментов в тканях самцов крыс. Установлена зависимость изменения активности исследуемых ферментов от стадии эстрального цикла, пола, дозы этанола и времени после его введения. Полученные результаты представляют интерес для понимания механизмов функционирования пептидэргических систем и проясняют роль основных карбоксипептидаз в норме, а также при алкогольной интоксикации и могут быть использованы для разработки эффективных методов профилактики и лечения алкоголизма, нарушений полового цикла и бесплодия.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научных конференциях Российской Академии Естествознания (Россия, Дагомыс, октябрь 2003 г. и Египет, Хургада, февраль 2004 г.) и на итоговых научных конференциях ПГПУ (2002, 2003 гг.). По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из 6 разделов: введение, обзор литературы по теме диссертации, материалы и методы исследований, результаты, обсуждение, выводы. Работа изложена на 162 страницах, иллюстрирована 6 рисунками, 21 таблицей и 2 схемами.

Список литературы

содержит 268 наименований на русском и иностранных языках.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биологическая роль нейропептидов и их обмен.

Важное место в химической передаче информации занимают нейропептиды. Многие из нейропептидов выполняют функции нейромедиаторов, нейромодуляторов, гормонов, факторов роста [9, 51, 77, 139, 164].

Вероятно, именно биологически активным пептидам принадлежит важная роль в интеграции функциональных систем организма, обеспечении их слаженной работы в изменяющихся условиях окружающей среды. Они играют ключевую роль в регуляции полового цикла, деятельности иммунной системы, в морфогенезе, участвуют в формировании поведенческих реакций, в процессах обучения, механизмах консолидации памяти, влияют на половую дифференциацию [8, 11, 60, 70, 72, 210], вовлекаются в развитие и патогенез многих психических и неврологических расстройств, в том числе и алкоголизма. Так, например, у особей исходно склонных к развитию алкоголизма, выявлен центральный (тотальный или региональный) дефицит нейропептидов, функция которых связана с активацией системы положительного подкрепления (с эйфоризирующим, антистрессорным, анксиолитическим действием). Одновременно отмечается увеличение содержания нейропептидов, активирующих систему негативного подкрепления (проконвульсанты, пептиды, индуцирующие страх, агрессию, дисфорию). Как правило, однократное введение этанола, особенно в низких, анксиолитических дозах, нивелирует эти диспропорции, с чем, очевидно, и связано развитие влечения к этанолу, особенно у предрасположенных к алкоголизму индивидуумов[15, 19, 62, 80].

По современным представлениям функционирование конкретного регуляторного пептида связывается с местом его образования, высвобождения и наличия соответствующих рецепторов [52, 53, 54, 69]. Таким образом, для понимания механизмов действия нейропептидов существенным моментом является изучение их образования и деградации.

Большинство биологически активных пептидов синтезируется в составе высокомолекулярных неактивных предшественников — препробелков, которые подвергаются посттрансляционной модификации различного типа [75, 114, 181, 256]. Секретируемые белково-пептидные продукты синтезируются на мембраносвязанных рибосомах ЭПР [156, 256]. Благодаря наличию на N-конце препроформы нейропептида набора гидрофобных аминокислот, так называемой сигнальной последовательности, предшественник транслоцируется через мембрану ЭПР. Внутри ЭПР сигнальная последовательность отщепляется от полипептидной цепи сигнальной пептидазой. Далее процессинг осуществляется в ходе передвижения молекул пропептидов по гранулярному ЭПР, комплексу Гольджи и в секреторных везикулах [29, 256].

Сначала под действием эндопептидаз, расщепляющих нейропептиды по синглетным и дуплетным остаткам основных аминокислот, (фурин, РС1/3, РС2, РС4 [242], проопиомеланокортин-превращающий фермент [193, 194], тиоловая прогормонконвертаза [96, 97], динорфин-превращающий фермент и др.) образуются неактивные пептиды [1, 29, 72], содержащие, как правило, «лишние» Nили, в основном, С-концевые остатки аминокислот. Удаление этих аминокислот в секреторных везикулах осуществляется соответственно аминопептидазо-В-подобным (и) [41, 156] и карбоксипептидазо-В-подобным (и) ферментами [27, 29, 41, 144, 145].

Таким образом, уровень биологически активных пептидов в организме в значительной степени определяется активностью ферментов их обмена.

Основным карбоксипептидазам как ферментам, участвующим в конечных стадиях образования и начальных стадиях деградации, принадлежит важная роль в регуляции уровня нейропептидов в организме. В связи с этим, большой интерес представляет изучение активности основных карбоксипептидаз в норме и при различных физиологических и патологических состояниях организма, сопровождающихся изменением содержания биологически активных пептидов.

1.2. Функционирование пептидэргических систем на разных стадиях эстрального цикла

1.2.1. Уровень нейропептидов на разных стадиях эстрального цикла

Большой интерес представляет изучение гормонального статуса организма в разных физиологических состояниях, в том числе в ходе эстрального цикла. В регуляции полового цикла ключевую роль играют пептидные гормоны гипофиза и гипоталамуса: ГРФ, ЛГ, ФСГ, пролактин [57, 58, 57, 82, 84, 265], а также многие нейропептиды, основные функции которых не связаны с половой системой: энкефалины [182], эндорфины, АКТГ [264], вещество Р и др. Установлено, что уровень многих нейропептидов изменяется в зависимости от стадии эстрального цикла.

Так у крыс в преоптической области гипоталамуса самая высокая концентрация люлиберина отмечается в диэструсе, самая низкая — в эструсе, в ходе проэструса она имеет промежуточное значение. В медиобазальном гипоталамусе концентрация люлиберина возрастает от диэструса к проэструсу, затем содержание нейропептида уменьшается, происходит овуляция и наступает эструс.

В плазме крови в течение цикла концентрация люлиберина изменяется незначительно. Существенные изменения прослеживаются только в проэструсе, когда концентрация люлиберина увеличивается почти в 1,5 раза. Концентрации ФСГ и ЛГ в крови крыс на стадии диэструса остаются практически постоянными и только в проэструсе концентрации гормонов увеличиваются в несколько раз, а с началом эструса уменьшаются до исходной величины. Сходная динамика изменения содержания в плазме крови ФСГ и ЛГ прослеживается у свиней.

В ходе эстрального цикла меняется уровень не только ГРФ и гонадотропных гормонов, но и содержание других нейропептидов, в том числе опиоидных.

Так в перивентрикулярном и вентромедиальном ядрах гипоталамуса овец происходит существенное сокращение количества образующегося проэнкефалина в фолликулярную стадию и во время преовуляторного выброса ЛГ по сравнению с лютеальной стадией. В антеровентрикулярных и перивентрикулярных ядрах преоптической области гипоталамуса в проэструсе происходит снижение уровня мРНК проэнкефалина относительно диэструса. По другим данным уровень мРНК проэнкефалина в медиобазальном гипоталамусе крыс значительно увеличивался в проэструсе, оставался высоким до первого дня диэструса и возвращался к исходному уровню во второй день диэструса. Эти изменения были специфичны для вентромедиальных и вентролатеральных ядер гипоталамуса, в то время как в дорсомедиальных и аркуатных ядрах гипоталамуса такие изменения не наблюдались.

Уровень мРНК проэнкефалина значительно меняется в течение эстрального цикла в яичниках и матке (в 3−6 раз). Самая высокая концентрация мРНК проэнкефалина в яичниках крысы наблюдалась в эструсе, а в матке — в метаэструсе и диэструсе. В отличие от мРНК проэнкефалина мРНК ПОМК оставалась на одном уровне в ходе эстрального цикла и в яичниках, и в матке.

В нейронах антеровентрикулярного и паравентрикулярного ядер преоптической области самый низкий уровень мРНК продинорфина наблюдается на стадии проэструса.

Уровень иммунореактивного леуморфина в гипоталамусе и аденогипофизе крыс значительно выше в проэструсе, чем в эструсе и метаэструсе. Увеличение концентрации иммунореактивного леуморфина в проэструсе коррелирует с выраженностью полового поведения в течение эстрального цикла. Уровень иммунореактивного леуморфина не изменялся в гиппокампе и нейрогипофизе в ходе эстрального цикла.

Во время эстрального цикла меняется не только уровень экспрессии самих опиоидных пептидов, но и их рецепторов [162, 219]. Так плотность и характер распределения м-рецепторов в медиальной преоптической области гипоталамуса существенно изменялись в ходе эстрального цикла. Высокая концентрация м-рецепторов наблюдалась в центральной части медиальной преоптической области в метаэструсе и диэструсе. Обнаружено также, что в этой части мозга плотность и распределение м-рецепторов зависят как от стадии эстрального цикла, так и от пола животного. Интересно отметить, что для к-рецепторов такой закономерности не обнаружено. Однако в работе указывается на наличие изменений в ходе эстрального цикла и на отсутствие половых различий в распределении и плотности [³Н][D-ала, D-лей-5]-энкефалин-связывающих д-рецепторов в мозге хомяков. Эти данные указывают, на то что, скорее всего эндогенные и экзогенные опиоидные пептиды оказывают свое влияние на репродуктивную функцию через ми к-рецепторы, но не через д-рецепторы.

Результаты многих работ указывают на то, что содержание эндогенных опиоидов и их рецепторов находится под влиянием стероидных половых гормонов [162, 163].

После внутрибрюшинного введения прогестерона овариоэктомированным крысам увеличивалось количество м-опиатных рецепторов в медиальной преоптической области, кроме того возрастало содержание мРНК ПОМК в нейронах, иннервирующих эту часть мозга. В другой работе указывается, что увеличение количества м-рецепторов в медиальной преоптической области гипоталамуса крыс происходит только в случае совместного введения эстрадиола и прогестерона.

У овариоэктомированных мышей уменьшалась плотность м-опиатных рецепторов в вентролатеральной преоптической области. Однако, если у мышей с удаленными яичниками проводилась заместительная терапия половыми стероидными гормонами, то отличий в распределении м-опиатных рецепторов в мозге по сравнению с интактными животными не наблюдалось.

Такое вызванное гормонами изменение плотности м-рецепторов в преоптической области, вероятно, может влиять на физиологические эффекты, вызванные опиоидными пептидами, по отношению к секреции гонадотропинов и репродуктивному поведению самок крыс.

В яичниках крысы и хомяка 17-в-эстрадиол и прогестерон не влияли на уровень мРНК проэнкефалина. Однако прогестерон увеличивал синтез мРНК проэнкефалина в яичнике в 2−3 раза в случае предварительной обработки животных эстрадиолом.

В матке крысы и хомяка эстрадиол не оказывал значительного влияния на транскрипцию мРНК проэнкефалина, но при действии прогестерона уровень транскрипции, а также содержание проэнкефалина увеличивались. Глюкокортикоиды и андрогены оказывали действие, сходное с прогестероном. Интересно, что эстрадиол оказывал различное воздействие на экспрессию мРНК проэнкефалина, стимулированную прогестероном у крыс и хомяков. У крыс эстрадиол подавлял экспрессию мРНК проэнкефалина, а у хомяков два гормона действовали синергично, повысив в 15−16 раз содержание мРНК проэнкефалина.

Эти результаты указывают на существование обратной положительной связи между опиоидными пептидами, которые действуют через м-рецепторы и половыми стероидными гормонами, что представляется важным компонентом в сложных регуляторных процессах, которые управляют воспроизводством [176, 202].

В ходе эстрального цикла меняется уровень не только опиоидных, но и других нейропептидов. Так наиболее высокий уровень окситоцина в плазме крови крыс наблюдается в проэструсе. Содержание этого гормона уменьшалось в паравентрикулярных и супраоптических ядрах в проэструсе и эструсе по сравнению с диэструсом и увеличивалось в нейрогипофизе в проэструсе по отношению к эструсу и диэструсу.

Концентрация брадикинина, а также мРНК в2-рецепторов брадикинина и самих рецепторов в матке свиньи была наибольшей в эструсе. В матке крыс наибольшее количество в2-рецепторов кинина обнаружено в конце проэструса и эструсе.

Обнаружены циклические изменения в концентрации рецепторов ангиотензина II в яичниках: более высокое содержание рецепторов было в эструсе, по сравнению с диэструсом.

Циклические изменения уровня гонадотропных гормонов гипофиза по механизму обратной связи приводит к изменениям уровня половых стероидных гормонов. Так, известно, что уровень эстрогенов увеличивается в фолликулярную стадию цикла, достигая максимума, как правило, к середине проэструса, и к началу эструса уровень эстрадиола приближается к уровню, характерному для диэструса. В начале цикла отмечается сравнительно низкая концентрация прогестерона, однако в середине к началу пика ЛГ наблюдается увеличение концентрации прогестерона в плазме крови, после чего его концентрация снижается, но остается более высокой на стадии эструса по сравнению с диэструсом [12, 17, 45].

В регуляцию эстрального цикла помимо гонадотропных гормонов гипофиза, половых стероидных гормонов, опиодных пептидов вовлекаются и другие нейромедиаторные системы. Так, норадреналинэргические нейроны играют значительную роль в стимуляции секреции ЛГ, вызванной кастрацией или эстрогенным возбуждением циклического центра. Дофамин способен стимулировать высвобождение ЛГ за счет активного влияния на нейроны аркуатной области. Серотонинэргические нейроны могут выступать в роли как тормозящих, так и стимулирующих выделение ЛГ факторов.

Таким образом, в ходе эстрального цикла происходит изменение уровня гонадотропных гормонов, а также нейропептидов, основная функция которых не связана с половой системой. Интересно отметить, что энкефалины, в-эндорфин, вазопрессин и половые стероидные гормоны, уровень которых определяется гонадотропными гормонами, влияют на формирование и поддержание влечения к этанолу, развитие зависимости и толерантности [19, 74, 88]. Поэтому кажется вполне вероятным, что у самок крыс на разных стадиях эстрального цикла могут наблюдаться отличия в развитии и течении алкогольной интоксикации [5], которые отчасти связаны с функциональными особенностями ферментов, принимающих участие в обмене нейропептидов.

1.2.2. Ферменты обмена нейропептидов на разных стадиях эстрального цикла

В ходе эстрального цикла наблюдаются изменения в уровне регуляторных пептидов, эти изменения связаны с перестройками в функционировании ферментных систем, участвующих в их синтезе и деградации [28, 41]. В связи с этим представляется интересным изучение активности ферментов обмена нейропептидов в ходе эстрального цикла в норме и при различных патологических состояниях, в том числе при острой алкогольной интоксикации.

De Gandarias и соавт. обнаружили, что активность растворимой формы тирозинаминопептидазы существенно увеличивается в гипоталамусе крысы в проэструсе по сравнению с другими стадиями. Активность мембраносвязанной формы не изменялась во всех изученных отделах мозга. Однако было обнаружено значительное повышение активности мембраносвязанной пуромицин-нечувствительной активности в гипоталамусе и гипофизе в проэструсе. При исследовании фронтальной, париетальной, окципитальной коры, обонятельных луковиц, таламуса, гипоталамуса, гиппокампа, амигдалы, стриатума и гипофиза было обнаружено, что лизини лейцин-аминопептидазная активность в гипоталамо-гипофизарной системе наиболее высокая в проэструсе; лей-аминопептидазная активность возрастала также и в окципитальной коре. В других исследованных отделах мозга активность фермента не подвергалась изменениям в ходе эстрального цикла [124, 125, 126]. Отмечается, что аргинин-аминопептидазная активность повышалась во всех изученных отделах мозга крысы в проэструсе, относительно диэструса и эструса. Активность аспартатаминопептидазы не изменялась в течение эстрального цикла во всех исследованных отделах мозга [124, 127]. В ходе эстрального цикла наиболее высокий уровень сывороточной окситоциназы у мышей отмечен в диэструсе по сравнению с эструсом и проэструсом.

Инъекция 17-в-эстрадиола приводила к умеренному увеличению активности цистеинариламидазы независимо от стадии цикла и эндогенного уровня гормонов. Самая значительная активация фермента в гипоталамусе в ответ на применение прогестерона происходила в такие периоды цикла, когда содержание эндогенного прогестерона было низким. При введении внутрь желудочков головного мозга ЛГ или простогландина Е₂ во время различных стадий цикла максимальное увеличение активности наблюдалось в диэструсе. По мнению авторов, цистеинариламидаза, вероятно, играет модулирующую роль в регуляции тонической секреции ЛГ в течение эстрального цикла, но, очевидно, не влияет на ациклическую секрецию ЛГ.

Уровень активности пролилэндопептидазы и эндопептидазы-24.15 существенно не изменялся в ходе эстрального цикла, хотя наблюдалась тенденция к снижению пролилэндопептидазной активности во время преовуляторного пика ЛГ. Снижение активности пролилэндопептидазы наблюдалось у овариоэктомированных овец, у которых повышение концентрации ЛГ было вызвано экзогенными эстрогенами по сравнению с контрольной группой овец. Эти данные свидетельствуют о возможном наличии отрицательной обратной связи между активностью пролилэндопептидазы и уровнем эстрадиола. Возможно, что подобная связь существует и между активностью эндопептидазы-24.15 и гонадными стероидными гормонами, так как после овариоэктомии активность фермента в аденогипофизе, медиальных и латеральных преоптических ядрах увеличивалась.

Введение

ингибитора эндопептидазы-24.15 — N-[1(R, S)-карбокси-3-фенилпролил]-ала-ала-тир-п-аминобензоата не влияло на секрецию ЛГ. Кроме того, введение ингибиторов пролилэндопептидазы — бацитрацина или более специфичного — Z-пропролинала также не вызывало изменений в секреции ЛГ.

Обнаружено, что в ГГНС системе мышей экзогенные тестостерон и прогестерон вызывали, в основном, снижение активности КПН и ФМСФ-КП. Изменение активности исследуемых ферментов при введении половых стероидных гормонов зависели от пола животного и времени после инъекции и, практически, не зависели от дозы вводимого гормона. Наиболее существенное изменение активности КПН и ФМСФ-КП при введении тестостерона и прогестерона выявлено в гипофизе и половых железах у животных обоего пола. Минимальное влияние половых стероидных гормонов на активность ферментов обнаружено в гипоталамусе [78, 256].

Пептидгидролазная активность, способная инактивировать ГРФ, в гипоталамусе была понижена в проэструсе и в первый день диэструса по сравнению с другими стадиями эстрального цикла крыс. Уменьшение такой активности в проэструсе по мнению авторов способствует накоплению ГРФ и ЛГ перед преовуляторным пиком этих гормонов. Сниженная пептидазная активность в гипофизе в первый день диэструса возможно уменьшает деградацию синтезирующихся в нем рецепторов ГРФ, которые синтезируются до проэструса.

Общее количество АПФ не изменяется в яичниках крыс в течение эстрального цикла. Растущие и атретические фолликулы характеризуются высоким уровнем АПФ, хотя в преовуляторных фолликулах АПФ либо отсутствует, либо его уровень очень низок. Возможно, что АПФ участвует в ранних стадиях фолликулярного созревания и атрезии. Активность мембраносвязанной формы АПФ в матке крупного рогатого скота значительно выше в диэструсе, чем в эструсе. Активность АПФ в фаллопиевых трубах свиньи была выше в ампулярной части, чем в перешейке независимо от стадии эстрального цикла. В свою очередь, в перешейке фаллопиевых труб наблюдались периодические изменения активности АПФ в ходе цикла: в эструсе и метаэструсе активность была выше, чем в проэструсе. Высокий уровень экспрессии мРНК и высокая активность АПФ обнаружены в конце секреторной фазы в эндометрии матки человека. Предполагается важная роль АПФ в инициации менструации.

Высокая концентрация проренина обнаружена в фолликулах яичника человека в середине менструального цикла. У кошек общее количество ренина в яичниках было самым низким в анэструсе, увеличивалось в эструсе и становилось еще большим в период овуляции. Активность плазматического ренина у крыс была увеличена в эструсе по сравнению с проэструсом и диэструсом. Но такие изменения не наблюдались, если крысы были овариоэктомированы. При совместной обработке эстрадиолом и прогестероном таких крыс содержание проренина изменялось подобно тому, как оно менялось в эстральном цикле у интактных животных.

Экспрессия мРНК пролилолигопептидазы и активность этого фермента в яичниках крыс увеличивается в лютеальную фазу, что позволяет предположить наличие связи олигопептидазы с формированием и/или регрессией желтого тела. КПМ не обнаруживается в гранулярных клетках растущих и незрелых фолликулов, но появляется в больших количествах на поверхности гранулярных клеток, обработанных лютеинизирующим гормоном, и во время овуляции; обнаруживается в клетках жёлтого тела во время менструации и на ранних стадиях беременности.

Таким образом, протеолитическим ферментам, вероятно, принадлежит важная роль в регуляции уровня биологически активных пептидов в организме, а также в различных физиологических процессах, связанных с функцией размножения.

1.3. Этанол и его влияние на пептидэргические системы

1.3.1. Влияние этанола на уровень нейропептидов в организме

Острая и хроническая алкогольная интоксикация приводит к изменению уровня и/или соотношения уровней многих нейропептидов, что можно рассматривать в качестве одного из первичных патогенетических факторов алкоголизма [88, 186].

Изменение эндогенной опиатной системы у экспериментальных животных при однократном и хроническом контакте с этанолом показано в ряде работ. Однако вследствие использования в них неидентичных фармакологических моделей и антисывороток различной специфичности результаты этих исследований не отличаются однородностью. Так K. Blum описал снижение суммарного содержания энкефалинов и позднее лей-энкефалина в базальных ганглиях мозга золотистых хомячков после добровольного потребления этанола в течение года. В то же время другие авторы не выявили каких-либо изменений в уровне мет-энкефалина в гипоталамусе и лей-энкефалина в стриатуме, гипоталамусе и коре мозга после острого и хронического введения этанола [110, 236]. В то же время указывается на значительное повышение уровня мет-энкефалина в стриатуме в результате однократной инъекции этанола в дозе 2,5 г/кг и выраженное снижение содержания этого пептида в стриатуме, в суммарном препарате продолговатого мозга и моста, в среднем мозге после 4-недельного принудительного введения 20% этанола.

Эти данные нашли свое подтверждение в работах Seizinger и соавт., исследовавших региональный уровень б-неоэндорфина, динорфина и мет-энкефалина в мозге крыс после хронического введения этанола в виде компонента жидкой диеты. Такой вид алкоголизации вызывал резкое снижение содержания мет-энкефалина в стриатуме и гипоталамусе, но уровень пептида в среднем мозге и гиппокампе оставался неизменным. Иммунореактивность динорфина и б-неоэндорфина уменьшалась более чем на 50% в гипоталамусе и гиппокампе, но не изменялась в среднем мозге, стриатуме, аденогипофизе и нейроинтермедиальной его доле. Параллельность изменений динорфина и б-неоэндорфина, очевидно, обусловлена наличием у них общего предшественника (проэнкефалина В), в то время как мет-энкефалин является дериватом другого пептида — проэнкефалина, А [72, 166].

Стабильное содержание динорфин/б-неоэндорфина в стриатуме в условиях алкоголизации гарантирует и поддерживает нормальную продукцию лей-энкефалина. Неизменный уровень лей-энкефалина на фоне сниженного содержания мет-энкефалина демонстрирует дезинтегрирующие свойства этанола на центральные энкефалинэргические системы мозга. Вероятно, алкоголизация снижает скорость биогенеза мет-энкефалина и увеличивает интенсивность его ферментативной деградации [19, 165].

Большинство исследователей указывают на отсутствие изменений или незначительное снижение иммунореактивности в-эндорфина в гипофизе крыс после однократной инъекции этанола [241, 243]. Однако Gianoulakis и соавт. отмечают значительное снижение в-эндорфин подобной иммунореактивности в аденогипофизе, но не в нейропромежуточной доле.

Небольшое уменьшение гипофизарного пула в-эндорфина и повышение его в гипоталамусе на 30% после 14 дней потребления 10% раствора этанола в качестве единственного источника жидкости обнаружили Cheng и соавт. 110], а при употреблении крысами 20% раствора уровень в-эндорфина в промежуточной доле гипофиза крыс снижался более чем на 70%. Повышение уровня в-эндорфина в гипоталамусе после однократной инъекции этанола и снижение его при хроническом потреблении позволяет предположить участие гипоталамических эндорфинэргических путей в реализации эмоциогенных эффектов этанола, причем дифференцированность этой реакции может быть расценена как проявление эмоционально позитивных (острое введение) и эмоционально негативных (хроническое введение) свойств этанола.

При однократном введении крысам 20% раствора этанола внутрибрюшинно в дозе 4 г/кг в надпочечниках уже через 15 минут происходило снижение уровня мет-энкефалина, через 1 час после введения этанола величина этого показателя существенно превышала контрольный уровень, а через два часа соответствовала контрольным значениям. В плазме крови животных сразу же после инъекции этанола наблюдалось некоторое повышение концентрации мет-энкефалина, но через 2 часа уровень его был достоверно ниже по сравнению с контролем. Авторы приходят к выводу, что в действии этанола на метаболизм энкефалинов в системе надпочечники — кровь можно выделить 2 фазы: первая характеризуется усиленным высвобождением мет-энкефалина из надпочечников в кровь на фоне неизменной скорости образования пептида, вторая — угнетением высвобождения мет-энкефалина на фоне сначала усиленного, а затем пониженного его образования в ткани надпочечников.

Острая алкогольная интоксикация приводила к значительному повышению [94, 159, 222, 261], а хроническая — к уменьшению уровня плазматического в-эндорфина у крыс [94, 104].

Уровень мРНК ПОМК в гипоталамусе крыс возрастал при хронической алкоголизации и значительно уменьшался в случае острой алкогольной интоксикации.

Хроническая алкоголизация крыс повышает скорость синтеза de novo ПОМК и пептидов, связанных с в-эндорфином, в промежуточной доле и в аденогипофизе. Несмотря на это, отношение в-эндорфина, определяемого при помощи моноклональных антител к суммарному в-эндорфину + в-ЛПГ резко снижено в передней доле.

Считается, что пул биологически активного в-эндорфина уменьшается в обеих долях гипофиза алкоголизированных крыс, но за счет различных механизмов: в аденогипофизе путем замедления энзиматического образования в-эндорфина из предшественника интермедиата в-ЛПГ, а в промежуточной доле — за счет усиления инактивационных преобразований.

Острая алкогольная интоксикация самок овариоэктомированных крыс приводит к значительному уменьшению содержания в-эндорфина и мет-энкефалина в гипоталамусе. К тем же результатам приводит подкожное введение эстрадиола. Совместное введение этанола и эстрадиола способствует снижению уровня мет-энкефалина в гипоталамусе и увеличению уровня этого пептида в среднем мозге и гиппокампе, коре больших полушарий. Уровень в-эндорфина в этих условиях понижался в гипоталамусе и среднем мозге. Приведенные результаты показывают, что эстрадиол может значительно модифицировать ответную реакцию опиоидэргической системы на действие этанола.

В реестре эндокринопатий, вызываемых введением этанола, первое место занимает поражение ГГГС. Однако литературные данные, касающиеся уровня гонадотропных гормонов при алкогольной интоксикации, достаточно противоречивы. Так, отмечено, что единичный прием спирта в дозе 0,5−1,5 г/кг массы тела повышал концентрацию ЛГ в крови мужчин [135, 207], не изменял ее [86, 135] или снижал. Аналогичные результаты получены для женщин [135, 208]. Более детально влияние этанола на ГГГС исследовано на животных. У них обнаружена четкая связь между дозой вводимого этанола и степенью снижения концентрации ЛГ. В ряде опытов после однократной инъекции зафиксировано уменьшение этого показателя практически до неизмеримой величины.

Острая алкогольная интоксикация крыс в проэструсе отменяет преовуляторный пик ЛГ и овуляцию за счет подавления активности ядер гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию ГРФ, что в свою очередь приводит к снижению концентрации ГРФ в проэструсе. Экзогенное введение ГРФ крысам, подвергшихся острой алкогольной интоксикации, вызывало увеличение секреции ЛГ и овуляцию.

Инъекция этанола крысам в дозе 0,5−3 г/кг приводила к значительному снижению плазматического уровня ЛГ, причем у самок эти изменения были выражены сильнее, чем у самцов. В то же время уровень ФСГ у опытных животных достоверно не отличался по сравнению с контрольными.

Самки крыс, у которых секреция ЛГ была стимулирована кастрацией или введением налоксона, этанол вызывает значительное снижение концентрации гормона в плазме крови. Депрессивный эффект этанола по отношению к гонадотропинам у кастрированных крыс снимается введением ГРФ.

Наиболее вероятно, что эффект реализуется в гипоталамусе, так как однократное введение этанола не изменяет ответа на ГРФ у здоровых добровольцев и животных. Нормальный ответ может быть достигнут даже при очень высоких дозах спирта. Все эти данные, а также прямое измерение концентрации ГРФ в портальной крови гипофиза после введения этанола подтверждает тезис о том, что в данной экспериментальной ситуации нарушается функция гипоталамуса. Снижение высвобождения ГРФ при острой алкогольной интоксикации определяется, вероятно, наличием опиодной активности у этанола.

Однако в работе, проведенной на самках макак-резусов, было показано, что при острой алкогольной интоксикации уровень ФСГ в плазме крови не изменяется в ответ на введение синтетического аналога ГРФ. Вероятно, за счет этого этанол нарушает нормальное созревание фолликулов яичника, приводит к неадекватному протеканию послеовуляторной фазы цикла или ановуляции, что часто наблюдается у женщин с алкогольной зависимостью и у животных со смоделированным алкоголизмом.

К изменениям в функционировании ГГГС приводит и хроническая алкогольная интоксикация. Повышенное содержание пролактина отмечено практически у всех больных алкоголизмом и у здоровых мужчин после острого введения этанола [66, 67, 206], сходные данные получены относительно самок крыс.

В сравнении с контрольной группой у мужчин с хронической интоксикацией алкоголем выявлено понижение содержания ФСГ и ЛГ в плазме крови, по другим данным содержание ЛГ достоверно не отличается от контрольной группы.

У самцов крыс после хронической алкогольной интоксикации уровень ФСГ и ЛГ в плазме крови более чем в 2 раза снижался по сравнению с контрольными животными, в то время как в гипофизе уровень этих гормонов был сходен с контролем [238], у самок крыс в этих условиях наблюдалось уменьшение уровня ЛГ, при неизменном уровне ФСГ.

Однократное поступление алкоголя в организм сопровождается повышением активности ГГНС: усиливается образование катехоламинов [88], КРФ [80], в-эндорфина [94, 159, 222, 261], кортикостероидов [80, 230]. Эффект, вероятно, реализуется на самых высоких уровнях регуляции этой оси, так как снимается гипофизэктомией или введением антисыворотки к КРФ и обусловлен в значительной мере специфической мембранотропной активностью этанола [86], что подтверждается экспериментами in vitro. Этанол дозозависимо увеличивал освобождение АКТГ из суперфузируемых аденогипофизов мыши и фрагментов аденогипофизов крысы. При этом отмечено снижение чувствительности рецепторов к КРФ, что можно трактовать как дополнительный стимул к секреции этого фактора in vivo. In vitro этанол влияет и на продукцию КРФ гипоталамусом, причем в концентрациях, соответствующих содержанию этилового спирта в тканях in vivo. Эффективны также дозы на порядок выше [227, 228]. Интересно отметить, что секреция гипофизом АКТГ в ответ на различные дозы этанола была многофазной и включала в себя 3 пика. Так как АКТГ и в-эндорфин выделяются обычно совместно, можно предположить, что в-эндорфин, подобно АКТГ, имеет волнообразную динамику секреции. Вероятно, это может частично объяснить несогласованность результатов различных лабораторий относительно влияния этанола на уровень в-эндорфина.

При острой алкогольной интоксикации, а также на ранних стадиях развития алкоголизма наблюдается увеличение уровня плазматического АКТГ у людей и животных [158, 230]. Причем у самок секретируется больше АКТГ и кортикостероидов, чем у самцов в ответ на одинаковую дозу этанола. Кроме того, ответ ГГНС на алкоголь был меньше у интактых самцов по сравнению и с другими феминизированными группами (гонадэктомированными самцами и самками). У самок крыс при острой алкогольной интоксикации более высокая концентрация АКТГ и кортикостероидов в плазме крови наблюдается в течение проэструса и эструса по сравнению с диэструсом.

Однако длительная гиперфункция ГНС при значительных сроках алкоголизации сменяется у большинства особей снижением содержания АКТГ и кортикостероидов в плазме крови, что связано с истощением ГНС. Так у крыс, с хронической алкогольной интоксикацией, концентрация АКТГ в плазме крови составляла примерно половину от контрольного уровня.

Хроническое потребление этанола животными (в течение 7 недель) снижало уровень нейропептида Y, обладающего анксиолитическими свойствами, в гипоталамусе [136, 137, 173, 252]. Однократное введение этанола в дозе 1г/кг внутрибрюшинно приводило к увеличению содержания ДСИП в стриатуме [22], таламусе [22, 93] и среднем мозге. Увеличение дозы этанола приводило к снижению эффекта. Хроническое введение этанола изменяет как синтез ДСИП в мозге, так и поражает системы, через которые он реализует свое действие синхронизатора биоритмов. Острая алкогольная интоксикация приводит к подъему уровня гастрина и снижению уровня инсулина в крови. В случае хронической алкогольной интоксикации наблюдалось повышение уровня гастрина, нейротензина, вещества Р и снижение уровня инсулина, соматотропного гормона, окситоцина, вазопрессина в плазме крови [3, 4].

Однако не стоит забывать, что алкогольная интоксикация воздействует не только на пептидэргическую систему, но и вызывает дисфункции в других нейромедиаторных системах: дофаминовой, серотониновой, ГАМК-ергической, холинергической и др. 19, 80, 88].

Так большинство исследователей склоняются к мысли о том, что под влиянием однократного введения этанола кругооборот дофамина и серотонина в мозгу ускоряется. Исследования в области прижизненной визуализации мозга показали увеличение концентрации дофамина в мозговой системе «вознаграждения». Ряд авторов считает, что изменения дофаминовой нейромедиации является основным звеном формирования алкогольной зависимости [80, 88].

Алкоголь вызывает повышение активности главной тормозящей системы мозга — ГАМКэргической. Доказано, что этанол влияет на комплекс рецептор ГАМК_А/хлорный канал, вызывая значительное повышение входа Cl^- внутрь клетки. Замечено, что стероидные гормоны способны оказывать модулирующее влияние на функцию ГАМК_А, что может объяснить некоторые половые различия в молекулярных эффектах этанола [80, 88, 120].

Этанол специфически и селективно изменяет синаптическое действие глутамата — основного возбуждающего нейротрансмиттера мозга. Алкоголь в концентрации 0,03% ингибирует поток ионов через NMDA — рецептор в культуре нервных ткани. Этанол вызывает дозозависимое угнетение высвобождения ацетилхолина в различных структурах мозга in vitro и in vivo, а также торможение вхождения ионов Na⁺ в клетку. Холинэргические синапсы коры мозга более устойчивы к действию этанола, чем синапсы подкорковых структур. При посмертном исследовании мозга алкоголиков найден сниженный уровень норадреналина в различных структурах мозга. У животных потребление этанола повышает уровень активности норадренэргических нейронов.

Таким образом, алкоголь модифицирует деятельность всех эндокринных желез, что приводит к качественным и количественным изменениям метаболизма многих нейромедиаторов [8, 19, 62]. Однако стоит отметить, что данные об уровне различных нейромедиаторов весьма противоречивы, что, вероятно, связано с особенностями проведения эксперимента.

1.3.2. Влияние этанола на активность ферментов обмена нейропептидов

Под влиянием этанола отмечаются нарушения в функционировании ферментных систем, в том числе тех, которые участвуют в образовании и инактивации нейропептидов [26, 31, 36]. Последние в свою очередь напрямую или опосредованно могут влиять на предпочтение к этанолу, развитие толерантности, а также вовлекаются в ответную реакцию организма на алкогольную интоксикацию. Поэтому очень важным представляется исследование активности ферментов обмена нейропептидов при алкогольной интоксикации.

Mayas и соавт. изучено влияние этанола на активность аминопептидаз синаптосом головного мозга мышей in vitro. Под действием этилового спирта дозозависимо ингибировалась аланинаминопептидаза; активность аргинин-, цистеин-, лейцин-, тирозинаминопептидазы под действием малых доз этанола увеличивалась, большие дозы оказывали противоположный эффект. Инкубация синаптосом в среде 25 мМ К⁺ в присутствии этанола приводит к ингибированию всех исследованных аминопептидаз.

При хронической алкогольной интоксикации содержание мРНК АПФ и нейтральной эндопептидазы заметно уменьшается в мозге мышей. Имеются данные о том, что активность нейтральной эндопептидазы в сыворотке крови людей коррелирует с количеством потребляемого алкоголя [142], выявлено увеличение активности ренина в плазме крови у лиц в состоянии алкогольного опьянения. Активность катепсина, А и D у людей с острой алкогольной интоксикацией не изменялась по сравнению с контролем, в то время как она увеличивалась в сыворотке у хронических алкоголиков.

Хроническое потребление этанола самцами крыс приводит к снижению активности АПФ в гипофизе, гипоталамусе и стриатуме, что может способствовать повышению уровня опиоидных и стресс-пептидов. Острая алкогольная интоксикация ведет к изменению активности КПN в сыворотке крови крыс, причем эти изменения зависят от дозы вводимого этанола. При остром и хроническом потреблении этанола животными наблюдается достоверное повышение активности энкефалиназы, А в стриатуме, гипоталамусе и среднем мозге. Авторами работы высказывается предположение, что нарушения деградации энкефалинов играют ключевую роль в реализации действия этанола на энкефалинэргическую систему мозга.